呂歡歡，劉悅彤，王建萍，呂 毅

西北工業(yè)大學(xué)生命學(xué)院，陜西 西安 710072

細(xì)胞生物學(xué)既是生命科學(xué)的基礎(chǔ)學(xué)科，也是其前沿學(xué)科；對細(xì)胞的研究既是生命科學(xué)的出發(fā)點，又是生命科學(xué)的匯聚點[1]。細(xì)胞是生命活動的基本結(jié)構(gòu)和功能單位。通過細(xì)胞培養(yǎng)可以獲得大量細(xì)胞，并且生物學(xué)、藥學(xué)、醫(yī)學(xué)等諸多領(lǐng)域也都涉及細(xì)胞的研究，所以都離不開細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用，這也進一步凸顯了細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在生物技術(shù)專業(yè)本科生實驗技能培養(yǎng)過程中的重要性[2]。

細(xì)胞培養(yǎng)是開展細(xì)胞生物學(xué)研究的基礎(chǔ)，也是生物學(xué)最基本的實驗操作技術(shù)之一[3]。細(xì)胞培養(yǎng)可分為原代細(xì)胞培養(yǎng)和繼代細(xì)胞培養(yǎng)。本文所研究的原代細(xì)胞培養(yǎng)是指直接從生物體內(nèi)獲取組織或者器官的一部分細(xì)胞進行培養(yǎng)，是獲取細(xì)胞的主要手段，是建立各種細(xì)胞體系的第一步，也是從事組織或細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)研究工作必須掌握的一項基本技術(shù)[4]。

間充質(zhì)干細(xì)胞是中胚層來源的成體干細(xì)胞，具有多向分化和自我更新能力[5-8]。骨髓中間充質(zhì)干細(xì)胞的含量最為豐富，是最先被分離出來的成體干細(xì)胞。骨髓中的間充質(zhì)干細(xì)胞在不同條件下可以誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等，因此被廣泛應(yīng)用于骨相關(guān)疾病的治療[9-10]。掌握骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，了解骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化，有助于為后期利用骨組織工程技術(shù)治療臨床疾病提供理論依據(jù)。

1 教學(xué)設(shè)計

1.1 實驗原理

原代細(xì)胞培養(yǎng)是指直接從動物體內(nèi)獲取所需組織（或器官）的一部分細(xì)胞，經(jīng)分離或消化分散成單個游離細(xì)胞，在體外通過人工培養(yǎng)使其不斷生長繁殖，直到第一次傳代為止。但原代培養(yǎng)的組織由多種成分組成，比較復(fù)雜，一般需要對原代培養(yǎng)細(xì)胞進行傳代，然后再開展后續(xù)實驗。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離方法包括密度梯度離心法、全骨髓貼壁法、骨片消化爬片法等[11-13]。本實驗將運用全骨髓法，根據(jù)干細(xì)胞在低血清培養(yǎng)基中具有貼壁優(yōu)勢的特性，從小鼠股骨和脛骨中獲得全骨髓，通過多次換液得到較純的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。

1.2 實驗材料與設(shè)備

實驗動物：8 周齡C57BL/6J 小鼠。

實驗試劑：DMEM 高糖完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和1%霉素/鏈霉素混合液），75%酒精。

實驗耗材和設(shè)備：倒置顯微鏡、離心機、水浴鍋、CO2培養(yǎng)箱、超凈工作臺、無菌眼科剪刀、眼科鑷子、離心管、紗布、注射器、9 cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿和6 cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿。

1.3 實驗步驟

1.3.1 實驗小鼠骨頭的取材

將小鼠用異氟烷麻醉后，予以頸椎脫臼處死，然后用75%酒精浸泡消毒10 min。將無菌的眼科剪刀、鑷子、紗布、離心管、注射器、培養(yǎng)皿等器材放入超凈工作臺中。在超凈工作臺中，將小鼠平放在9 cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿中，腹部朝上，取出小鼠雙側(cè)長骨包括股骨和脛骨，并剝離附著在長骨上的毛發(fā)和皮膚等（見圖1）。

圖1 實驗小鼠骨頭的取材

1.3.2 制備骨髓收集管

準(zhǔn)備1.5 mL 和0.5 mL 的無菌離心管。將0.1 mL 預(yù)熱的DMEM 完全培養(yǎng)基置于1.5 mL 離心管中，用注射器針頭在0.5 mL 離心管底部扎幾個小孔。將打孔的0.5 mL 離心管放入1.5 mL 離心管中（見圖2）。

圖2 制備骨髓收集管

1.3.3 股骨和脛骨的清理

去除掉附著在長骨上的肌肉組織，用紗布將殘留在長骨上的肌肉擦拭干凈，剪斷長骨，分離股骨和脛骨，并從骨頭中間剪斷，將斷口朝下放在0.5 mL離心管中，將1.5 mL 離心管管蓋剪斷，蓋上0.5 mL離心管的蓋子，用封口膜密封離心管（見圖3）。

圖3 股骨和脛骨的清理

1.3.4 離心收集骨髓

在4 000 r/min 的轉(zhuǎn)速下離心5 min，離心完成后取出0.5 mL 離心管，可以看到股骨和脛骨已經(jīng)泛白，表明股骨和脛骨中的骨髓已經(jīng)離心到了1.5 mL離心管中。取出1.5 mL 離心管中的樣品加入含有完全培養(yǎng)基的新的1.5 mL 離心管中。再將該新的1.5 mL 離心管在1 000 r/min 的條件下離心10 min。離心過程中，準(zhǔn)備好培養(yǎng)皿，并做好標(biāo)記（見圖4）。

1.3.5 培養(yǎng)細(xì)胞

向細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入DMEM 完全培養(yǎng)基。棄去第二次離心后離心管中的上清液，得到培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)皿中，輕輕搖勻，使細(xì)胞在培養(yǎng)皿中均勻分布（見圖5）。在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)期間不得晃動培養(yǎng)皿，以使細(xì)胞充分貼壁。

圖5 細(xì)胞培養(yǎng)

1.3.6 實驗結(jié)果觀察

培養(yǎng)48 h 后，棄去原培養(yǎng)基，加入新鮮的DMEM 完全培養(yǎng)基，之后每隔48 h 換液1 次（見圖6A）。培養(yǎng)至70%～80%融合時（約6～7 d），即可進行細(xì)胞傳代培養(yǎng)（見圖6B）。

圖6 小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)在不同時間點的形態(tài)圖

2 利用小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可開展的實驗

2.1 利用小鼠骨髓間充質(zhì)肝細(xì)胞進行成脂分化

小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞傳代后，當(dāng)細(xì)胞融合到80%以上時，棄去原培養(yǎng)基，向其中添加成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基。成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基為向DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清、1%雙抗、10 ng/mL 胰島素、1 μM地塞米松、0.5 mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤和0.1 mM 吲哚美辛所得。每隔48 h 換液1 次，分化10 d后，在顯微鏡下可以看到較為明顯的脂滴，用油紅O染液對其進行染色。

2.2 利用小鼠骨髓間充質(zhì)肝細(xì)胞進行成骨分化實驗

小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞傳代后，在細(xì)胞融合到80%以上時，棄去原培養(yǎng)基，向其中添加成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基為向DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清、1%雙抗、50 μg/mL 維生素和10 mM β-甘油磷酸鈉所得。每隔48 h 換液1 次，分化10 d 后，在顯微鏡下可以看到較為明顯的礦化結(jié)節(jié)，用5%的茜素紅染液對其進行染色。

2.3 利用小鼠骨髓間充質(zhì)肝細(xì)胞進行成軟骨分化實驗

小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞傳代后，在細(xì)胞融合到80%以上時，棄去原培養(yǎng)基，向其中添加成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基。成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基為向DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清、1%雙抗、0.2 mM 維生素和10 mM β-甘油磷酸鈉所得。每3 d 換液1 次，分化10 d，用甲苯胺藍染液對其進行染色。

3 教學(xué)設(shè)計

3.1 教學(xué)目的

了解原代細(xì)胞培養(yǎng)原理；熟悉原代細(xì)胞的培養(yǎng)方法與過程；掌握骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)方式；掌握無菌操作；了解骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用情況。

3.2 教學(xué)重點

在本次實驗教學(xué)過程中，采用離心法從股骨和脛骨中獲得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；同時，也可以采用使用針管沖洗股骨和脛骨骨髓以獲得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。無論采用哪一種方法，都要注意不能破壞細(xì)胞的完整性。獲得細(xì)胞后，基于先前在實驗課學(xué)得的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進行繼代培養(yǎng)，從而使同學(xué)進一步掌握并鞏固細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。細(xì)胞培養(yǎng)工作最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)就是注意無菌操作，防止細(xì)胞在培養(yǎng)過程中受到污染。原代細(xì)胞培養(yǎng)要從器官或者組織中直接獲取細(xì)胞，因此，材料的消毒要非常嚴(yán)格；而且，在整個取材過程和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離過程中都要注意無菌操作。

3.3 教學(xué)安排

開課前，授課教師準(zhǔn)備實驗耗材試劑和實驗小鼠。

本實驗共安排4 課時，學(xué)生在實驗課堂上需要完成實驗小鼠股骨和脛骨的取材、骨髓收集管的制備、骨頭附屬物的剝離、離心收集骨髓、培養(yǎng)細(xì)胞等步驟。實驗課結(jié)束之后，學(xué)生可自行觀察細(xì)胞的生長情況。

另外，學(xué)生可根據(jù)自己的興趣偏好，利用培養(yǎng)得到的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進行細(xì)胞傳代、凍存等細(xì)胞培養(yǎng)基本實驗技術(shù)的練習(xí)，以鞏固細(xì)胞培養(yǎng)操作；或者利用培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進行成骨、成脂、成軟骨分化實驗；還可以設(shè)計并開展化學(xué)或者物理刺激對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化影響的研究等綜合實驗。

3.4 教學(xué)意義

細(xì)胞生物學(xué)是生命科學(xué)相關(guān)專業(yè)的實踐類專業(yè)基礎(chǔ)課，是一門研究和解釋細(xì)胞基本生命活動規(guī)律的學(xué)科。本實驗在進行細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)上進行，通過骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)，不僅能夠使同學(xué)們掌握原代細(xì)胞培養(yǎng)的基本原理和方法，也能夠讓學(xué)生更加深刻地認(rèn)識到骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的多潛能性分化。并且，在達到原代細(xì)胞培養(yǎng)基本實驗教學(xué)目的的基礎(chǔ)上，將科研內(nèi)容引入實驗教學(xué)中，鼓勵學(xué)生開展以“骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化研究”為主題的設(shè)計性實驗，還能夠激發(fā)學(xué)生的多元實驗設(shè)計思維和開展綜合性創(chuàng)新實驗的動力。