張文艷，李俊杰，艾玲松，李茂東，趙仲霞，師 睿*

1.昭通學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，云南 昭通 657000；2.云南三鑫職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)藥健康學(xué)院，云南 文山 663000

天然防腐劑具有良好的廣譜抑菌性，且安全無(wú)毒、無(wú)味，是理想的食品防腐劑的必要條件[1]?；ń分械狞S酮[2]、揮發(fā)油和生物堿類(lèi)[3]等多種活性物質(zhì)能有效抑制食品中常見(jiàn)微生物的生長(zhǎng)與繁殖。本文擬對(duì)昭通金江青花椒總生物堿的體外抑菌活性進(jìn)行研究，以期為新型天然防腐劑的開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為金江青花椒的精深加工提供理論依據(jù)，共同助力金江青花椒產(chǎn)地脫貧攻堅(jiān)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

青花椒：昭通市魯?shù)榭h花椒，烘干至恒重，粉碎后過(guò)0.250 mm 孔徑篩，于干燥器中避光保存；營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基、PBS 緩沖液，Solarbio；金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基，海博生物；ATP 含量測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所；TD-400 臺(tái)式低速自動(dòng)平衡離心機(jī)，上海佑科儀器儀表有限公司；DHP-9082 電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；P1000 型移液槍?zhuān)簖埮d創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）股份公司；PT-3502 C 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，北京普天新橋技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 青花椒總生物堿的提取制備

參照張文艷[4]、石雪萍[5]、鄭丹等[6]的酸性染料比色法提取花椒生物堿。將青花椒生物堿提取后濃縮成浸膏，質(zhì)量濃度配置為800 mg/mL，過(guò)濾除菌后置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌種的活化及菌懸液的制備

在無(wú)菌環(huán)境下，將凍存的金黃色葡萄球菌S.aureus 接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，在37 ℃，150 r/min 的條件下活化3 次，直至達(dá)到最佳生長(zhǎng)狀態(tài)，然后備用。參考張可鑫等[7]的方法，采用二倍稀釋法將S.aureus 制成108 CFU/mL 的菌懸液備用，并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 濾紙片法測(cè)定抑菌圈直徑

取1 mL 菌懸液涂于營(yíng)養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基后將6 mm 濾紙片按梅花形貼在培養(yǎng)基表面，使濾紙片和培養(yǎng)基表面完全接觸。吸取15～20 uL 青花椒總生物堿提取液滴在濾紙片表面，對(duì)照組為無(wú)菌蒸餾水，每組三個(gè)平行。在30 ℃的條件下放置24 h 后取出觀察，采用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑，求其平均值。藥敏試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)[8]：抑菌圈直徑≥20 mm 為高敏，15 mm≤抑菌圈直徑＜20 mm 為中敏，10 mm≤抑菌圈直徑＜15 mm 為低敏，10 mm 以下為不敏感。

1.2.4 最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定

采用二倍稀釋法，以800 mg/mL 的青花椒提取物為母液，S.aureus 菌懸液菌液為稀釋液，稀釋青花椒提取物，使青花椒提取物的最終質(zhì)量濃度分別為6.25、12.5、25、50、100 mg/mL。因培養(yǎng)基和青花椒提取物均具有一定的吸光性，設(shè)置以下組別：空白對(duì)照為培養(yǎng)基，陰性對(duì)照為不加藥物的菌液，藥物對(duì)照組為無(wú)菌水加入等濃度的提取物，所有組別均設(shè)置三個(gè)平行組，于30 ℃條件下培養(yǎng)24 h 后，用酶標(biāo)儀測(cè)定600 nm 波長(zhǎng)處的吸光度。

1.2.5 生長(zhǎng)抑制曲線的測(cè)定

參考1.2.4 的方法，使藥物終濃度為1/8×MIC和1/4×MIC，于30 ℃條件下培養(yǎng)24 h，每隔2 h 在600 nm 下檢測(cè)其吸光值，并繪制其生長(zhǎng)抑制曲線。

1.2.6 ATP 含量的測(cè)定

將青花椒總生物堿按1×MIC 的比例加入對(duì)數(shù)期的金黃色葡萄球菌菌懸液培養(yǎng)基中。以無(wú)菌水作空白對(duì)照，將菌液和培養(yǎng)基按1∶1 比例混勻后作為陽(yáng)性對(duì)照。設(shè)定取樣時(shí)間間隔為1 h[9]，將取出的樣品在6 000 r/min 下離心10 min，用PBS 洗滌并重懸菌體三次，接著，在300 W，間隔1.1 s 的條件下破碎細(xì)胞，隨后于8 000 r/min 冷凍離心10 min，吸取上清液，最后，參照ATP 測(cè)試盒的測(cè)定方法[10]檢測(cè)樣品中ATP 的含量。

1.2.7 青花椒總生物堿對(duì)S.aureus 抑菌穩(wěn)定性的研究

以S.aureus 為指示菌，使用青花椒總生物堿質(zhì)量濃度為800 mg/mL，進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)。參考1.2.3 的方法，檢測(cè)在不同處理?xiàng)l件下青花椒總生物堿對(duì)S.aureus 抑菌活性的影響。

1.2.7.1 溫度對(duì)青花椒總生物堿抑菌穩(wěn)定性的影響

參考羅曉東等[11]的方法，實(shí)驗(yàn)組把青花椒總生物堿分別放在以下溫度水浴30 min：40、50、60、70、80、90、100、121 ℃，對(duì)照組為30 ℃，每組三個(gè)平行。

1.2.7.2 金屬離子對(duì)青花椒總生物堿抑菌穩(wěn)定性的影響

參考宋姍姍等[12]的研究方法，實(shí)驗(yàn)組將青花椒總生物堿分別浸泡在0.1 mol/L-的NaCl、KCl 和CaCl2溶液中3 h 后進(jìn)行抑菌圈實(shí)驗(yàn)，對(duì)照組則使用未經(jīng)處理的青花椒總生物堿。

1.2.7.3 pH 對(duì)青花椒總生物堿抑菌穩(wěn)定性的影響

參考原江鋒等[13]的方法，使用1 mol/L HCl 和1 mol/L NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH。實(shí)驗(yàn)組將青花椒總生物堿分別調(diào)節(jié)為以下pH：4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0；陽(yáng)性對(duì)照為未做處理的青花椒總生物堿；空白對(duì)照為1 mol/L HCl 和1 mol/L NaOH 溶液。

1.2.7.4 紫外線對(duì)青花椒總生物堿抑菌穩(wěn)定性的影響

實(shí)驗(yàn)組用30 W 紫外燈分別照射10、20、30、40、50、60、70 min 青花椒總生物堿，對(duì)照組為未做處理的青花椒總生物堿。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2016、SPSS 26 統(tǒng)計(jì)軟件和Graphpad Prism 6 軟件進(jìn)行處理與分析，結(jié)果以（±s）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌圈直徑測(cè)定

由表1，圖1 可知，800 mg/mL 的青花椒總生物堿作用于S.aureus 后，抑菌圈平均直徑為22.75 ±1.54 mm，達(dá)到高度敏感，這表明青花椒總生物堿對(duì)金黃色葡萄球菌具有強(qiáng)抑制作用。

圖1 金黃色葡萄球菌抑菌圈

表1 金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑

2.2 最小抑菌濃度（MIC）

由圖2 可知，25 mg/mL 青花椒總生物堿作用于S.aureus 后抑菌率高于90 %，故MIC 值為25 mg/mL。

圖2 青花椒總生物堿對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度

2.3 青花椒總生物堿對(duì)S.aureus 生長(zhǎng)的影響

由圖3 可知，1/4 MIC 和1/8 MIC 青花椒總生物堿作用于S.aureus 后均會(huì)抑制其生長(zhǎng)。

圖3 金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)抑制曲線圖

2.4 金江青花椒總生物堿對(duì)金黃色葡萄球菌ATP含量的影響

ATP 是細(xì)胞能量轉(zhuǎn)換的載體，細(xì)胞的功能隨著其水平的改變而改變。由圖4 可知，隨著青花椒總生物堿作用于S.aureus 時(shí)間的延長(zhǎng)，其中ATP 含量呈降低趨勢(shì)。

圖4 金黃色葡萄球菌中ATP 含量

2.5 青花椒總生物堿對(duì)S.aureus 抑菌穩(wěn)定性的影響

2.5.1 溫度對(duì)青花椒總生物堿抑菌穩(wěn)定性的影響

由表2 可知，隨著溫度的上升，青花椒總生物堿的抑菌效果逐漸下降，說(shuō)明溫度對(duì)其抑菌活性有一定的影響。但從整體來(lái)看，青花椒總生物堿在40 ～90℃仍具有較強(qiáng)的抑菌活性，說(shuō)明青花椒總生物堿的抑菌效果不易受溫度影響。

表2 不同溫度處理對(duì)青花椒總生物堿抑菌穩(wěn)定性的影響

2.5.2 金屬離子對(duì)青花椒總生物堿抑菌穩(wěn)定性的影響

由表3 可知，不同金屬離子對(duì)青花椒總生物堿抑菌活性的影響較小。

表3 不同金屬離子對(duì)青花椒總生物堿抑菌穩(wěn)定性的影響

2.5.3 pH 對(duì)青花椒總生物堿抑菌穩(wěn)定性的影響

由表4 可知，pH 越高，花椒總生物堿的抑菌效果愈強(qiáng)，在pH=10 時(shí)，抑菌圈直徑達(dá)到了21.08±0.17 mm。且由空白對(duì)照可知，其抑菌效果的增強(qiáng)與單純堿性試劑無(wú)關(guān)。原因可能是，在堿性環(huán)境下花椒總生物堿發(fā)生了協(xié)同效應(yīng)，其抑菌活性大大增強(qiáng)。由此可以證明花椒總生物堿的穩(wěn)定性較好，可在堿性環(huán)境下使用，且抑菌效果更突出。

表4 pH 對(duì)金江花椒總生物堿抑菌穩(wěn)定性的影響

2.5.4 紫外線對(duì)青花椒總生物堿抑菌穩(wěn)定性的影響

如表5 可知，青花椒總生物堿經(jīng)不同時(shí)長(zhǎng)紫外線照射之后，其抑菌效果變化不大，說(shuō)明青花椒總生物堿對(duì)紫外光相對(duì)較穩(wěn)定。

表5 紫外線處理對(duì)花椒總生物堿抑菌穩(wěn)定性的影響

3 結(jié)論

將青花椒總生物堿作用于S.aureus 后，測(cè)定其抑菌圈直徑、MIC 值、生長(zhǎng)抑制曲線、培養(yǎng)液中ATP含量，確定青花椒總生物堿對(duì)S.aureus 的有抑制效果，并檢測(cè)青花椒總生物堿的抑菌穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，青花椒總生物堿作用于金黃色葡萄球菌后，抑菌圈直徑為22.75±1.54 mm，MIC 值為25 mg/mL，生長(zhǎng)明顯受到抑制，且ATP 含量下降；藥物穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果也表明青花椒總生物堿的抑菌穩(wěn)定性較好。綜上所述，青花椒總生物堿對(duì)S.aureus 的生長(zhǎng)繁殖具有顯著的抑制作用，有望依此研發(fā)新型天然抗菌劑。