【摘要】目的 探討肝癌條達(dá)飲對(duì)H22荷瘤小鼠的抗腫瘤作用及對(duì)B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）蛋白表達(dá)的影響。方法 將50只無特定病原體級(jí)（SPF）雄性小鼠建立H22荷瘤小鼠模型，按隨機(jī)數(shù)字表法分成正常組、模型組及肝癌條達(dá)飲低、中、高劑量組，每組10只。對(duì)比各組小鼠腫瘤體積、平均腫瘤質(zhì)量、抑瘤率，Bax、Caspase-3、Bcl-2 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量；蘇木精 - 伊紅（HE）染色觀察各組小鼠腫瘤組織病理學(xué)變化。結(jié)果 與模型組比，肝癌條達(dá)飲低、中、高劑量組小鼠平均腫瘤體積均更小，平均腫瘤質(zhì)量更低，且高劑量組小鼠平均腫瘤質(zhì)量均顯著低于低、中劑量組（均Plt;0.05）；肝癌條達(dá)飲低、中、高劑量組小鼠抑瘤率均呈升高趨勢(shì)；與模型組比，肝癌條達(dá)飲低、中、高劑量組小鼠Bax、Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量及蛋白相對(duì)表達(dá)量均呈逐漸升高趨勢(shì)，Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量及蛋白相對(duì)表達(dá)量均呈逐漸降低趨勢(shì)，且任意兩組間經(jīng)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均Plt;0.05）。結(jié)論 肝癌條達(dá)飲有較好的抑制腫瘤作用，其機(jī)制可能與上調(diào)Bax、Caspase-3表達(dá)，下調(diào)Bcl-2表達(dá)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】肝癌調(diào)達(dá)飲 ; 荷瘤小鼠 ; 腫瘤體積 ; 平均腫瘤質(zhì)量 ; 抑瘤率

【中圖分類號(hào)】R735.7 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】2096-3718.2023.09.0036.04

DOI：10.3969/j.issn.2096-3718.2023.09.012

以肝細(xì)胞癌為主的原發(fā)性肝癌（hepatocellular carcinoma， HCC）為常見的惡性腫瘤，該病早期不易被發(fā)現(xiàn)，病情進(jìn)展迅速，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)多數(shù)患者都處于中晚期，且病情不穩(wěn)定易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。相關(guān)研究顯示， HCC全球每年新發(fā)病例85.4萬，中國46.6萬，占比達(dá)55%，是國內(nèi)第4位常見惡性腫瘤及第2位腫瘤致死病因，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量及生存率[1]。目前化療藥物在HCC的防治中未見突破，并且肝功能障礙導(dǎo)致藥物代謝異常，放大了化療藥物的不良反應(yīng)，甚至產(chǎn)生耐藥性[2]。 HCC屬于中醫(yī)學(xué)的“積聚”“癥瘕”“黃疸”等范疇，是由于七情內(nèi)傷、飲食勞倦，或邪毒內(nèi)侵等，致臟腑氣血虧虛，脾虛不運(yùn)，氣滯、血瘀、濕熱、痰毒等互結(jié)于肝所致[3]。肝癌條達(dá)飲是江蘇省名中醫(yī)嚴(yán)冰治療肝癌的經(jīng)驗(yàn)方，提出健脾扶正、清熱解毒、活血化瘀、化痰散結(jié)、利水消腫等五種治療大法，即以“健脾扶正，五法統(tǒng)一”為原則自擬的方劑，包括黃芪、蛇莓、夏枯草等中藥，但目前其應(yīng)用于肝癌的相關(guān)研究較少。因此，本研究旨在探討肝癌條達(dá)飲對(duì)H22荷瘤小鼠的抗腫瘤作用及B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3） mRNA及蛋白表達(dá)的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑、主要藥物及儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇健康雄性無特定病原體級(jí)（SPF）小鼠50只，由上海靈暢生物科技有限公司提供，合格證號(hào)：SYXK（蘇）2017-0040。動(dòng)物飼養(yǎng)在SPF級(jí)動(dòng)物房，溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度50%～60%。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后開始實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置需符合《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》 [4]中的要求。

1.1.2 試劑與主要藥物 蘇木素 - 伊紅（HE）染色試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，批號(hào)：KGA224）；TRIzol試劑盒（美國Invitrogen公司，批號(hào)：15596-026）；cDNA第一鏈合成試劑盒（立陶宛Fermentas有限公司，批號(hào)：K1622）；全蛋白抽提試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展生物有限公司，批號(hào)：KGP2100-025H01）；雙辛丁酸（BCA）蛋白含量檢測(cè)試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展生物有限公司，批號(hào)：KGP903-691K32）；電化學(xué)發(fā)光（ECL）檢測(cè)試劑盒（南京先一行生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：P0018-542C）；一抗稀釋液（上海碧云天生物技術(shù)公司，批號(hào)：P0023A）；二抗稀釋液（上海碧云天生物技術(shù)公司，批號(hào)：P0023D）等。肝癌條達(dá)飲由安徽亳州市永剛飲片廠有限公司提供，經(jīng)過淮安市中醫(yī)院藥學(xué)部鑒定為正品，符合2020版《中國藥典》規(guī)定，藥方組成：黃芪、蛇莓、夏枯草、澤漆、半邊蓮、石見穿各30 g，莪術(shù)15 g，白術(shù)、郁金各12 g，炙水蛭10 g，甘草6 g。

1.1.3 主要儀器 全自動(dòng)脫水機(jī)（德國Leica公司，型號(hào)：ASP300S），半自動(dòng)切片機(jī)（德國Leica公司，型號(hào)：RM2255），全自動(dòng)染色機(jī)（德國Leica公司，型號(hào)：TS5015）；奧林巴斯光學(xué)顯微鏡（上海通灝光電科技有限公司，型號(hào)：CX23）；Centrifuge高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司，型號(hào)：5804R）；紫外光度儀（日本SHIMADZU，型號(hào)：UV-2450）；熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)儀（中國中山達(dá)安，型號(hào)：MDA7600）；凝膠成像儀（美國BIO-RAD公司，型號(hào)：Gel Doc XR）；分光光度計(jì)（日本SHIMADZ公司，型號(hào)：UV-2540）；高速冷凍離心機(jī)（美國科俊儀器公司，型號(hào)：SH03014）；Western電泳儀（美國BIO-RAD公司，型號(hào)：164-5051）。

1.2 分組與造模方法 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的H22細(xì)胞，將細(xì)胞懸液（1×107個(gè)/mL）接種于小鼠腹腔（0.2 mL/只），腹水傳代3次。脫頸處死已接種H22瘤種11 d、腹部隆起明顯的第3代腹水瘤小鼠，取腹腔瘤液（無明顯血性，呈乳白色），生理鹽水稀釋，800 r/min離心5 min，棄上清得腫瘤細(xì)胞，生理鹽水制備細(xì)胞懸液（1.0×107個(gè)/mL），接種于小鼠右腋皮下（0.2 mL/只），第4天后摸到小鼠腋下約綠豆大小的硬塊則為造模成功。造模完成后，將小鼠隨機(jī)分成正常組、模型組及肝癌條達(dá)飲低、中、高劑量組，各10只，肝癌條達(dá)飲低、中、高劑量組小鼠分別予以16、32、64 g/kg體質(zhì)量肝癌條達(dá)飲灌胃，1次/d，正常組和模型組則每天給予同等體積的生理鹽水灌胃，各組均連續(xù)干預(yù)15 d。

1.3 觀察指標(biāo) ①各組小鼠腫瘤生長(zhǎng)指標(biāo)。小鼠采血后，頸椎脫臼處死，剝離腫瘤，分析天平稱重，計(jì)算各組小鼠腫瘤體積與抑瘤率。抑瘤率（%） = （模型組平均瘤重 － 給藥組平均瘤重） / 模型組平均瘤重×100%。②各組小鼠腫瘤組織病理變化。建模完成，每組隨機(jī)取1只小鼠，經(jīng)二氧化碳處死，進(jìn)行腫瘤組織病理切片，10%中性福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，4 μm切片，HE染色觀察腫瘤組織病理學(xué)變化。③熒光定量PCR法及蛋白免疫印跡法（WB）法分別監(jiān)測(cè)小鼠肝臟組織Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA及蛋白的表達(dá)；取小鼠肝臟通過Rrizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，定量PCR，反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃、5 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，40個(gè)循環(huán)，PCR儀采集熒光信號(hào)，計(jì)算2-ΔΔCt值表示mRNA的相對(duì)表達(dá)含量。放射免疫沉淀試驗(yàn)（RIPA）裂解法提取肝臟總蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度，SDA-PAGE凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯（PVDF）膜后，封閉1 h（5%脫脂奶粉），一抗稀釋1 000倍，β-actin抗體稀釋4 000倍，4 ℃搖床搖蕩孵育過夜，聚丁二酸對(duì)苯二甲酸丁二醇共聚酯（PBST）漂洗濾膜4次，5 min/次；將二抗稀釋5 000倍，室溫下?lián)u蕩孵育1～2 h，然后用PBST充分洗膜，漂洗5次，5 min/次，然后進(jìn)行曝光，直至出現(xiàn)最佳條帶。規(guī)定以模型組數(shù)值為參照，以模型組的表達(dá)量為1，其他組的蛋白表達(dá)量除以模型組蛋白表達(dá)量，計(jì)算下面3個(gè)劑量組的數(shù)值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 通過SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料經(jīng)S-W法檢驗(yàn)均符合正態(tài)分布且方差齊，以（ x ±s）表示，行t檢驗(yàn)，多組間比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析；計(jì)數(shù)資料以[例（%）]表示，行χ2檢驗(yàn)。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠腫瘤生長(zhǎng)指標(biāo)比較 與模型組比，肝癌條達(dá)飲低、中、高劑量組小鼠平均腫瘤體積均顯著減小，平均腫瘤質(zhì)量顯著降低，且高劑量組小鼠平均腫瘤質(zhì)量均顯著低于低、中劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均Plt;0.05）；肝癌條達(dá)飲低、中、高劑量組小鼠抑瘤率均呈升高趨勢(shì)，見表1。

2.2 各組小鼠腫瘤免疫組織化學(xué)染色切片 顯微鏡下HE切片染色結(jié)果可見，正常小鼠正常細(xì)胞分布均勻，未見腫瘤細(xì)胞，見圖1-A；模型組小鼠呈現(xiàn)大量的腫瘤細(xì)胞并顯示腫瘤細(xì)胞團(tuán)體積大，腫瘤細(xì)胞排列密集，形態(tài)大小不一，核分裂象多，見圖1-B；肝癌調(diào)達(dá)飲低、中、高劑量均顯著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡，減少腫瘤細(xì)胞數(shù)，且呈濃度依賴性變化，見圖1-C、D、E。

2.3 各組小鼠腫瘤組織Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 與模型組比，肝癌條達(dá)飲低、中、高劑量組小鼠Bax、Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量及蛋白相對(duì)表達(dá)量均呈逐漸升高趨勢(shì)，Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量與蛋白相對(duì)表達(dá)量均呈逐漸降低趨勢(shì)，但任意兩組間經(jīng)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均Plt;0.05），見表2。

3 討論

目前對(duì)于HCC的治療仍以外科手術(shù)治療為主，包括肝切除和肝移植術(shù)，但由于肝癌起病隱匿、發(fā)展迅速、惡性程度高，臨床確診時(shí)患者已多屬于中、晚期，且常由于肝癌患者肝功能儲(chǔ)備差、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移及播散而失去外科手術(shù)治療的機(jī)會(huì)，而介入治療、局部消融治療、放射治療及生物靶向治療等措施，雖增加了肝癌的治療方式，但其明顯的不良反應(yīng)及應(yīng)用局限無法忽視。

中醫(yī)認(rèn)為，HCC的主要病機(jī)為正虛于內(nèi)，濕、熱、毒、瘀、痰相互膠結(jié)，日久積而成塊；肝、脾、腎虧虛，臟腑功能失調(diào)是肝癌的發(fā)病基礎(chǔ)，治療肝癌首當(dāng)扶正[5]。肝癌條達(dá)飲中黃芪可補(bǔ)氣、解毒排膿、利尿消腫；白術(shù)可補(bǔ)氣健脾、燥濕利水；茯苓可利水消腫、健脾止瀉，郁金可活血止痛、行氣解郁，夏枯草可清瀉肝火、散結(jié)消腫，蛇莓可清熱涼血、消腫解毒；澤漆可行水消腫、解毒；半邊蓮可清熱解毒、利尿消腫；莪術(shù)可消積止痛、行氣破血；炙水蛭可止痛、活血通經(jīng)；石見穿可活血化瘀、清熱解毒；甘草可補(bǔ)脾益氣，清熱解毒，上述藥物聯(lián)用，共奏扶正固本、活血化瘀、化痰散結(jié)、軟堅(jiān)散結(jié)、活血消腫之功效。相關(guān)研究認(rèn)為，HCC的病機(jī)特點(diǎn)為本虛標(biāo)實(shí)，本虛主要是肝、脾、腎虧虛，標(biāo)實(shí)主要為濕、熱、毒、瘀、痰合而為患，病初在肝脾，當(dāng)清肝養(yǎng)肝為主，佐以健脾以防變；自擬肝癌條達(dá)飲，結(jié)果顯示，肝癌條達(dá)飲能夠改善患者中醫(yī)臨床證候，防治癌癥復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，增強(qiáng)患者的機(jī)體免疫力，促進(jìn)患者康復(fù)；同時(shí)還可減輕化療所引起的疼痛癥狀，且未見明顯不良反應(yīng)，臨床應(yīng)用安全，療效確切[6]。

本研究中，與模型組比，肝癌條達(dá)飲低、中、高劑量組小鼠平均腫瘤體積均顯著減小，平均腫瘤質(zhì)量顯著降低，且高劑量組小鼠平均腫瘤質(zhì)量均顯著低于低、中劑量組；肝癌條達(dá)飲低、中、高劑量組小鼠抑瘤率均呈升高趨勢(shì)，提示低、中、高劑量肝癌條達(dá)飲對(duì)H22荷瘤小鼠均具有明顯的抗腫瘤活性，且其抑瘤作用與劑量呈正相關(guān)。HE染色法對(duì)H22荷瘤小鼠的腫瘤組織進(jìn)行觀察，檢測(cè)各小鼠體內(nèi)細(xì)胞凋亡的情況，結(jié)果表明，H22荷瘤小鼠模型組腫瘤細(xì)胞核清晰且排列緊密，病理性核分裂像多，腫瘤細(xì)胞凋亡較少；而肝癌條達(dá)飲低、中、高劑量組干預(yù)后，均出現(xiàn)了不同程度的核破裂，也提示了肝癌條達(dá)飲對(duì)H22荷瘤小鼠的抑瘤活性呈劑量依賴性。

有研究表明，HCC存在多種信號(hào)通路的異常激活，其中包括表皮生長(zhǎng)因子受體、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子及凋亡信號(hào)通路調(diào)控機(jī)制紊亂[7-8]。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在特定條件下，受多種基因調(diào)控發(fā)生的程序化死亡，是機(jī)體關(guān)鍵自穩(wěn)調(diào)節(jié)機(jī)制，細(xì)胞凋亡與凋亡因子密切相關(guān)，Caspase-3是Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)下游的關(guān)鍵凋亡因子，而Bax、Bcl-2均是Bcl-2家族中具有代表性的促進(jìn)凋亡和抗凋亡的因子。相關(guān)研究顯示，黃芪配伍莪術(shù)可增強(qiáng)促凋亡蛋白Caspases、Bax等的表達(dá)，阻礙凋亡蛋白Bcl的表達(dá)，抑制端粒酶的活性，誘導(dǎo)堿性磷酸酶和乳酸脫氫酶的表達(dá)等[9]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，蛇莓酚提取物可以抑制肝癌細(xì)胞增殖，激發(fā)細(xì)胞凋亡，下調(diào)Bcl-2，上調(diào)Bax，活化Caspase-3，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在體內(nèi)可以抑制腫瘤生長(zhǎng)，延長(zhǎng)荷瘤鼠生存時(shí)間[10]；澤漆乙酸乙酯粗提物可抑制人肝癌細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）、細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）及Bcl-2的表達(dá)，而對(duì)Bax、Caspase-3的表達(dá)有促進(jìn)作用，且呈劑量依賴性[11]。為深入探究肝癌條達(dá)飲的抑瘤作用機(jī)制，本研究用PCR法與WB法對(duì)H22荷瘤小鼠腫瘤組織Bax、Casepase3、Bcl-2表達(dá)情況進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，肝癌條達(dá)飲低、中、高劑量組能提高促凋亡因子Bax、Casepase3表達(dá)，降低抗凋亡因子Bcl-2 表達(dá)；推測(cè)出肝癌條達(dá)飲通過控制細(xì)胞凋亡相關(guān)重要基因（Bax、Bcl-2、Caspase-3）mRNA及蛋白的表達(dá)，起到治療HCC的作用。

綜上，肝癌條達(dá)飲可通過上調(diào)Bax、caspase-3，下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)來誘導(dǎo)H22荷瘤小鼠肝癌細(xì)胞凋亡，且隨著劑量的增加，抗腫瘤效果更顯著。但目前關(guān)于肝癌條達(dá)飲的相關(guān)研究報(bào)道較少，其在體內(nèi)的抗腫瘤作用機(jī)制也十分復(fù)雜，因此仍需進(jìn)一步開展深入研究。

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