李雁潔，韓 旭

1.蘇州健雄職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 蘇州 215411；2.沈陽化工大學(xué)，遼寧 沈陽 110142

萜類化合物在自然界中廣泛存在且種類繁多，一些中草藥中的有效成分及化妝品、食品工業(yè)、汽車工業(yè)等中的一些重要原材料都是萜類化合物。同時(shí)，萜類化合物有許多重要的生理功能，例如青蒿素及其衍生物被廣泛應(yīng)用于治療瘧疾[1]；紫杉醇是治療癌癥的有效藥物[2]。隨著科技的發(fā)展，社會(huì)對(duì)萜類化合物的需求日益增加，然而傳統(tǒng)的天然提取方法和化學(xué)合成方法逐漸顯現(xiàn)出多種弊端：成本高、產(chǎn)量有限、污染環(huán)境等。因此，利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)萜類化合物變得更有前景。

萜類化合物的生物合成依賴于代謝前體異戊烯基二磷酸（IPP）和二甲基烯丙基二磷酸（DMAPP），而這兩種物質(zhì)的形成主要來源于兩種代謝途徑，一種是MVA 途徑，另一種是MEP 途徑。MVA 途徑主要存在于大多數(shù)真核生物、古細(xì)菌和少數(shù)細(xì)菌中；而MEP 途徑則主要存在于大多數(shù)細(xì)菌、植物葉綠體和藻類中[3]。MEP 途徑包括七步酶促反應(yīng)[4]，DXS 是參與第一步催化反應(yīng)的關(guān)鍵酶，它以丙酮酸和3-磷酸甘油醛為底物，催化生成DXP（圖1）。對(duì)細(xì)菌MEP途徑的改造會(huì)影響與MEP 途徑相關(guān)的各種產(chǎn)物的產(chǎn)量。據(jù)報(bào)道，芽孢桿菌屬是微生物中異戊二烯產(chǎn)量最高的菌株[5]。有研究表明，在大腸桿菌中異源表達(dá)IspS 基因，并過表達(dá)dxs 和dxr 基因，可以促進(jìn)異戊二烯產(chǎn)量的提升[6]。番茄紅素產(chǎn)量的增加也可以通過改進(jìn)大腸桿菌MEP 途徑實(shí)現(xiàn)[7]。除此之外，還有關(guān)于通過改造MEP 途徑提高青蒿素[8]、紫杉醇[9]、類胡蘿卜素[10]等萜類化合物的報(bào)道。由此可見，DXS 的研究對(duì)于MEP 途徑的改造、提高萜類化合物的產(chǎn)量至關(guān)重要。對(duì)MEP 途徑中關(guān)鍵酶的研究不僅可以為改造MEP 途徑奠定理論基礎(chǔ)，也能為合成生物學(xué)和代謝工程生產(chǎn)萜類化合物提供有價(jià)值的理論支持。

圖1 DXS 催化MEP 途徑中的第一步反應(yīng)

枯草芽孢桿菌遺傳背景清晰，具有安全、無致病性的特點(diǎn)，是用來進(jìn)行微生物發(fā)酵的首選宿主菌[11]。本次研究克隆了枯草芽孢桿菌MEP 途徑的關(guān)鍵酶基因dxs，并將其與表達(dá)載體pHY-P43 相連接，構(gòu)建出重組表達(dá)載體pHY-P43-dxs。之后，通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法將重組表達(dá)載體導(dǎo)入枯草芽孢桿菌中，并進(jìn)行重組菌株的鑒定。最后，利用氣相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)重組菌株相較于野生型菌株的氣體釋放成分及含量的變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

枯草芽孢桿菌168、大腸桿菌JM09、大腸桿菌DH5α：沈陽化工大學(xué)制藥與生物工程學(xué)院生物工程實(shí)驗(yàn)室提供；T-vector PMD19：購自寶生物工程(大連)有限公司；pHY-P43 質(zhì)粒：購自淼靈質(zhì)粒平臺(tái)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 dxs 基因的克隆與重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

首先從枯草芽孢桿菌168 基因組文庫中找到dxs 基因的堿基序列，設(shè)計(jì)引物。然后以提取的枯草芽孢桿菌的基因組為模板，PCR 擴(kuò)增dxs 目的基因。根據(jù)pHY-P43 質(zhì)粒上的多克隆位點(diǎn)選取BamH I和Bgl Ⅱ限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)，將目的基因dxs與pHY-P43 質(zhì)粒重組，再經(jīng)過篩選、基因測(cè)序鑒定，最終獲得重組表達(dá)質(zhì)粒。

1.2.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌

將pHY-P43-dxs 重組質(zhì)粒通過原生質(zhì)體法轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌，并通過質(zhì)粒提取與鑒定方法進(jìn)行重組菌株的鑒定。

1.2.3 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析

將野生菌株（對(duì)照菌株）與重組菌株（轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒的菌株）進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 dxs 基因的克隆與重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

通過對(duì)比基因的測(cè)序結(jié)果，成功克隆并構(gòu)建了含有dxs 目的基因片段的重組質(zhì)粒，dxs 基因由1902個(gè)堿基對(duì)構(gòu)成，編碼633 個(gè)氨基酸。

2.1.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌

以野生菌為對(duì)照，通過對(duì)菌株的質(zhì)粒提取以及雙酶切、PCR 多項(xiàng)分子水平的鑒定，最終得到含有重組表達(dá)載體pHY-P43-dxs 的枯草芽孢桿菌重組菌株。

2.1.3 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析

氣相結(jié)果顯示，野生型枯草芽孢桿菌樣品瓶中氣體的主要成分為二氧化碳和鄰苯二甲酸異丁正壬酯，分別占?xì)怏w總量的94.012%和5.988%。而含有重組表達(dá)載體pHY-P43-dxs 的枯草芽孢桿菌樣品瓶中的氣體成分全部為二氧化碳，且二氧化碳含量高于野生對(duì)照株。如圖2 所示。

圖2 氣相色譜-質(zhì)譜分析

2.2 分析與討論

氣相色譜-質(zhì)譜分析結(jié)果表明，野生型枯草芽孢桿菌釋放的氣體主要成分為二氧化碳和鄰苯二甲酸異丁正壬酯，而含有重組表達(dá)載體pHY-P43-dxs的重組菌株釋放的氣體僅有二氧化碳，且釋放量增加。分析產(chǎn)生這個(gè)結(jié)果的原因可能是：生物體內(nèi)的MEP 途徑與其他反應(yīng)途徑（如TCA 循環(huán)）相互交叉，互相影響，互相制約。由于重組菌株內(nèi)含有導(dǎo)入的重組表達(dá)載體pHY-P43-dxs，會(huì)引起重組菌株中dxs基因表達(dá)增加，從而引起MEP 代謝途徑異常，會(huì)引起下游的生物合成反應(yīng)的負(fù)反饋效應(yīng)，不僅抑制了MEP 途徑的下行，也促進(jìn)了三羧酸循環(huán)，使得相應(yīng)的呼吸和代謝能力隨之增強(qiáng)。因此，二氧化碳排放量增加，鄰苯二甲酸異丁正壬酯因代謝增強(qiáng)而消失。

該實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象為首次發(fā)現(xiàn)，尚未有相關(guān)的研究報(bào)道，因此該研究可以為細(xì)菌代謝途徑的分析和改造提供一定的理論基礎(chǔ)和參考價(jià)值。