卞振華 張文明 唐靜月 胡敏敏 陳曉偉 袁曉航 陸兔林

(1 南京中醫(yī)藥大學無錫附屬醫(yī)院,無錫,214071; 2 南京中醫(yī)藥大學藥學院,南京,210023)

慢性腎小球腎炎(Chronic Glomerulonephritis,CGN)是一種以蛋白尿、水腫、高血壓、血尿為特征的炎癥免疫性疾病[1]。CGN發(fā)病隱秘、病理類型復雜、病情反復難愈,若得不到有效治療將逐漸惡化為腎纖維化、慢性腎衰竭、終末期腎病,嚴重危害患者的生命質(zhì)量[2]。目前,西醫(yī)主要用腎素-血管緊張素系統(tǒng)抑制劑降低尿蛋白、控制血壓來緩解病情的進展,但療程長、易復發(fā),療效并不理想,激素和免疫抑制劑可改善CGN癥狀,但不良反應明顯[3]。中醫(yī)認為CGN以腎虛為本,濕熱痰瘀為標,久病必虛,久病入絡。南京中醫(yī)藥大學無錫附屬醫(yī)院腎內(nèi)科馬濟佩主任以益腎固絡法遣方用藥,創(chuàng)立益腎固絡合劑(原葆腎合劑)(蘇藥制備字Z20210018000),具有益腎固絡、健脾利濕之功效,主治早中期CGN,臨床應用30余年,臨床及基礎(chǔ)研究顯示,益腎固絡合劑可明顯減少尿蛋白、血清肌酐(Serum Creatinine,Scr)及尿素氮(Blood Urea Nitrogen,BUN)水平,改善CGN癥狀[4-6]。中藥化學成分多樣,功效機制復雜,是目前研究的重點和難點。因此,闡明益腎固絡合劑治療CGN的作用機制對其創(chuàng)新中藥的研發(fā)以及臨床應用具有重要價值。

本研究采用超高效液相色譜-質(zhì)譜(Ultra-performance Liquid Chromatography-mass Spectrometry,UPLC-MS)代謝組學技術(shù),從尿液代謝層面分析益腎固絡合劑治療CGN的代謝標志物及代謝通路;并結(jié)合生物網(wǎng)絡分析策略,構(gòu)建益腎固絡合劑治療CGN的整體調(diào)控生物網(wǎng)絡,進一步系統(tǒng)識別潛在靶點和關(guān)鍵通路,揭示益腎固絡合劑治療CGN的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 雄性,8周齡斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley,SD)大鼠32只,體質(zhì)量180～220 g,購自于上海市計劃生育科學研究所實驗動物經(jīng)營部,許可證號SCXK(滬)2018-0006。動物飼養(yǎng)環(huán)境:溫度為(24±2)℃、濕度為(60±5)%,自由喂食和飲水。本研究通過倫理委員會審批(倫理審批號:SWJWDW2021060201)。

1.1.2 藥物 益腎固絡合劑(南京中醫(yī)藥大學無錫附屬醫(yī)院制劑室,批號:20201221),處方中的飲片包括芡實、黃芪、薏苡根、覆盆子、金櫻子、石韋、僵蠶,以上飲片均來自蘇州天靈中藥飲片有限公司,經(jīng)南京中醫(yī)藥大學中藥炮制工程中心陸兔林教授鑒定均符合《中華人民共和國藥典》2020年版或《上海市中藥飲片炮制規(guī)范》2018年版標準,飲片信息見表1,課題組前期對該制劑的制備工藝及質(zhì)量控制進行了研究[7-8]。

1.1.3 試劑與儀器 牛血清白蛋白(北京索萊寶公司,批號:918X051),碳二亞胺鹽酸鹽(上海阿拉丁公司,批號:G2002058),無水乙二胺(濟南實用精細化工廠,批號:421308),弗氏不完全佐劑(MP Biomedicals公司,美國,批號:07413),戊巴比妥鈉(廣東臺城制藥有限公司,批號:030415),氯沙坦鉀(Merk制藥公司,英國,批號:T023363),超純水由Milli-Q型超純水器制備,乙腈、甲酸為色譜純,其余試劑為分析純;超高效液相色譜儀(島津株式會社,日本,型號:LC-30A),質(zhì)譜儀(AB SCIEX公司,美國,型號:Triple TOF 5600+),真空冷凍干燥機(上海利聞科學儀器有限公司,型號:FD-1A-50),全自動生化分析儀(Beckman Coulter公司,美國,型號:AU5800),低溫高速離心機(賽默飛世爾科技公司,美國,型號:Sorvall Legend Micro 21R),全自動特定蛋白分析儀(博士泰公司,西班牙,型號:BA400)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 SD大鼠適應性喂養(yǎng)7 d,隨機分為正常組、模型組、陽性藥組、益腎固絡合劑組,每組8只。制備陽離子化牛血清白蛋白(Cationic Bovine Serum Albumin,C-BSA):依據(jù)Border法[9-10],取無水乙二胺67 mL加至500 mL超純水后攪拌混合,加入6 mol/L鹽酸350 mL,降溫至25 ℃后測溶液的pH值為4.75。取BSA 5 g溶于25 mL超純水中,混勻后加入至上述溶液中,稱取碳二亞胺鹽酸鹽1.8 g加入溶液中,攪拌反應2 h,加4 mol/L、pH值為4.75乙酸-乙酸鈉溶液30 mL以終止反應。取上述溶液于4 ℃下在超純水中透析去除雜質(zhì)72 h,每4 h換超純水1次。將透析液冷凍干燥為粉末固體,即為C-BSA,-80 ℃凍存。C-BSA誘導的大鼠CGN模型的建立:取凍干的C-BSA 100 mg溶于3.75 mL生理鹽水中,加入弗氏不完全佐劑26.25 mL,充分乳化混勻。大鼠每日多點皮下注射0.3 mL,連續(xù)1周,進行預免疫。預免疫結(jié)束后開始正式免疫,稱取C-BSA 100 mg溶于30 mL生理鹽水中,大鼠尾靜脈注射13 mg/kg C-BSA,1次/2 d,共12次。于造模結(jié)束后檢測大鼠24 h尿蛋白量,確保造模成功。

表1 益腎固絡合劑中使用的飲片信息

1.2.2 給藥方法 除正常組外,剩余各組大鼠按上述方法進行造模,正常組大鼠用等劑量生理鹽水進行尾靜脈注射。造模結(jié)束后,陽性藥組每天按照4.5 mg/kg劑量灌胃氯沙坦鉀,益腎固絡合劑組每天按照26.1 g/kg劑量灌胃益腎固絡合劑(以臨床等效劑量2倍計算),正常組、模型組以等劑量生理鹽水進行灌胃,連續(xù)14 d[6]。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 生物樣本處理及腎功能生化測定 末次給藥結(jié)束后收集大鼠24 h尿液樣本,腹腔注射戊巴比妥鈉(45 mg/kg)進行麻醉,大鼠腹主動脈取血樣,樣本常溫靜置30 min后835×g離心15 min,收集各組大鼠血清樣本。尿液和血清樣本-80 ℃凍存。取大鼠尿液樣本,利用全自動蛋白分析儀檢測24 h蛋白尿量;取血清樣本,利用全自動生化分析儀檢測Scr和BUN水平[6]。

1.2.3.2 尿液代謝組學分析 尿液樣本的處理:取各組大鼠尿液樣本在4 ℃下融化,100 μL尿液樣本中加入甲醇300 μL,渦旋3 min,4 ℃、9 820×g離心10 min,吸取350 μL上清液轉(zhuǎn)移至離心管中,再次在4 ℃下9 820×g離心10 min,吸取上清液待測。另外,吸取各樣本5 μL混合后制備質(zhì)量控制(Quality Control,QC)樣本,監(jiān)測儀器分析過程的穩(wěn)定性。

UPLC-Q-TOF-MS/MS分析:液相條件:流動相A(乙腈)-流動相B(0.1%甲酸水溶液)。梯度洗脫:0～6 min,5%～40%A;6～18 min,40%～75%A;18～26 min,75%～95%A;26～28 min,95%～5%A;28～30 min,5%～5%A。色譜柱Agilent Zorbax SB-C18(2.1 mm×100 mm,1.8 μm),進樣量1 μL、柱溫40 ℃和流速0.3 mL/min下采集分析[6]。質(zhì)譜條件:電噴霧離子源,噴霧離子化電壓5.5 kV/-4.5 kV,去簇電壓60 V/-60 V,碰撞電壓10 V/-10 V,霧化氣55 psi,輔助加熱器55 psi,氣簾氣35 psi,離子化溫度550 ℃。MS/MS去簇電壓60 V/-60 V,碰撞電壓40 V/-40 V。質(zhì)譜掃描范圍100～2 000 m/z[6]。

UPLC-MS數(shù)據(jù)處理:將代謝組學質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)導入One-MAP_PTO-64軟件(大連達碩公司,中國),轉(zhuǎn)化成.mzML數(shù)據(jù)格式,對各個樣本的質(zhì)譜信息進行峰對齊和峰匹配,生成保留時間、質(zhì)荷比、峰面積等信息的峰表。將峰表輸入SIMCA-P 14.1軟件(Umetrics公司,瑞典),進行數(shù)據(jù)歸一化、偏最小二乘法判別分析(Partial Least Squares Discrimination Analysis,PLS-DA)以及正交偏最小二乘法判別分析(Orthogonal Partial Least Squares Discrimination Analysis,OPLS-DA)等多元數(shù)理統(tǒng)計分析。根據(jù)OPLS-DA中的變量投影重要性(Variable Importance in Projection,VIP)值>1且t檢驗(P<0.05)篩選各組間的差異代謝物[11]。利用One-MAP代謝組學分析云平臺(http://www.5omics.com/)對差異代謝物鑒定分析,結(jié)合代謝物的保留時間、分子量、二級碎片離子,與分析平臺的多元整合數(shù)據(jù)[自建標準品數(shù)據(jù)庫、京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)、人類代謝組數(shù)據(jù)庫(Human Metabolome Database,HMDB)、Metlin、Massbank、PubChem]進行匹配和注釋[12]。將篩選的代謝標志物輸入MetaboAnalyst 5.0數(shù)據(jù)庫進行代謝通路富集分析。

1.2.3.3 代謝標志物生物網(wǎng)絡分析 將益腎固絡合劑治療CGN的代謝物標志物導入Cytoscape 3.8軟件的插件Metscape V3.1.3,構(gòu)建代謝標志物-基因網(wǎng)絡,獲取代謝物標志物相關(guān)的基因。利用GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)輸入關(guān)鍵詞“慢性腎小球腎炎(chronic glomerulonephritis)”“慢性腎炎(chronic nephritis)”檢索疾病相關(guān)的基因,采用維恩圖得到代謝標志物相關(guān)基因和疾病相關(guān)基因的交集。利用Cytoscape 3.8軟件的插件Cluego和CluePedia對交集基因進行KEGG富集分析。將交集基因輸入STRING數(shù)據(jù)庫(https://cn.string-db.org/)進行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡分析,將此網(wǎng)絡輸入Cytoscape 3.8軟件,利用其插件CytoHubba計算節(jié)點之間的最大集團中心度(Maximal Clique Centrality,MCC)值,排名前10的蛋白為益腎固絡合劑治療CGN的潛在靶點。

2 結(jié)果

2.1 腎功能生化檢測 模型組大鼠的24 h尿蛋白量、Scr、BUN水平較正常組均顯著升高(P<0.01);陽性藥組、益腎固絡合劑組大鼠的24 h尿蛋白量、Scr、BUN水平較模型組均顯著降低(P<0.01)。見表2。

2.2 代謝組學分析

2.2.1 UPLC-Q-TOF-MS/MS分析 給出圖說明。見圖1。

2.2.2 多元統(tǒng)計分析 將各組尿液代謝組學數(shù)據(jù)進行PLS-DA代謝輪廓分析,QC樣本在正、負離子掃描模式下呈現(xiàn)較好的聚類,表明儀器系統(tǒng)的穩(wěn)定性好,分析方法可靠。正常組和模型組分別在正、負離子模式下顯著分開,表明C-BSA誘導大鼠CGN的尿液代謝輪廓發(fā)生顯著變化;益腎固絡合劑組和模型組顯著分開,表明益腎固絡合劑對CGN的尿液代謝異常具有調(diào)控作用。見圖2。

采用OPLS-DA分析正常組和模型組之間的尿液差異代謝物,追蹤差異代謝物在模型組和益腎固絡合劑組之間的變化趨勢,進一步篩選益腎固絡合劑治療CGN的尿液代謝標志物,R2X和Q2越接近1代表模型的預測能力和解釋能力越強,結(jié)果表明建模結(jié)果可靠;進一步采用隨機置換模型測試分析(n=200),Q2在y軸上的截距均為負值,表明各組建模不存在隨機擬合或過擬合的現(xiàn)象。采用OPLS-DA模型的VIP>1和P<0.05的條件篩選差異代謝標志物,根據(jù)尿液代謝物的保留時間、分子量以及MS/MS質(zhì)譜碎片信息,利用One-MAP數(shù)據(jù)處理平臺鑒定差異代謝物,最終分析鑒定出花生四烯酸等20個差異代謝物,即為益腎固絡合劑治療CGN的尿液代謝標志物,益腎固絡合劑治療CGN大鼠后,這些尿液代謝標志物向正常水平趨勢回調(diào)。見表3～4,圖3。

表2 腎功能生化檢測結(jié)果

圖1 尿液樣本TIC

圖2 尿液代謝輪廓分析

表3 PLS-DA和OPLS-DA的建模參數(shù)

圖3 正離子掃描模式OPLS-DA分析差異代謝物

將20個代謝標志物的HMDB代號導入Metabo Analyst 5.0數(shù)據(jù)庫進行代謝通路富集分析,圖中圓形代表代謝通路,大小代表Impact值,顏色代表P值。以Impact>0.1作為重要代謝通路的篩選條件,共篩選出3條益腎固絡合劑調(diào)控CGN大鼠的代謝通路,分別是亞油酸代謝(Impact=1.0)、花生四烯酸代謝(Impact=0.313 5)、鞘脂代謝(Impact=0.154 2)。見圖5A。綜合KEGG代謝通路數(shù)據(jù)庫,

圖4 負離子掃描模式下OPLS-DA分析差異代謝物

表4 益腎固絡合劑治療CGN的尿液代謝標志物

構(gòu)建益腎固絡合劑治療CGN的代謝網(wǎng)絡調(diào)控圖,紅色代謝物表示益腎固絡合劑治療后CGN大鼠尿液代謝物水平呈下調(diào)趨勢,藍色代謝物表示尿液代謝物水平呈上調(diào)趨勢,且均向正常水平恢復。代謝標志物亞油酸參與亞油酸代謝通路調(diào)控,花生四烯酸參與花生四烯酸代謝通路調(diào)控,鞘氨醇參與鞘脂代謝通路調(diào)控,益腎固絡合劑從整體上糾正代謝紊亂,發(fā)揮治療CGN的藥效作用。見圖5B。

圖5 代謝通路分析

2.3 代謝標志物生物網(wǎng)絡分析 對益腎固絡合劑治療CGN的關(guān)鍵代謝標志物進行生物網(wǎng)絡分析,挖掘其治療CGN的潛在靶點,進一步聚焦益腎固絡合劑治療CGN的核心途徑。采用Cytoscape 3.8軟件的插件Metscape V3.1.3構(gòu)建關(guān)鍵代謝物-基因網(wǎng)絡,通過GeneCards數(shù)據(jù)庫輸入關(guān)鍵詞“(chronic glomerulonephritis)慢性腎小球腎炎”“(chronic nephritis)慢性腎炎”檢索疾病相關(guān)基因靶點,共得到2 507個疾病相關(guān)基因靶點。見圖6。利用維恩圖得到代謝標志物相關(guān)基因和疾病相關(guān)基因的交集靶點為21個。采用Cytoscape 3.8軟件的插件Cluego和CluePedia對21個交集靶點進行KEGG通路富集分析,KEGG通路分析顯示益腎固絡合劑治療CGN的主要通路包括花生四烯酸代謝、亞油酸代謝、血管內(nèi)皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)信號通路等。花生四烯酸代謝在所有通路途徑中富集的靶點數(shù)最多,提示花生四烯酸代謝是益腎固絡合劑發(fā)揮治療CGN的關(guān)鍵途徑。見圖7。

將21個交集基因輸入STRING數(shù)據(jù)庫進行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡分析,將此網(wǎng)絡輸入Cytoscape 3.8軟件,利用插件CytoHubba計算節(jié)點之間的最大集團中心度值,,節(jié)點顏色越深代表最大集團中心度值越大,網(wǎng)絡中的節(jié)點越重要,為關(guān)鍵靶點,排名前10的靶點分別為細胞色素P450 4A11(Recombinant Cytochrome P450 4A11,CYP4A11)、細胞色素P450 2C9(Recombinant Cytochrome P450 2C9,CYP2C9)、細胞色素P450 2B6(Recombinant Cytochrome P450 2B6,CYP2B6)、細胞色素P450 2J2(Recombinant Cytochrome P450 2J2,CYP2J2)、花生四烯酸-15-脂加氧酶(Recombinant Arachidonate-15-lipoxygenase,ALOX15)、磷脂酶A2第6型(Phospholipase A2 Type 6,PLA2G6)、1B型磷脂酶A2(Phospholipase A2 Group 1B,PLA2G1B)、2A型磷脂酶A2(Phospholipase A2 Group 2A,PLA2G2A)、4A型磷脂酶A2(Phospholipase A2 Group 4A,PLA2G4A)、環(huán)氧合酶2(Prostaglandin-endoperoxide Synthase 2,PTGS2),主要集中分布于花生四烯酸代謝。見圖8。

圖6 益腎固絡合劑治療CGN的關(guān)鍵代謝物-基因網(wǎng)絡

圖7 益腎固絡合劑治療CGN的KEGG富集分析

3 討論

益腎固絡合劑臨床應用于治療CGN療效顯著,具有明顯降低患者尿蛋白量、Scr以及BUN水平,改善臨床癥狀和緩解機體炎癥反應等作用[4-6]。在CGN中,尿液是比血液更為理想的篩選代謝標志物的媒介,尿液直接源于腎臟,其成分組成相對穩(wěn)定,尿液代謝物的變化反映了腎臟組織的生理、病理改變。因此,本研究基于尿液代謝組學和生物網(wǎng)絡分析整合策略從代謝網(wǎng)絡調(diào)控角度研究益腎固絡合劑治療CGN的關(guān)鍵代謝途徑和潛在靶點,為益腎固絡合劑的臨床應用提供科學依據(jù)。

3.1 基于尿液代謝組學分析益腎固絡合劑治療CGN作用機制 尿液代謝組學分析顯示益腎固絡合劑對CGN大鼠的脂質(zhì)代謝紊亂具有較好的調(diào)控作用,主要集中在花生四烯酸代謝、亞油酸代謝。脂質(zhì)代謝紊亂與CGN等腎臟疾病關(guān)系密切,血清、尿液脂質(zhì)及脂蛋白是腎臟疾病的重要標志物,與腎臟疾病患者的病理發(fā)展及預后密切相關(guān)[13]?；ㄉ南┧崾且环Nω-6多不飽和脂肪酸,廣泛存在于動物、人體的細胞膜中,機體處于應激狀態(tài)下,花生四烯酸通過環(huán)氧合酶、脂氧合酶、細胞色素P450酶等代謝途徑合成生物活性物質(zhì),如前列腺素、血栓素、白三烯、羥基二十碳四烯酸(Hydroxyeicosatetraenoic Acid,HETEs)等,這些化合物參與CGN發(fā)病過程中的凝血、血小板聚集、炎癥介質(zhì)募集、白細胞趨化等。血栓素A2能降低腎臟血流量和腎小球濾過率,誘導腎臟組織微血栓的形成,促進CGN的發(fā)展[14]。白三烯B4、D4有助于損害正常腎小球濾過和篩選功能,從而引起腎小球的急性炎癥損傷,并導致腎小球的破壞,而選擇性抑制白三烯B4、D4有助于改善急性和慢性腎小球腎炎[15]。HETEs通過激活過氧化物酶體增殖物激活受體(Peroxisome Proliferator-activated Receptors,PPARs)在腎臟炎癥反應中起著重要作用,PPARs包括3種亞型PPARα、PPARδ、PPARγ,都是脂肪生成的轉(zhuǎn)錄因子,主要在脂肪和免疫細胞中表達,調(diào)節(jié)與腎臟炎癥相關(guān)的大量基因的表達,在巨噬細胞中,過量的HETEs激活PPARγ活性,誘導CD36表達升高,導致腎小管間質(zhì)的細胞凋亡,致使腎小管炎癥及纖維化[16];HETEs還可以激活PPARα,PPARα通過參與脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)對腎臟炎癥產(chǎn)生影響[17-18]。因此,花生四烯酸代謝介導了CGN的發(fā)生和發(fā)展,是治療CGN的潛在關(guān)鍵途徑。代謝組學分析顯示C-BSA誘導CGN大鼠的尿液代謝標志物花生四烯酸水平顯著高于正常組,益腎固絡合劑治療后明顯下調(diào)花生四烯酸水平。此外,機體內(nèi)必須脂肪酸亞油酸在去飽和酶和延伸酶的作用下可代謝轉(zhuǎn)化為花生四烯酸,它們可以作為產(chǎn)生促炎性類二十烷酸的底物,誘導炎癥介質(zhì)如白細胞介素-1(Interleukin-1,IL-1)和腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor,TNF-α)等的產(chǎn)生[19]。與正常組比較,亞油酸含量在CGN大鼠尿液中顯著升高,而益腎固絡合劑干預后亞油酸含量顯著下調(diào)。因此,提示益腎固絡合劑發(fā)揮治療CGN的作用與調(diào)節(jié)花生四烯酸代謝途徑密切相關(guān)。

3.2 基于尿液代謝組學和生物網(wǎng)絡整合分析益腎固絡合劑治療CGN潛在作用機制 對益腎固絡合劑治療CGN的關(guān)鍵代謝標志物進行生物網(wǎng)絡分析,進一步發(fā)現(xiàn)花生四烯酸代謝通路相關(guān)的CYP4A11、CYP2C9、CYP2B6、CYP2J2、ALOX15、PLA2G6、PLA2G1B、PLA2G2A、PLA2G4A、PTGS2等10個蛋白為益腎固絡合劑治療CGN的潛在靶點。目前,CYP2C9為臨床治療CGN的重要靶點,CYP2C9抑制劑如氟伐他汀、洛伐他汀、舍曲林和磺胺甲惡唑等通常用于腎小球腎炎患者的臨床治療,具有降低蛋白尿、Scr水平,改善腎功能作用[20]。PLA2被認為是由炎癥引起多器官損傷和衰竭的重要調(diào)節(jié)酶,PLA2激活后刺激IL-1、TNF-α等炎癥介質(zhì)的釋放,加劇局部炎癥,PLA2G1B、PLA2G2A、PLA2G4A均是PLA2超家族中的亞型,在機體免疫和炎癥反應的調(diào)節(jié)中具有重要作用,主要涉及核因子κB(Nuclear Factor-κB,NF-κB)、促分裂原活化的蛋白激酶(Mitogenactivated Protein Kinase,MAPK)等炎癥信號通路[21-23]。ALOX15是脂氧合酶(Lipoxygenase,LOX)的主要亞型,在腎衰竭小鼠的腎臟中,ALOX15的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達水平顯著升高,且敲除ALOX15后,腎衰竭小鼠的腎功能和纖維化明顯改善,表明ALOX15是腎臟損傷的潛在靶點[24]。前列腺素G/H合成酶2(Prostaglandin G/H Synthase 2,PTGS2)也被稱作前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(Prostaglandin-endoperoxide Synthase 2,COX-2),是前列腺素生物合成的關(guān)鍵限速酶,與機體炎癥反應、蛋白尿誘導足細胞損傷密切相關(guān)[25]。

綜上所述,本研究采用尿液代謝組學技術(shù),篩選出尿液中花生四烯酸、亞油酸、鞘氨醇等20個益腎固絡合劑治療CGN的內(nèi)源性代謝標志物,益腎固絡合劑干預CGN大鼠后,這些代謝物向正常水平回調(diào)。進一步對益腎固絡合劑調(diào)節(jié)的關(guān)鍵代謝物進行生物網(wǎng)絡分析,表明尿液的花生四烯酸代謝是益腎固絡合劑發(fā)揮治療CGN作用的潛在關(guān)鍵通路,其代謝途徑上的CYP4A11、CYP2C9、CYP2B6、CYP2J2、ALOX15、PLA2G6、PLA2G1B、PLA2G2A、PLA2G4A、PTGS2為益腎固絡合劑治療CGN的潛在靶點?；诒狙芯拷Y(jié)果,在后續(xù)研究中將對篩選的代謝通路及其潛在的靶點、信號通路進行深入研究。

利益沖突聲明:本文不存在任何利益沖突。