【摘要】 背景 缺血性腦卒中發(fā)病率、死亡率、致殘率均較高，溶栓后的再灌注損傷對患者影響較大，針刺是治療本病的特色療法，但作用機(jī)制尚不明確。目的 探討“通督調(diào)神”電針預(yù)處理對腦缺血再灌注損傷（CIRI）大鼠miR-124-3p/糖原合成酶激酶β（GSK-3β）/親環(huán)素D（Cyp-D）信號通路及線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）的影響，探討其防治CIRI的可能機(jī)制。方法 2022年6—8月，將100只清潔級SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、電針組、抑制劑組和電針+激動(dòng)劑組，每組20只。造模前干預(yù)7 d，電針組、電針+激動(dòng)劑組選取通督調(diào)神穴組：百會(huì)、風(fēng)府、大椎穴進(jìn)行電針干預(yù)，1次/d，連續(xù)7 d；造模前24 h電針+激動(dòng)劑組和抑制劑組分別側(cè)腦室注射miR-124激動(dòng)劑和抑制劑（5 nmol）。除假手術(shù)組，余組采用改良線栓法制備大鼠右側(cè)腦缺血再灌注模型；造模成功后，取大鼠右側(cè)腦皮質(zhì)，采用改良神經(jīng)功能損傷評分量表（mNSS）、TTC染色觀察各組大鼠神經(jīng)功能損傷程度，TUNEL染色以及透射電鏡觀察神經(jīng)細(xì)胞損傷情況；免疫熒光染色、Western blotting、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測各組大鼠腦皮質(zhì)GSK-3β、p-GSK-3β、Cyp-D、細(xì)胞色素C（Cyt-C）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）表達(dá)；流式細(xì)胞檢測MPTP開放程度，MPTP 陽性細(xì)胞率越高，代表MPTP開放程度越大。結(jié)果 除假手術(shù)組，各組大鼠均造模成功。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠mNSS評分及相對腦梗死體積均增加，線粒體結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，細(xì)胞凋亡指數(shù)升高，p-GSK-3β、Cyp-D陽性表達(dá)分別減弱和增強(qiáng)，miR-124-3p及Cyp-D、Cyt-C、Caspase-3 mRNA表達(dá)增高，p-GSK-3β/ GSK-3β值降低，Cyp-D、Cyt-C、Caspase-3蛋白相對表達(dá)量增高，MPTP開放程度增加（Plt;0.05）。與模型組比較，電針組、抑制劑組mNSS評分及相對腦梗死體積均降低，線粒體結(jié)構(gòu)破壞減輕，p-GSK-3β/GSK-3β增加，Caspase-3蛋白相對表達(dá)量降低；電針+激動(dòng)劑組GSK-3β mRNA表達(dá)增高（Plt;0.05）；電針組、抑制劑組、電針+激動(dòng)劑組細(xì)胞凋亡指數(shù)降低，

p-GSK-3β、Cyp-D陽性表達(dá)分別減弱和增強(qiáng)，miR-124-3p及Cyp-D、Cyt-C、Caspase-3 mRNA表達(dá)降低，Cyp-D、Cyt-C蛋白相對表達(dá)量降低，MPTP開放程度降低（Plt;0.05）。與電針組比較，抑制劑組p-GSK-3β陽性表達(dá)增強(qiáng)，Cyp-D陽性表達(dá)減弱，miR-124-3p及Cyp-D、Cyt-C、Caspase-3 mRNA表達(dá)降低，GSK-3β mRNA表達(dá)增高，Cyp-D、Cyt-C蛋白相對表達(dá)量降低，MPTP開放程度降低（Plt;0.05）；電針+激動(dòng)劑組細(xì)胞凋亡指數(shù)增高，p-GSK-3β陽性表達(dá)減弱，Cyp-D陽性表達(dá)增強(qiáng)，miR-124-3p、Cyt-C、Caspase-3 mRNA表達(dá)增高，Cyp-D、Cyt-C蛋白相對表達(dá)量增高，MPTP開放程度增加（Plt;0.05）。結(jié)論 “通督調(diào)神”電針預(yù)處理可減輕CIRI大鼠神經(jīng)損傷，其機(jī)制可能與介導(dǎo)miR-124-3p/GSK-3β/Cyp-D信號通路、抑制MPTP開放進(jìn)而減輕細(xì)胞損傷相關(guān)。這一研究結(jié)果從機(jī)制上進(jìn)一步驗(yàn)證了“通督調(diào)神”針法治療CIRI的療效，同時(shí)為中醫(yī)“治未病”提供新的科學(xué)依據(jù)，促進(jìn)臨床應(yīng)用。

【關(guān)鍵詞】 再灌注損傷；腦缺血；卒中；線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔；通督調(diào)神；電針療法；miR-124-3p；穴，百會(huì)；穴，風(fēng)府；穴，大椎

【中圖分類號】 R 619.9 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】 A DOI：10.12114/j.issn.1007-9572.2023.0056

【引用本文】 張國慶，童婷婷，王穎，等. “通督調(diào)神”電針預(yù)處理介導(dǎo)miR-124-3p/GSK-3β/Cyp-D信號通路對腦缺血再灌注損傷大鼠腦皮質(zhì)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的影響及機(jī)制探討［J］. 中國全科醫(yī)學(xué)，2023，26（24）：3050-3060. DOI：10.12114/j.issn.1007-9572.2023.0056. ［www.chinagp.net］

【Abstract】 Background The incidence，mortality and disability rates of ischemic stroke are high，and the reperfusion injury after thrombolytic therapy has a great impact on patients. Acupuncture is a characteristic therapy for the treatment of the disease，but the action mechanism remains unclear. Objective To observe the effect of Tongdu Tiaoshen electroacupuncture （EA） pretreatment on miR-124-3p/glycogen synthase kinase β（GSK-3β）/cyclin D （Cyp-D） signaling pathway and mitochondrial permeability transition pore（MPTP） of cerebral ischemia-reperfusion injury （CIRI） rats，and explore its possible mechanism of prevention and control of CIRI. Methods From June to August 2022，a total of 100 clean SD rats were randomly divided into the sham operation group，model group，EA group，agonist group and EA + inhibitor group，with 20 rats in each group. For 7 d of intervention before modeling，in the EA group and EA + inhibitor group，\"Baihui\"（GV 20），\"Fengfu\"（GV 16）and \"Dazhui\"（GV 14）were selected to perform electroacupuncture 1 time a day for 7 days. For 24 h before modeling，miR-124 agonist and inhibitor （5 nmol） were injected into the lateral ventricles in the EA + agonist group and inhibitor group. Except for the sham operation group，the right cerebral ischemia-reperfusion model of rats was prepared by the modified suture method in the rest groups. The right cerebral cortex of rats was taken，the degree of neurological impairment in each group was observed using mNSS scale and TTC staining，the nerve cell injury was observed by TUNEL staining and transmission electron microscopy. The expressions of GSK-3β，p-GSK-3β，Cyp-D，Cyt-C and Caspase-3 in cerebral cortex of each group were detected by immunofluorescence staining，Western blot and real-time quantitative PCR. The degree of MPTP openness was detected by flow cytometry，the higher rate of MPTP-positive cells indicated greater degress of MPTP openness. Results Except for the sham operation group，all rest groups of rats were successfully modeled. Compared with the sham operation group，mNSS score and infarct volume of brain tissue were increased，mitochondrial structure was seriously damaged，cell apoptosis index was increased，p-GSK-3β positive expression was reduced，Cyp-D positive expression was enhanced，miR-124-3p，Cyp-D，Cyt-C and Caspase-3 mRNA expressions were increased，p-GSK-3β/ GSK-3β ratio was decreased，relative Cyp-D，Cyt-C，and Caspase-3 protein expressions were increased，and MPTP openness degree was increased in the model group（Plt;0.05）. Compared with the model group，mNSS score and relative infarct volume were decreased，mitochondrial structure destruction was relieved，p-GSK-3β/GSK-3β ratio was increased，and relative expression of Caspase-3 protein was decreased in the electroacupuncture group and inhibitor group；the mRNA expression of GSK-3βwas increased in electroacupuncture + agonist group（Plt;0.05）；apoptosis index was decreased，positive expression of p-GSK-3β was reduced and positive expression of Cyp-D was enhanced respectively，miR-124-3p，Cyp-D，Cyt-C and Caspase-3 mRNA expressions were decreased，Cyp-D and Cyt-C protein expressions were decreased，the degree of MPTP openness was decreased in the electroacupuncture group，inhibitor group and electroacupuncture + agonist group（Plt;0.05）. Compared with the electroacupuncture group，p-GSK-3β positive expression was enhanced，Cyp-D positive expression was reduced，miR-124-3p and Cyp-D，Cyt-C，Caspase-3 mRNA expressions were decreased，GSK-3β mRNA expression was increased，Cyp-D and Cyt-C protein expressions were decreased，and MPTP openness degree was reduced in the agonist group（Plt;0.05）；the apoptosis index was increased，the positive expression of P-GSK-3β was reduced，the positive expression of Cyp-D was enhanced，the expressions of miR-124-3p，Cyt-C and Caspase-3 mRNA were increased，the expressions of Cyp-D and Cyt-C protein were increased，and the openness degree of MPTP was increased in the electroacupuncture + agonist group（Plt;0.05）. Conclusion Tongdu Tiaoshen electroacupuncture pretreatment can alleviate neurological impairment in cerebral ischemia-reperfusion rats，the mechanism may be related to mediating miR-124-3p/GSK-3β/Cyp-D signaling pathway，inhibiting MPTP openness and thus reducing cell injury. The results of this study further verified the therapeutic effect of Tongdu Tiaoshen electroacupuncture in the treatment of CIRI from the mechanism，providing a new scientific basis for preventive treatment of disease of TCM and promote its clinical application.

【Key words】 Reperfusion injury；Brain ischemia；Stroke；Mitochondrial permeability transition pore；Tongdu Tiaoshen；Electroacupuncture therapy；miR-124-3p；Point GV20 （Baihui）；Point GV16 （Fengfu）；Point GV14 （Dazhui）

腦卒中是人類致死和致殘的主要疾病之一［1］，其中，缺血性腦卒中的發(fā)生率約為87%［2］。目前國際公認(rèn)的急性期腦卒中的有效治療手段是盡早溶栓、恢復(fù)血流［3］，然而恢復(fù)缺血區(qū)血流會(huì)不可避免地加重缺血性腦損傷，引起腦缺血再灌注損傷（CIRI）［4］。研究發(fā)現(xiàn)，電針預(yù)處理對CIRI具有抑制炎性反應(yīng)、調(diào)節(jié)自噬、抗氧化應(yīng)激等作用［5-6］。然而，有關(guān)電針防治CIRI的作用機(jī)制尚未能完全明晰，有待進(jìn)一步研究。

CIRI的病理過程較為復(fù)雜，線粒體作為細(xì)胞的動(dòng)力源在細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)中起著關(guān)鍵作用［7］，線粒體功能障礙是器官再灌注損傷發(fā)生后誘發(fā)機(jī)體損傷的重要因素［8-9］。因此，靶向線粒體可能是缺血性卒中的重要防治策略之一［10］。線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）開放是線粒體功能障礙以及誘發(fā)神經(jīng)元凋亡級聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［11］。親環(huán)素D（Cyp-D）是調(diào)控MPTP的關(guān)鍵蛋白，當(dāng)MPTP異常開放后，線粒體內(nèi)膜上細(xì)胞色素C（Cyt-C）等被釋放入細(xì)胞質(zhì)中，進(jìn)而激活凋亡相關(guān)蛋白，誘發(fā)細(xì)胞凋亡［12］。

微小RNA在調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能中發(fā)揮重要作用，其中miR-124特異性表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)［13］。研究顯示，miR-124的異常表達(dá)與腦損傷密切相關(guān)［14］，且miR-124與糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β） mRNA之間可能存在靶向關(guān)系［15］。GSK-3β可以通過直接調(diào)節(jié)MPTP而維持線粒體功能［16］。電針預(yù)處理對CIRI的神經(jīng)保護(hù)作用是否與miR-124-3p/GSK-3β/Cyp-D信號通路介導(dǎo)的MPTP開放度降低相關(guān)，值得關(guān)注。

本研究通過觀察“通督調(diào)神”電針預(yù)處理對CIRI大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)神經(jīng)元線粒體MPTP的影響，探討電針預(yù)處理對CIRI大鼠的潛在神經(jīng)保護(hù)機(jī)制，為促進(jìn)“通督調(diào)神”針刺法在缺血性腦卒中的臨床應(yīng)用提供新的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 SPF級雄性SD大鼠100只，鼠齡7周，體質(zhì)量200～250 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司〔許可證號：SCXK（湘）2019-0004〕，飼養(yǎng)于安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)條件：Ⅱ級，溫度（23±2） ℃，相對濕度（60±10）%，自由攝食飲水，12 h/12 h明暗周期。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組、模型組、電針組、抑制劑組與電針+激動(dòng)劑組，每組20只。本次實(shí)驗(yàn)過程中對大鼠的處置符合國家科技部2006年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》中的相關(guān)規(guī)定，并取得安徽中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理編號：AHUCM-rats-2021012）。

1.2 主要試劑與儀器 小鼠抗大鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（TA-08）、山羊抗小鼠IgG（HRP，ZB-2305）、山羊抗兔IgG（HRP，ZB-2301）均購于北京Zsbio公司。GSK3β抗體（BS1402）、p-GSK3β抗體（BS4084）購于美國Bioworld公司，Cyp-D抗體（ABP52875）購于瑞士Abbkin公司，Cyt C抗體（BA0781）購于美國Boster公司，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）抗體（ab184787）購于英國abcam公司；PCR引物（上海Sangon Biotech公司）；原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)（TUNEL）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（B014）、山羊抗兔IgG（FITC，B029）購于安徽欣樂生物技術(shù)有限公司；兔抗大鼠Cyp-D抗體（bs-9878R）購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司，兔抗大鼠GSK3β抗體（BS1402）、兔抗大鼠p-GSK3β抗體（BS4084）購于美國Bioworld公司；MPTP檢測試劑盒（C2009S）購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。miR-124-3p激動(dòng)劑（ISO9001）、miR-124-3p抑制劑（ISO13485），購于廣州市銳博生物科技有限公司。

天協(xié)牌一次性無菌針灸針（0.2 mm×25.0 mm，蘇州天協(xié)針灸器械有限公司），華佗牌電子針療儀（SDZ-Ⅱ，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司），電子天平（FA2004N，上海菁海儀器有限公司），熒光顯微鏡（BX51，日本Olympus公司），徠卡切片機(jī)（RM2016，德國Leica公司），熒光定量PCR儀（PIKOREAL 96，美國Thermo Scientific），流式細(xì)胞儀（CytoFLEX，上海貝克曼庫爾特國際貿(mào)易有限公司 ），動(dòng)物麻醉機(jī)（R500/R600系列，深圳瑞沃德生命科技有限公司），Image J圖像分析軟件（美國NIH公司），全自動(dòng)數(shù)字切片掃描系統(tǒng)（Pannoramic MIDI，匈牙利3DHISTECH公司），形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（JD801，江蘇省捷達(dá)科技發(fā)展有限公司）。

1.3 干預(yù)方法 造模前干預(yù)7 d：（1）假手術(shù)組與模型組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，同電針組做相同的抓取、捆綁，但不做任何干預(yù)。（2）電針組大鼠在干預(yù)期內(nèi)吸入異氟烷，麻醉狀態(tài)下抓取、捆綁，俯臥位固定于鼠板上。選取通督調(diào)神穴組：百會(huì)、風(fēng)府、大椎穴進(jìn)行干預(yù)，取

0.2 mm×25.0 mm毫針，在針柄處連接電針治療儀，以針體輕輕抖動(dòng)為度，選用疏密波，頻率為2 Hz/5 Hz，電流強(qiáng)度 1～2 mA，1次/d，20 min/次，連續(xù)干預(yù)7 d。穴區(qū)定位及針刺方法：百會(huì)，頂骨的正中央，向后斜刺3 mm；風(fēng)府，枕骨頂脊后枕寰關(guān)節(jié)背凹陷處，平刺進(jìn)針3 mm；大椎，第7頸椎與第1胸椎間，背部正中，向后斜刺3 mm。穴位定位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》［17］關(guān)于“常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物針灸穴位”的取穴標(biāo)準(zhǔn)。（3）抑制劑組大鼠在干預(yù)期內(nèi)前期常規(guī)飼養(yǎng)，同電針組做相同的抓取、捆綁。大鼠于造模前24 h經(jīng)側(cè)腦室注射miR-124-3p抑制劑10 μL（0.5 nmol/μL）。側(cè)腦室注射：大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液（30 mg/kg）麻醉后俯臥位固定于腦立體定位儀上，備皮后用2%復(fù)方聚維酮碘溶液消毒，沿頭部正中作一長0.5～1.0 mm的縱向切口，暴露顱骨后用棉簽蘸取3%過氧化氫溶液涂擦顱骨表面，記號筆標(biāo)記前囟點(diǎn)。以前囪為基點(diǎn)，調(diào)整進(jìn)針點(diǎn)坐標(biāo)位置（ 前囟后：0.8 mm，距矢狀縫橫向距離：1.5 mm，進(jìn)針深度：4.5 mm）。用牙科鉆 （孔徑約2 mm） 鉆開顱骨至硬腦膜，使用微量注射器進(jìn)入硬膜下4.5 mm的側(cè)腦室位置后連接腦立體定位儀，以0.5 μL/min的速度向腦室內(nèi)注射miR-124-3p抑制劑，注射完畢后留針5～10 min，以防藥液外滲，結(jié)束后緩慢退出注射器，干棉球輕微按壓針孔，消毒后逐層縫合頭皮。（4）電針+激動(dòng)劑組大鼠在干預(yù)期內(nèi)與電針組同期進(jìn)行相同的電針干預(yù)，并且于造模前24 h經(jīng)側(cè)腦室注射miR-124-3p激動(dòng)劑10 μL（0.5 nmol/μL）。

1.4 模型制備 末次電針及側(cè)腦室注射24 h后，參照文獻(xiàn)［18］采用改良線栓法制備CIRI大鼠模型。大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液（30 mg/kg）麻醉后仰臥位固定于鼠板上、備皮，2%復(fù)方聚維酮碘溶液消毒，于頸前正中偏右0.2～0.3 cm皮膚行一長1.5～2.0 cm縱向切口，鑷子鈍性分離淺筋膜，暴露胸鎖乳突肌，在頸前肌群與胸鎖乳突肌之間向深部鈍性分離，暴露頸動(dòng)脈鞘，玻璃分針游離頸總動(dòng)脈（CCA）和迷走神經(jīng)，向上分離直至CCA分叉處。鈍性分離頸外動(dòng)脈（ECA）和頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA），使之清晰可見。結(jié)扎距離ICA、ECA分叉處下7～10 mm的CCA近心端，同時(shí)在CCA距離ICA、ECA分叉處下3 mm的CCA遠(yuǎn)心端打一活結(jié)備用。結(jié)扎ECA近心端，動(dòng)脈微血管夾夾閉ICA。在活結(jié)下2 mm處用顯微剪在CCA上剪一“Ｖ”型切口，插入直徑0.3 mm的硅膠線栓，沿ICA方向插入后去除血管夾，從ICA、ECA分叉處繼續(xù)插入18～20 mm，至線栓遇輕微阻力時(shí)停止并結(jié)扎CCA上的活結(jié)。2%復(fù)方聚維酮碘溶液消毒后逐層縫合切口，將線栓尾端留置在體外，用0.9%氯化鈉溶液浸濕的棉球覆蓋傷口，腹腔注射青霉素鈉溶液0.2 mL/d（4×104 U/d）預(yù)防感染。

模型組、電針組、電針+激動(dòng)劑組及抑制劑組均按上述方法造模；假手術(shù)組大鼠只分離右側(cè)頸部CCA、ICA、ECA，不進(jìn)行結(jié)扎和插線；模型大鼠腦缺血2 h后，回抽線栓令頭端退至CCA結(jié)扎處，恢復(fù)大腦中動(dòng)脈灌注。

再灌注2 h后依據(jù)Zea-Longa 5分法對大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分［19］，0分：無神經(jīng)功能損傷癥狀；1分：不能完全伸展對側(cè)前肢，提尾懸吊時(shí)左前肢屈曲；2分：爬行時(shí)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分：爬行時(shí)向?qū)?cè)傾倒；4分：意識水平下降或喪失，不能自主行走。1～3分視為造模成功，納入實(shí)驗(yàn)。各組大鼠均造模成功。

1.5 取材及指標(biāo)檢測

1.5.1 行為學(xué)檢測 采用改良神經(jīng)功能損傷評分量表（mNSS）［20］評定各組大鼠CIRI模型制備完成24 h后神經(jīng)行為學(xué)情況。mNSS 評分總分為0～18分。分?jǐn)?shù)越高，代表神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重。

1.5.2 組織取材 神經(jīng)功能損傷評分結(jié)束后大鼠腹腔注2%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉。每組隨機(jī)選取15只大鼠，迅速斷頭，取出全腦組織。每組取5只大鼠全腦用冰0.9%氯化鈉溶液沖洗，冰箱速凍，用于TTC染色。每組取4只大鼠迅速打開胸腔暴露心臟，用0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行灌注后取腦，分離右側(cè)皮質(zhì)組織，將其修整成2份大小為1 mm×1 mm×1 mm的組織樣本，一份置于電鏡固定液內(nèi)室溫固定24 h，于4 ℃冰箱保存以行透射電鏡觀察，另一份用于制備單細(xì)胞懸液，以行流式細(xì)胞檢測。每組取6只大鼠斷頭后取右側(cè)腦皮質(zhì)組織迅速裝入凍存管置于液氮罐中低溫保存，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western blotting檢測。每組剩余的5只大鼠迅速打開胸腔，暴露心臟后依次予以0.9%氯化鈉溶液及4%多聚甲醛灌注，結(jié)束后于冰上斷頭分離出全腦組織，置于4%多聚甲醛中固定24～48 h，用于TUNEL染色和免疫熒光染色。

1.5.3 2，3，5-氯化三苯基四氮唑染色（TTC染色）法觀察各組大鼠腦組織梗死情況 取-20 ℃冰箱冷凍20 min的腦組織，去除小腦及嗅球部分后，切成5個(gè)厚度約2 mm 的冠狀切片，將腦片置于2% TTC溶液中，37 ℃恒溫避光染色，30 min后取出腦片，置于4%多聚甲醛中固定24 h后拍照。最后使用Image J 軟件進(jìn)行分析并計(jì)算大鼠的相對腦梗死體積，用百分比（%）表示。相對腦梗死體積=腦切片白色缺血區(qū)域體積/腦切片總體積×100%。

1.5.4 透射電鏡法觀察各組大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 取電鏡固定液固定后的腦皮質(zhì)組織，以1%的鋨酸×0.1 mmol/L磷酸緩沖液（PBS）于室溫固定2 h后漂洗，15 min×3次。梯度乙醇脫水，丙酮滲透、包埋，制成超薄切片（厚度70 nm），鈾鉛雙染色各15 min，室溫干燥過夜，將切片置于透射電鏡下×10 000、×25 000觀察神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

1.5.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測大鼠腦皮質(zhì)miR-124-3p及GSK-3β、Cyp-D、Cyt-C、Caspase-3 mRNA表達(dá) 取腦皮質(zhì)組織100 mg，按試劑盒說明，經(jīng)過總RNA抽提、反轉(zhuǎn)錄成cDNA 樣本后進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)測得樣品CT值，以U6、β-actin為內(nèi)參，按照2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因的miRNA及mRNA的相對表達(dá)量。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司提供，引物序列見表１。

1.5.6 Western blotting法檢測大鼠腦皮質(zhì)GSK-3β、p-GSK-3β、Cyp-D、Cyt-C、Caspase-3蛋白表達(dá) 取腦皮質(zhì)組織100 mg，裂解、離心取上清液、測定蛋白濃度、加熱使蛋白充分變性后，依次經(jīng)過電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，漂洗，加入一抗，過夜，磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST）漂洗3遍，加入二抗，室溫孵育2 h，PBST漂洗10 min，

重復(fù)3遍。使用L增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）試劑盒檢測蛋白，Image J 處理分析灰度值，以GAPDH為內(nèi)參蛋白，計(jì)算目標(biāo)蛋白相對表達(dá)量，目的蛋白相對表達(dá)量=目的條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值。

1.5.7 流式細(xì)胞檢測MPTP開放程度 取出腦皮質(zhì)組織加入1 mL混合消化液，剪碎組織后37 ℃恒溫箱中振蕩消化，過濾后收集單細(xì)胞懸液，加入適當(dāng)體積的檢測緩沖液、Calcein AM染色液、熒光淬滅工作液或Ionomycin對照重懸，37 ℃避光孵育30 min后，1 000×g室溫離心5 min收集細(xì)胞，加入400 μL檢測緩沖液重懸細(xì)胞后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測和分析。Calcein的最大激發(fā)光波長為494 nm，最大發(fā)射光波長為517 nm。MPTP 陽性細(xì)胞率越高，代表MPTP開放程度越大。

1.5.8 TUNEL染色法檢測大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況 將固定后的腦組織石蠟包埋、切片（厚度5 μm）。切片依次經(jīng)過烤片、浸洗、脫蠟、洗片，滴加蛋白酶K工作液37 ℃孵育25 min后PBS沖洗3次，滴加TUNEL檢測液，37 ℃培養(yǎng)箱孵育60 min，PBS沖洗3次，滴加DAPI染液，避光反應(yīng)10 min。PBS清洗后甩干，抗熒光淬滅封片劑封片。數(shù)字切片掃描儀（Pannoramic MIDI）掃描熒光切片，CaseViewer 2.2軟件×400觀察并記錄圖像。每只大鼠隨機(jī)選取2張切片，每張切片隨機(jī)截取3個(gè)視野，用Image J軟件計(jì)算凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI），公式為AI（%）=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.5.9 免疫熒光法檢測大鼠腦皮質(zhì)GSK-3β、p-GSK-3β、Cyp-D的表達(dá) 將標(biāo)本從組織固定液中取出，依次進(jìn)行脫水、浸蠟、包埋、切片（厚度5 μm）后浸洗及脫蠟，抗原高壓修復(fù)，山羊血清封閉，室溫孵育30 min后滴加一抗，37 ℃孵育1 h，PBS沖洗，甩干，滴加FITC標(biāo)記的熒光二抗，37 ℃避光孵育30 min，PBS沖洗后封片，Pannoramic MIDI掃描熒光切片，CaseViewer 2.2軟件×400觀察并記錄圖像。每只大鼠隨機(jī)選取2張切片，每張切片隨機(jī)取3個(gè)視野，捷達(dá)JD801醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，計(jì)算平均光密度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，采用GraphPad Prism 8.0整理生成統(tǒng)計(jì)圖。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料數(shù)據(jù)以（x-±s）表示，Shapiro-Wilk法檢驗(yàn)各指標(biāo)數(shù)據(jù)的正態(tài)性，Leven檢驗(yàn)數(shù)據(jù)方差齊性。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊時(shí)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法，方差不齊時(shí)多重比較采用蓋姆斯-豪厄爾檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，多組間比較采用獨(dú)立樣本克魯斯卡爾-沃利斯檢驗(yàn)。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠mNSS評分及腦組織梗死情況比較 各組大鼠mNSS評分和相對腦梗死體積比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.01）。假手術(shù)組大鼠腦組織無梗死，神經(jīng)功能無缺損；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠mNSS評分升高、相對腦梗死體積增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）；與模型組比較，電針組、抑制劑組大鼠mNSS評分降低、相對腦梗死體積減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）；與電針組比較，電針+激動(dòng)劑組大鼠mNSS評分升高、相對腦梗死體積增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），見圖1、表2。

2.2 各組大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 假手術(shù)組大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞輪廓清晰，細(xì)胞核膜完整無皺縮，線粒體形態(tài)多呈橢圓形或梭形，大小適中，結(jié)構(gòu)完整，膜邊界清晰，嵴縱行排列密集有規(guī)律，橫紋排列清晰有序，未出現(xiàn)腫脹及空泡；模型組和電針+激動(dòng)劑組大鼠的神經(jīng)細(xì)胞體積縮小，核膜皺縮，線粒體腫脹，線粒體膜邊界不清，嵴斷裂稀疏，橫紋大部分消失，體內(nèi)大部分呈空泡狀態(tài)；電針組和抑制劑組大鼠細(xì)胞輪廓尚清晰，細(xì)胞核膜輕度皺縮，線粒體呈橢圓或梭形，略腫脹，結(jié)構(gòu)完整，膜尚清晰，嵴和橫紋分布基本整齊有序，見圖2。

2.3 各組大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況 各組大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞AI比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦皮質(zhì)細(xì)胞AI升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.01）；與模型組比較，電針組、抑制劑組、電針+激動(dòng)劑組大鼠腦皮質(zhì)細(xì)胞AI降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.01）；與電針組比較，抑制劑組大鼠腦皮質(zhì)細(xì)胞AI降低，電針+激動(dòng)劑組細(xì)胞AI增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），見圖3、表3。

2.4 各組大鼠腦皮質(zhì)GSK-3β、p-GSK-3β、Cyp-D蛋白表達(dá)情況 各組GSK-3β蛋白陽性表達(dá)結(jié)果比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）。各組p-GSK-3β蛋白、Cyp-D陽性表達(dá)結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組p-GSK-3β蛋白陽性表達(dá)減弱，Cyp-D蛋白陽性表達(dá)增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.01）；與模型組比較，電針組、抑制劑組、電針+激動(dòng)劑組p-GSK-3β蛋白陽性表達(dá)增強(qiáng)，Cyp-D蛋白陽性表達(dá)減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.01）；與電針組比較，抑制劑組p-GSK-3β蛋白陽性表達(dá)增強(qiáng)，Cyp-D蛋白陽性表達(dá)減弱，電針+激動(dòng)劑組p-GSK-3β蛋白陽性表達(dá)減弱，Cyp-D蛋白陽性表達(dá)增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），見表3、圖4。

2.5 各組大鼠腦皮質(zhì)miR-124-3p及GSK-3β、Cyp-D、Cyt-C、Caspase-3 mRNA表達(dá)比較 各組大鼠腦皮質(zhì)miR-124-3p及GSK-3β、Cyp-D、Cyt-C、Caspase-3 mRNA表達(dá)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦皮質(zhì)miR-124-3p及Cyp-D、Cyt-C、Caspase-3 mRNA表達(dá)增高，GSK-3β mRNA表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.01）；與模型組比較，電針組、抑制劑組、電針+激動(dòng)劑組miR-124-3p及Cyp-D、Cyt-C、Caspase-3 mRNA表達(dá)降低，電針組、抑制劑組、電針+激動(dòng)劑組GSK-3β mRNA表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

（Plt;0.05）；與電針組比較，抑制劑組miR-124-3p及Cyp-D、Cyt-C、Caspase-3 mRNA表達(dá)降低，GSK-3β mRNA表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），電針+激動(dòng)劑組miR-124-3p、Cyt-C、Caspase-3 mRNA表達(dá)增高，GSK-3β mRNA 表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），見表4。

2.6 各組大鼠腦皮質(zhì)p-GSK-3β/GSK-3β、Cyp-D、Cyt-C、Caspase-3蛋白表達(dá)比較 各組大鼠腦皮質(zhì)p-GSK-3β/GSK-3β、Cyp-D、Cyt-C、Caspase-3蛋白表達(dá)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦皮質(zhì)p-GSK-3β/GSK-3β值降低，Cyp-D、Cyt-C、Caspase-3蛋白相對表達(dá)量增高（Plt;0.01）；與模型組比較，電針組、抑制劑組p-GSK-3β/ GSK-3β值增高，Cyp-D、Cyt-C蛋白相對表達(dá)量降低（Plt;0.01），Caspase-3蛋白相對表達(dá)量降低（Plt;0.01、Plt;0.05）；電針+激動(dòng)劑組Cyp-D、Cyt-C蛋白相對表達(dá)量降低（Plt;0.01），p-GSK-3β/ GSK-3β值增高、Caspase-3蛋白相對表達(dá)量降低，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）。與電針組比較，抑制劑組Cyp-D、Cyt-C蛋白相對表達(dá)量降低（Plt;0.01）；電針+激動(dòng)劑組Cyp-D、Cyt-C蛋白相對表達(dá)量增高（Plt;0.01），p-GSK-3β/ GSK-3β值降低，Caspase-3蛋白相對表達(dá)量增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），見表5、圖5。

2.7 各組大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞MPTP的開放程度比較 與假手術(shù)組比較，模型組MPTP開放程度明顯增加（Plt;0.01）；與模型組比較，電針組、抑制劑組、電針+激動(dòng)劑組MPTP開放程度降低（Plt;0.01）；與電針組比較，抑制劑組MPTP開放程度降低（Plt;0.05）、電針+激動(dòng)劑組MPTP開放程度增加（Plt;0.05），見表6、圖6。

3 討論

本研究采用“通督調(diào)神”電針預(yù)處理CIRI模型大鼠，選穴百會(huì)、風(fēng)府、大椎。百會(huì)乃“三陽五會(huì)”，聚一身之陽氣匯于巔頂；大椎為“諸陽之會(huì)”，具有保健強(qiáng)身之效；風(fēng)府可“醒腦調(diào)神”，三穴均為督脈之要穴，共用有通督調(diào)神、燮理陰陽之功［21-22］。研究表明，“通督調(diào)神”針刺能夠促進(jìn)神經(jīng)髓鞘再生、調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬，改善CIRI后大鼠神經(jīng)功能，但其更為具體的作用機(jī)制尚未明晰［23-24］。因此，探討“通督調(diào)神”電針預(yù)處理減輕CIRI作用機(jī)制，對于本病的防治意義重大。本研究中，CIRI模型大鼠mNSS評分增高、相對腦梗死體積增大、TUNEL陽性細(xì)胞率增高；電針預(yù)處理后，大鼠mNSS評分及相對腦梗死體積減少、TUNEL陽性細(xì)胞率明顯降低，表明“通督調(diào)神”電針預(yù)處理可抑制CIRI的發(fā)生和發(fā)展，減輕神經(jīng)功能損傷，與相關(guān)研究［25-26］結(jié)果一致。

細(xì)胞凋亡是CIRI的一種細(xì)胞死亡方式［27］，而線粒體功能障礙介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的內(nèi)源性途徑，并發(fā)揮中心調(diào)控作用［28］。MPTP位于線粒體內(nèi)外膜之間的接觸點(diǎn)上，對調(diào)控線粒體通透性起關(guān)鍵作用［29］，當(dāng)MPTP過度開放時(shí)，線粒體與細(xì)胞質(zhì)之間的離子交換異常，導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)和功能異常［30］。線粒體內(nèi)膜上Cyt-C釋放到細(xì)胞質(zhì)中，并進(jìn)一步活化Caspase-3等凋亡相關(guān)因子，誘發(fā)凋亡發(fā)生、加重神經(jīng)損傷。本研究透射電鏡顯示CIRI大鼠線粒體形態(tài)破壞嚴(yán)重，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示MPTP開放程度升高；電針組線粒體結(jié)構(gòu)尚完整，MPTP開放程度降低，提示電針預(yù)處理對CIRI后的神經(jīng)保護(hù)作用可能與抑制MPTP開放、進(jìn)而保護(hù)線粒體功能有關(guān)。

miR-124是參與缺血再灌注損傷發(fā)生機(jī)制的重要調(diào)控因子［31］。李杰等［32］研究發(fā)現(xiàn)，采用沖擊波干預(yù)腦梗死大鼠可降低海馬組織miR-124表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖，改善受損神經(jīng)功能。研究發(fā)現(xiàn)，miR-124表達(dá)下調(diào)可增強(qiáng)GSK-3β的表達(dá)，減弱Wnt/β-catenin途徑的活性，發(fā)揮保護(hù)性作用［33］。GSK-3β是一種在體內(nèi)廣泛表達(dá)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激酶，參與細(xì)胞的多種生理過程，如代謝、凋亡和免疫調(diào)節(jié)等［34］。目前，已有研究發(fā)現(xiàn)GSK-3β信號傳導(dǎo)通路與調(diào)控MPTP開放有關(guān)［35］，其磷酸化產(chǎn)物p-GSK-3β在CIRI中的神經(jīng)保護(hù)作用已被證實(shí)，即通過抑制MPTP的開放來維持線粒體再灌注損傷后的跨膜電位［36］。Cyp-D是構(gòu)成MPTP最關(guān)鍵的調(diào)節(jié)蛋白，也是參與神經(jīng)元缺血性死亡的重要物質(zhì)［37］。Cyt-C、Caspase-3是重要的促凋亡蛋白［38］，Caspase-3被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的標(biāo)志［39］。

本研究中，模型組大鼠腦皮質(zhì)miRNA-124-3p表達(dá)升高、GSK-3β mRNA、p-GSK-3β/GSK-3β蛋白表達(dá)比值降低、Cyp-D蛋白及微小RNA表達(dá)增高，電針和抑制劑干預(yù)后miR-124-3p表達(dá)降低、GSK-3β mRNA、p-GSK-3β/GSK-3β蛋白表達(dá)比值增高、Cyp-D蛋白及mRNA表達(dá)降低，說明miR-124被抑制后可靶向激活GSK-3β，進(jìn)而通過上調(diào)p-GSK-3β的表達(dá)，抑制Cyp-D介導(dǎo)的MPTP開放，起到保護(hù)線粒體的作用。與模型組比較，電針組和抑制劑組Cyt-C、Caspase-3蛋白及mRNA表達(dá)降低，說明細(xì)胞凋亡得到抑制、細(xì)胞功能相對穩(wěn)定。該結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證電針預(yù)處理可能通過負(fù)向調(diào)控大鼠神經(jīng)細(xì)胞miRNA-124-3p，進(jìn)而抑制MPTP開放發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

為進(jìn)一步驗(yàn)證“通督調(diào)神”電針預(yù)處理對CIRI大鼠神經(jīng)細(xì)胞線粒體MPTP的影響是否與miR-124-3p/GSK-3β/Cyp-D信號通路相關(guān)，本研究設(shè)置了miR-124-3p抑制劑組和電針+激動(dòng)劑組。結(jié)果顯示，抑制劑組miR-124-3p及Cyp-D、Cyt-C、Caspase-3表達(dá)降低，GSK-3β表達(dá)增高，總體結(jié)果與電針組趨同，而電針與miR-124-3p激動(dòng)劑聯(lián)用后，其抑制miR-124-3p、進(jìn)而激活GSK-3β抑制MPTP開放的作用被逆轉(zhuǎn)。進(jìn)一步說明“通督調(diào)神”電針預(yù)處理對CIRI大鼠神經(jīng)功能損傷發(fā)生發(fā)展的抑制作用，可能是通過調(diào)控miR-124-3p/GSK-3β/Cyp-D信號通路，抑制神經(jīng)細(xì)胞線粒體MPTP開放。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，“通督調(diào)神”針刺法對中風(fēng)高危因素的干預(yù)可有效控制“中風(fēng)先兆”的進(jìn)展［40-41］，本研究對今后開展針灸預(yù)處理防治缺血性腦卒中的臨床應(yīng)用具有積極的促進(jìn)作用。然而，電針預(yù)處理預(yù)防CIRI的作用機(jī)制復(fù)雜，仍有待進(jìn)一步深入研究。本研究中大鼠為吸入異氟烷麻醉狀態(tài)下電針，麻醉藥對大鼠神經(jīng)系統(tǒng)的影響是否影響到本實(shí)驗(yàn)尚未得知，這使得本實(shí)驗(yàn)存在一定的局限性和不足，后續(xù)研究將通過查閱文獻(xiàn)、實(shí)體實(shí)驗(yàn)等方式優(yōu)化電針方式，減少干預(yù)因素。

作者貢獻(xiàn)：張國慶、童婷婷、李奎武提出研究構(gòu)思與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)實(shí)施，觀察指標(biāo)的測量與數(shù)據(jù)收集；張國慶負(fù)責(zé)撰寫論文初稿；李奎武負(fù)責(zé)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；吳曉晴、汪俊麗負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)收集與統(tǒng)計(jì)結(jié)果審核；童婷婷、張利達(dá)、張君宇負(fù)責(zé)整體實(shí)驗(yàn)評估，觀察指標(biāo)的數(shù)據(jù)收集；韓為、王穎負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對文章整體進(jìn)行監(jiān)督管理；所有作者確認(rèn)了論文終稿。

本文無利益沖突。

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（收稿日期：2022-12-20；修回日期：2023-03-10）

（本文編輯：趙躍翠）