郭心怡，林 燕*，曹長雷，陳文俊

1.華蘭生物工程重慶有限公司，重慶 涪陵 408100；2.長江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，重慶 涪陵 408100

制藥企業(yè)的潔凈生產(chǎn)環(huán)境作為一種典型的受控環(huán)境，其運(yùn)行和管理占據(jù)著非常重要的地位。

近年來，藥品安全突發(fā)事件頻繁發(fā)生，這些事件與潔凈室的微生物控制存在著極為密切的聯(lián)系。2011年實(shí)施的《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（2010年修訂）》修訂了無菌藥品附錄[1]，對制藥潔凈生產(chǎn)環(huán)境提出了更加嚴(yán)格的要求，尤其在潔凈環(huán)境監(jiān)測的內(nèi)容納入2015年版《中國藥典》[2]附錄之后，法規(guī)對潔凈環(huán)境監(jiān)測的要求變得越來越高，這就要求制藥企業(yè)，尤其是無菌制劑企業(yè)要投入更多的人力和物力對生產(chǎn)的潔凈環(huán)境進(jìn)行有效的監(jiān)控，從而達(dá)到提高產(chǎn)品質(zhì)量的目的。

1 材料與儀器

1.1 主要試劑

革蘭氏染色液、4%氫氧化鉀水溶液、氧化酶檢測指示條、3%過氧化氫溶液、API 鑒定試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑、基因組DNA 提取試劑盒。

1.2 主要儀器

BSC-1000-Ⅱ-A2 生物安全柜、培養(yǎng)箱、顯微鏡、VITEK 2 COMPACT 全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)、全自動(dòng)快速微生物檢測系統(tǒng)、RiboPrinter 全自動(dòng)微生物基因指紋鑒定系統(tǒng)、梯度PCR 儀和核酸微量分析儀。

2 方法與結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)方法

收集從藥品生產(chǎn)潔凈區(qū)、制藥用水系統(tǒng)、原輔材料等環(huán)境中檢出的微生物，將其分離純化后采用生化鑒定技術(shù)和基因型鑒定技術(shù)進(jìn)行鑒定，然后保存并建立環(huán)境菌庫，定期進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，分析各板塊微生物的分布情況及變化，采取相應(yīng)的措施，為微生物污染控制提供指導(dǎo)[3]。

2.2 完善性能測試

統(tǒng)計(jì)無菌灌裝模擬試驗(yàn)潔凈環(huán)境的微生物數(shù)據(jù)，根據(jù)微生物的種類和占比，選取2 種占比高且分屬不同種屬的微生物作為無菌灌裝模擬中培養(yǎng)基促生長試驗(yàn)的指示菌。環(huán)境中微生物流動(dòng)性強(qiáng)且高級別潔凈環(huán)境中微生物的含量極低，可根據(jù)每年微生物的變化調(diào)整指示菌，以便于更全面地監(jiān)測培養(yǎng)基對于環(huán)境中微生物的促生長能力。2020年無菌灌裝模擬試驗(yàn)中增加了科氏葡萄球菌科氏亞種和巨大芽孢桿菌作為環(huán)境指示菌，2021年無菌灌裝模擬試驗(yàn)中選擇表皮葡萄球菌和巨大芽孢桿菌作為環(huán)境指示菌（見表1、表2）。

表1 2020年潔凈環(huán)境檢出的微生物占比

表2 2021年潔凈環(huán)境檢出的微生物占比

2.3 消毒劑效果評價(jià)

統(tǒng)計(jì)潔凈環(huán)境的微生物數(shù)據(jù)，可知環(huán)境中微生物占比最高的為葡萄球菌屬，其次為芽孢桿菌屬。根據(jù)微生物的種類和占比，選取科氏葡萄球菌科氏亞種（Staphylococcus cohniisubsp.cohnii）、阿爾萊特葡萄球菌（Staphylococcus arlettae）、少動(dòng)鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas paucimobilis）、 云南微球菌（Micrococcus yunnanensis）、 克勞氏芽孢桿菌（Bacillus clausii）、蕈狀芽孢桿菌（Bacillus mycodes）作為測試菌株；消毒劑選用常見的75%乙醇、0.2%新潔爾滅溶液和0.05%的84 消毒液；將消毒液與高濃度的測試菌株作用1～15 min，發(fā)現(xiàn)常用消毒液對無芽孢的污染菌的消殺效果良好，而對含芽孢的污染菌的消殺效果不理想?；诃h(huán)境中芽孢桿菌屬微生物占比較高，且該類微生物耐極端環(huán)境能力強(qiáng)的特性，選取7.9%過氧化氫殺孢子劑對芽孢桿菌進(jìn)行消毒效果測試。結(jié)果表明7.9%過氧化氫殺孢子劑對含芽孢的污染菌的消殺效果良好（結(jié)果見表3、表4）。

表3 6 種測試菌株消毒測試效果

2.4 環(huán)境微生物污染控制

結(jié)合消毒劑效果試驗(yàn)結(jié)果，對人員、設(shè)備和房間清潔消毒程序進(jìn)行微生物調(diào)查，優(yōu)化程序，采取嚴(yán)格的管理措施，并針對空間增設(shè)定期的過氧化氫熏蒸。經(jīng)過1年的控制，觀察發(fā)現(xiàn)微生物檢出率和種類明顯下降，特別是人源的G（+）球菌和難消殺的G（+）芽孢桿菌作為環(huán)境微生物控制的難點(diǎn)得到了顯著的控制，降低了微生物的污染。微生物的檢出率和種類數(shù)對比趨勢見圖1、圖2。

圖1 微生物檢出率對比

圖2 微生物種類數(shù)對比

2.5 制藥用水系統(tǒng)質(zhì)量控制

制藥用水系統(tǒng)中的微生物主要來源于純化水系統(tǒng)。對其中微生物的種類和占比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[4]，發(fā)現(xiàn)主要為少動(dòng)鞘氨醇單胞菌和皮氏羅爾斯頓氏菌（見表5）。隨著企業(yè)對水系統(tǒng)質(zhì)量控制要求的不斷提高，2020—2021年持續(xù)監(jiān)控?cái)?shù)據(jù)顯示菌落數(shù)正在穩(wěn)步下降。通過對數(shù)據(jù)進(jìn)行評估分析，可知提高對純化水行動(dòng)限控制的標(biāo)準(zhǔn)，可以優(yōu)化純化水系統(tǒng)質(zhì)量管理。

表5 2020—2021年持續(xù)監(jiān)控?cái)?shù)據(jù)

2.6 生產(chǎn)工藝中微生物溯源

對原料袋表面清洗消毒調(diào)查中微生物的種類和占比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)其主要為少動(dòng)鞘氨醇單胞菌，這種菌是廣泛存在于水源和環(huán)境中的微生物。結(jié)合原料袋表面清洗消毒工藝分析：微生物的主要來源與消毒效果、原料袋表面清洗水污染或帶入有很大的關(guān)系。應(yīng)當(dāng)聯(lián)合生產(chǎn)部、質(zhì)量保證部啟動(dòng)微生物溯源調(diào)查，優(yōu)化消毒劑、消毒方式、清洗消毒工藝，并挖掘根本原因，據(jù)此制定有效的控制措施，持續(xù)監(jiān)控并加以改進(jìn)（表6），加大對微生物污染的控制力度。

表6 2020—2021年持續(xù)監(jiān)控?cái)?shù)據(jù)

3 結(jié)論

如何對生產(chǎn)環(huán)境中微生物污染的控制進(jìn)行有效監(jiān)控，是制藥企業(yè)需要應(yīng)對的一個(gè)難題，這就需要其建立一套科學(xué)、嚴(yán)格的監(jiān)督管理模式，從建立環(huán)境監(jiān)測計(jì)劃、收集、分離、鑒別環(huán)境污染菌以及鑒別數(shù)據(jù)的應(yīng)用分析等方面入手實(shí)現(xiàn)對潔凈環(huán)境中微生物污染的有效監(jiān)控，以保證潔凈環(huán)境處于生產(chǎn)所需的受控狀態(tài)。

建立環(huán)境的監(jiān)測計(jì)劃，收集、分離、鑒別環(huán)境污染菌和鑒別數(shù)據(jù)的應(yīng)用分析，可以找出生產(chǎn)中存在的微生物污染情況及其規(guī)律，從而更好地對生產(chǎn)過程進(jìn)行控制，以滿足藥品GMP 的嚴(yán)格監(jiān)管要求。首先，企業(yè)可以對通過生產(chǎn)潔凈環(huán)境監(jiān)控建立起的菌庫數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和統(tǒng)計(jì)，從而為制藥企業(yè)的相關(guān)工藝驗(yàn)證（例如無菌灌裝模擬試驗(yàn)、消毒劑效果評價(jià)等）提供環(huán)境菌和有效的評價(jià)；其次，可以根據(jù)菌庫數(shù)據(jù)和微生物溯源對制藥的生產(chǎn)過程進(jìn)行微生物風(fēng)險(xiǎn)分析，及時(shí)發(fā)現(xiàn)異常趨勢，并采取有效的措施，降低微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)，提高質(zhì)量管理體系的有效性[5]；最后，持續(xù)不斷地對環(huán)境菌庫進(jìn)行更新補(bǔ)充，形成動(dòng)態(tài)管理的環(huán)境菌庫，能夠?yàn)闈崈舡h(huán)境中的微生物控制提供有效的保障。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，對制藥潔凈生產(chǎn)環(huán)境進(jìn)行監(jiān)控、研究并建立環(huán)境菌庫，在實(shí)際生產(chǎn)過程中非常有必要，發(fā)揮的作用也是強(qiáng)大且有效的。