任柯昱，陶 玲

信陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院檢驗(yàn)技術(shù)學(xué)院，河南 信陽(yáng) 464000

不動(dòng)桿菌屬于人獸共患致病菌，在世界范圍內(nèi)分布廣泛，多寄生在豬、牛、羊、駱駝等動(dòng)物以及人類的腸道中。該菌可以引起人和動(dòng)物的細(xì)菌性腹瀉、腸炎及腸毒血癥等疾病，其中以仔豬腹瀉最為嚴(yán)重。近年來(lái)，隨著生豬養(yǎng)殖規(guī)?；图s化水平的不斷提高，生豬養(yǎng)殖過(guò)程中由豬腸道疾病造成的經(jīng)濟(jì)損失逐年增加，尤其是由豬源不動(dòng)桿菌所引起的腹瀉給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。鑒于分子生物學(xué)技術(shù)快速、簡(jiǎn)便、無(wú)創(chuàng)等特點(diǎn)，可以將其用于豬源不動(dòng)桿菌的快速診斷和監(jiān)測(cè)，因此，本文采用PCR檢測(cè)法對(duì)豬源不動(dòng)桿菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定并研究其致病性和致病機(jī)制。

1 豬源不動(dòng)桿菌

1.1 豬源不動(dòng)桿菌概述

豬源不動(dòng)桿菌是一種可以引起豬腸炎和腹瀉的細(xì)菌，它屬于不動(dòng)桿菌屬，是一類革蘭氏陰性桿狀細(xì)菌[2]。豬源不動(dòng)桿菌廣泛存在于自然環(huán)境中，包括土壤和水源中等。豬源不動(dòng)桿菌通常以潛伏感染的形式存在于豬體內(nèi)，特別是集中在生殖器官、淋巴節(jié)點(diǎn)、脾臟和關(guān)節(jié)等部位。被感染的豬可能會(huì)表現(xiàn)出發(fā)熱、食欲不振、消瘦、流產(chǎn)、不育等癥狀。傳播途徑包括直接接觸被感染的動(dòng)物、攝入被污染的食物或水源，以及通過(guò)胎盤和分娩過(guò)程傳染給后代。人類與感染的豬接觸、食用未經(jīng)充分加熱處理的感染性動(dòng)物產(chǎn)品或通過(guò)呼吸道都會(huì)感染豬源不動(dòng)桿菌。

1.2 豬源不動(dòng)桿菌的致病性

豬源不動(dòng)桿菌的致病性主要與其產(chǎn)生的一些特定致病因子和毒力機(jī)制有關(guān)。致病因子包括細(xì)菌膠囊、細(xì)菌腺毒素、附著因子以及分泌的其他蛋白質(zhì)等。這些因子可以幫助菌株抵抗宿主的免疫系統(tǒng)，使菌株進(jìn)入宿主細(xì)胞并引發(fā)其病理反應(yīng)[3]。此外，不同菌株之間的遺傳變異和基因調(diào)控也會(huì)影響其致病性，這是因?yàn)椴煌昕赡芫哂胁煌闹虏∫蜃咏M合和毒力水平。

2 豬源不動(dòng)桿菌分子生物學(xué)鑒定

2.1 鑒定準(zhǔn)備

在對(duì)豬源不動(dòng)桿菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定之前，需要準(zhǔn)備以下樣品和PCR 儀器。

樣品：收集需要進(jìn)行鑒定的豬源不動(dòng)桿菌樣品，可以是豬體內(nèi)的組織樣品（如腸道組織）、糞便樣品、尿液樣品等。設(shè)定良好的保存條件以保障樣品的新鮮度，避免樣品受到污染或降解。本研究收集的是A市Q 養(yǎng)殖場(chǎng)所養(yǎng)殖的豬的腸道組織及糞便。

DNA 提取試劑盒：用于從樣品中提取豬源不動(dòng)桿菌的DNA。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室所選用的試劑盒，按照說(shuō)明書上的步驟進(jìn)行DNA 提取。

PCR 管和試劑：準(zhǔn)備PCR 試劑盒，包括引物、酶、緩沖液等。

PCR 儀器：使用PCR 儀器進(jìn)行PCR 反應(yīng)。確保PCR 儀器的工作狀態(tài)正常，并設(shè)置實(shí)驗(yàn)所需參數(shù)。

除了上述準(zhǔn)備工作外，還需要注意：①實(shí)驗(yàn)室操作。在開(kāi)展PCR 實(shí)驗(yàn)之前，要確保實(shí)驗(yàn)室的整潔和衛(wèi)生，避免樣品受到外源性DNA 污染。最好專門設(shè)置一個(gè)凈化區(qū)用于進(jìn)行PCR 反應(yīng)。②引物設(shè)計(jì)。根據(jù)豬源不動(dòng)桿菌的基因序列，選擇合適的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，以確保引物的特異性和準(zhǔn)確性。③PCR條件優(yōu)化。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，優(yōu)化PCR 反應(yīng)的溫度、時(shí)間和循環(huán)次數(shù)等參數(shù)，以提高PCR 擴(kuò)增效率和特異性。④陰性對(duì)照。在PCR 反應(yīng)中設(shè)置陰性對(duì)照，檢測(cè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的污染情況。

2.2 鑒定方法

PCR（聚合酶鏈反應(yīng)）是一種常用的分子生物學(xué)技術(shù)，可用于快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)和鑒定病原體。PCR鑒定方法的基本步驟可分為以下六步：第一，提取模板DNA；第二，引物設(shè)計(jì)；第三，準(zhǔn)備PCR 反應(yīng)體系；第四，設(shè)置PCR 擴(kuò)增條件；第五，PCR 擴(kuò)增反應(yīng)；第六步，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

PCR 鑒定方法具有快速、敏感、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于微生物學(xué)研究、臨床診斷、食品安全監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域。在豬源不動(dòng)桿菌的鑒定中，PCR可以通過(guò)擴(kuò)增特定基因片段或DNA 序列來(lái)確定是否存在該病原體，并且可以與其他相關(guān)方法結(jié)合使用，以進(jìn)一步提高鑒定的準(zhǔn)確性和可靠性，PCR 反應(yīng)體系如表1 所示。

表1 PCR 反應(yīng)體系

反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35 次，72℃繼續(xù)延伸10 min，4 ℃無(wú)限循環(huán)。

2.3 鑒定結(jié)果

鑒定結(jié)果如表2 所示。

表2 PCR 鑒定結(jié)果

在本次樣品PCR 分子生物學(xué)鑒定中，共鑒定出3 株洛非不動(dòng)桿菌、5 株Towneri 不動(dòng)桿菌、1 株瓊氏不動(dòng)桿菌。

3 豬源不動(dòng)桿菌的致病性機(jī)制研究

3.1 豬源不動(dòng)桿菌的致病因子和毒力機(jī)制研究

研究豬源不動(dòng)桿菌的致病因子和毒力機(jī)制對(duì)于預(yù)防和控制該病菌的傳播具有重要意義。首先，豬源不動(dòng)桿菌的致病因子包括外毒素和內(nèi)毒素。其中最重要的外毒素是豬源不動(dòng)桿菌外毒素1（ApxI）、豬源不動(dòng)桿菌外毒素2（ApxII）和豬源不動(dòng)桿菌外毒素3（ApxIII）。這些外毒素可以通過(guò)破壞宿主細(xì)胞膜的完整性，引起組織壞死、細(xì)胞溶解和炎癥反應(yīng)，從而造成感染豬源不動(dòng)桿菌的嚴(yán)重癥狀。其次，豬源不動(dòng)桿菌的毒力機(jī)制主要包括菌體附著、菌體入侵和菌體生長(zhǎng)。豬源不動(dòng)桿菌通過(guò)其表面結(jié)構(gòu)與宿主細(xì)胞的表面結(jié)構(gòu)進(jìn)行特異性結(jié)合，能夠?qū)崿F(xiàn)菌體的附著，進(jìn)而入侵宿主細(xì)胞。在菌體入侵過(guò)程中，豬源不動(dòng)桿菌可以利用一些細(xì)菌的分泌系統(tǒng)和表面分子將毒力因子注入宿主細(xì)胞內(nèi)部。這些毒力因子產(chǎn)生的外毒素會(huì)破壞宿主細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞溶解和壞死。

為了研究豬源不動(dòng)桿菌的致病因子和毒力機(jī)制，可以通過(guò)蛋白質(zhì)分離和鑒定技術(shù)來(lái)確定豬源不動(dòng)桿菌所產(chǎn)生的外毒素和內(nèi)毒素的類型及功能；可以使用免疫組織化學(xué)或免疫熒光染色技術(shù)來(lái)觀察豬源不動(dòng)桿菌與宿主細(xì)胞之間的相互作用和內(nèi)毒素的分布情況；可以利用細(xì)胞培養(yǎng)和小鼠感染模型，來(lái)評(píng)估豬源不動(dòng)桿菌的致病性與毒力；還可以通過(guò)基因敲除或突變技術(shù)，來(lái)研究豬源不動(dòng)桿菌致病因子和毒力機(jī)制中重要的基因與蛋白質(zhì)。

3.2 菌株間遺傳變異和基因調(diào)控對(duì)致病性的影響

豬源不動(dòng)桿菌是一種具有重要致病性的病原菌，其致病性機(jī)制涉及菌株間遺傳變異和基因調(diào)控的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。研究菌株間遺傳變異和基因調(diào)控對(duì)豬源不動(dòng)桿菌的致病性有利于深入了解該菌株的致病機(jī)制。首先，菌株間遺傳變異對(duì)于豬源不動(dòng)桿菌的致病性具有顯著影響。不同菌株之間存在著遺傳多樣性，導(dǎo)致其在毒力因子表達(dá)和傳播方面存在顯著差異。對(duì)此，相關(guān)人員可以利用分子生物學(xué)技術(shù)，如PCR 和測(cè)序等方法，比較不同菌株的基因組，找出與其致病性相關(guān)的基因差異。通過(guò)研究這些功能和調(diào)控機(jī)制的差異，可以確定菌株間遺傳變異對(duì)于豬源不動(dòng)桿菌的致病性影響的潛在機(jī)制。其次，基因調(diào)控也對(duì)豬源不動(dòng)桿菌的致病性具有關(guān)鍵作用。豬源不動(dòng)桿菌的基因表達(dá)受多種調(diào)控機(jī)制影響，如轉(zhuǎn)錄因子、非編碼RNA 和環(huán)境響應(yīng)等。相關(guān)人員可以通過(guò)基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)等方法，來(lái)識(shí)別并分析與豬源不動(dòng)桿菌致病性有關(guān)的調(diào)控元件和調(diào)控因子；可以利用RNA 測(cè)序等技術(shù)，揭示豬源不動(dòng)桿菌在不同環(huán)境和宿主條件下的基因表達(dá)模式與調(diào)控機(jī)制。此外，還可以通過(guò)基因敲除、基因突變和基因表達(dá)調(diào)控等技術(shù)，來(lái)驗(yàn)證調(diào)控因子對(duì)豬源不動(dòng)桿菌致病性的影響。

3.3 對(duì)宿主免疫系統(tǒng)的影響和逃逸機(jī)制

豬源不動(dòng)桿菌可以通過(guò)多種途徑來(lái)影響和躲避宿主免疫系統(tǒng)的攻擊，從而成功感染宿主并引發(fā)疾病。第一，免疫抑制因子。豬源不動(dòng)桿菌可以產(chǎn)生各種用于抑制宿主免疫系統(tǒng)的因子，如細(xì)菌素、毒素等。這些因子能夠抑制宿主免疫細(xì)胞的增殖和功能的發(fā)揮，干擾宿主的免疫應(yīng)答過(guò)程，并削弱宿主免疫系統(tǒng)的攻擊能力。第二，細(xì)菌致病因子。豬源不動(dòng)桿菌能夠通過(guò)產(chǎn)生多種致病因子來(lái)干擾宿主免疫系統(tǒng)的正常功能。例如，菌株中的一些蛋白質(zhì)能夠干擾宿主免疫細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而抑制免疫細(xì)胞的活化和免疫應(yīng)答。第三，對(duì)抗黏液和免疫球蛋白。豬源不動(dòng)桿菌表面的多糖結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)能夠與宿主分泌的黏液和免疫球蛋白相結(jié)合，形成膜上免疫防御屏障，抵擋免疫細(xì)胞的接觸和攻擊。第四，菌株間的遺傳變異和基因調(diào)控。不同菌株之間存在遺傳變異，這些變異可能會(huì)影響到豬源不動(dòng)桿菌的致病性及其對(duì)宿主免疫系統(tǒng)的逃逸能力。相關(guān)人員需要通過(guò)對(duì)比不同菌株的基因組和基因表達(dá)模式來(lái)探索這些差異，并揭示菌株遺傳變異和基因調(diào)控對(duì)于豬源不動(dòng)桿菌致病性機(jī)制的影響。

4 結(jié)語(yǔ)

豬源不動(dòng)桿菌是一種感染豬類的主要致病菌，可以引起布魯氏菌病。布魯氏菌病是一種廣泛分布于世界范圍內(nèi)的人獸共患傳染病，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)和公共衛(wèi)生造成了重大威脅。研究豬源不動(dòng)桿菌的分子生物學(xué)特征及其致病性對(duì)于布魯氏菌病的防控、人畜健康以及分子鑒定技術(shù)的推廣具有重要意義。本文主要采用PCR 檢測(cè)技術(shù)對(duì)豬源不動(dòng)桿菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定并研究其致病性和致病機(jī)制，希望可以為公共衛(wèi)生防控工作提供參考。