羅福祥 馬福昌 艾西木江·熱甫卡提 阿不都吉力力·阿布都艾尼 竇 勤 尤力都孜·買買提 高 莉 庫爾班尼沙·麥提卡思木

(1 新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所毒理學(xué)研究室,烏魯木齊,830011; 2 新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所,新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)方劑學(xué)重點實驗室,烏魯木齊,830011)

蒺藜為蒺藜科植物蒺藜(TribulusterrestrisL.)的干燥成熟果實。中醫(yī)認(rèn)為其辛、苦,微溫,有小毒,歸肝經(jīng),用于平肝解郁,活血祛風(fēng),頭痛眩暈,胸脅脹痛,乳閉乳癰,目赤翳障,風(fēng)疹瘙癢[1]。蒺藜含有皂苷類、黃酮類等化合物[2],現(xiàn)代臨床應(yīng)用和毒理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)蒺藜對肝臟具有一定的毒性作用[3-6],國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品評價中心早在2005年藥品不良反應(yīng)信息通報(第9期)發(fā)布了蒺藜復(fù)方白蝕丸不良反應(yīng)的信息通報[7],因此,臨床應(yīng)用中需重點監(jiān)測肝腎功能相關(guān)指標(biāo)。目前,其肝毒性特點及作用機制均未見報道,本研究通過組織病理學(xué)、實時PCR、酶聯(lián)免疫吸附試驗法,從肝組織病理學(xué)、氧化應(yīng)激、肝細(xì)胞極性改變相關(guān)及膽汁合成、轉(zhuǎn)運、攝取、代謝相關(guān)基因蛋白表達(dá)變化等方面,探討蒺藜的肝毒性作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague-Dawley,SD)大鼠140只,鼠齡為4～6周,體質(zhì)量130～150 g,雌雄各半,購自新疆醫(yī)科大學(xué),實驗動物許可證號:SCXK(新)2018-0002,飼養(yǎng)條件為SPF(無特定病原體)屏障環(huán)境,室溫為20～26 ℃,相對濕度為40%～70%,光照黑暗各12 h,動物使用許可證:SYXK(新)2021-0004。經(jīng)新疆維吾爾醫(yī)藥研究所動物實驗倫理委員會審批(倫理審批號:nGLP2020-007),根據(jù)中國國家動物保護(hù)局衛(wèi)生和醫(yī)學(xué)研究委員會動物條例用于科學(xué)目的的護(hù)理和使用。

1.1.2 藥物 蒺藜生藥粉,黃綠色粉末,由南通飛宇生物科技有限公司提供,批號:FY200619。蒺藜水提物,棕褐色粉末,由南通飛宇生物科技有限公司提供,批號:FY200616。提取方法:取一定量的蒺藜,粉碎,分別加10倍量的水回流提取3次,1 h/次,合并提取液,干燥得干浸膏,稱重,計算浸膏得率為5%。

1.1.3 試劑與儀器 全自動生化分析儀(日立公司,日本,型號:7100型),脫水機(浙江金華科迪儀器設(shè)備有限公司,型號:KDTS3D),包埋機(浙江金華科迪儀器設(shè)備有限公司,型號:KD-BMII),切片機(LEICA,德國,型號:RM2235),PCR儀(Bio-Rad,美國,型號:MyCycler Thermal),酶標(biāo)儀(Bio-Rad,美國,型號:xMarkTM)。超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)試劑盒(江萊生物,批號:JL22893),谷胱甘肽(Glutathione,GSH)試劑盒(江萊生物,批號:JL21016),丙二醛(Malondialdehyde,MDA)試劑盒(江萊生物,批號:JL13297),BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京索拉比奧科技有限公司,貨號:PC0020),PCR引物:法尼酯X受體(Farnesoid X Receptor,FXR)(Bioss Inc.,批號:bs-22519R),過氧化物酶體增殖物激活受體α(Peroxisome Proliferator-activated Receptor,PPAR α)(Bioss Inc.,批號:bs-3614R),β-actin(Bioss Inc.,批號:bs-0061R),細(xì)胞色素7A1(Cytochrome P450 7A1,CYP7A1)[生工生物工程(上海)股份有限公司,批號:D161909]。

1.2 方法

1.2.1 劑量設(shè)置 蒺藜生藥粉(JLF):臨床擬服用量為6～10 g,按照成人體質(zhì)量60 kg計算,臨床擬用量為0.17 g生藥/kg。其大鼠的等效劑量為1.071 g生藥/kg,按照相關(guān)技術(shù)指導(dǎo)原則要求,長期毒性試驗低劑量應(yīng)高于動物等效劑量。因此試驗選取2.125 g生藥/kg作為JLF低劑量,以4.250 g生藥/kg為JLF中劑量,8.500 g生藥/kg為JLF高劑量,分別為臨床用量的12.5、25、50倍。3個劑量呈1∶2∶4倍數(shù)關(guān)系,濃度分別為0.07、0.14、0.28 g供試品/mL,以期獲得毒性的劑量-反應(yīng)關(guān)系。蒺藜水提物(JLS):其提取率為5%,按照成人體質(zhì)量60 kg計算,臨床擬用量為0.17 g生藥/kg,相當(dāng)于0.008 5 g水提物/kg。按照相關(guān)技術(shù)指導(dǎo)原則要求,長期毒性試驗低劑量應(yīng)高于動物等效劑量。因此試驗選取0.43 g水提物/kg作為JLS低劑量,以0.85 g水提物/kg為JLS中劑量,1.70 g水提物/kg為JLS高劑量,分別為臨床用量的50、100、200倍。3個劑量呈1∶2∶4倍數(shù)關(guān)系,濃度分別為0.04、0.09、0.17 g供試品/mL,以期獲得毒性的劑量-反應(yīng)關(guān)系。

1.2.2 分組與給藥 選取健康SD大鼠140只,雌雄各半,按隨機數(shù)字表法隨機分為正常對照組,蒺藜粉低、中、高劑量組,蒺藜水提物低、中、高劑量組。將蒺藜生藥粉及蒺藜水提物分別用動物飲用水配制成相應(yīng)給藥濃度,10 mL/kg,灌胃給予SD大鼠。蒺藜生藥粉低、中、高劑量組2次/d,蒺藜水提取物低、中、高劑量組1次/d,連續(xù)灌胃給予大鼠1個月,每日觀察動物有無中毒情況發(fā)生。給藥末次當(dāng)晚,動物禁食不禁水,次日稱取禁食體質(zhì)量,1%戊巴比妥鈉4 mL/kg腹腔注射進(jìn)行麻醉解剖,腹主動脈采血進(jìn)行血液學(xué)檢測,取部分新鮮肝臟置于液氮中分裝保存,部分肝臟組織置于10%的中性甲醛中制作病理切片,進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。

1.2.3 血液生化檢測 采用一次性真空采血管腹主動脈采血,內(nèi)含分離膠+促凝劑(血清管),腹主動脈取血,立即輕輕混勻。采血后靜置30 min,3 000 r/min,離心10 min,離心半徑14 cm,分離血清,全自動血液生化分析儀檢測大鼠血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶(Glutamic-oxaloacetic Transaminase,GOT)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Glutamic-pyruvic Transaminase,GPT)、堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)、總膽紅素(Total Bilirubin,TBIL)的含量。

1.2.4 肝組織能量代謝相關(guān)指標(biāo)檢測 按照CBA蛋白濃度測定試劑盒說明書對各組大鼠肝臟組織樣本進(jìn)行蛋白進(jìn)行定量,酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測大鼠肝臟中相關(guān)代謝指標(biāo)。具體按試劑盒操作,在反應(yīng)終止后用酶標(biāo)儀在450 nm波長依序測量各孔的吸光度值(A值)。按照公式計算得到吸光度比值,通過ELISACalc軟件以吸光度比值為Y軸,以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為X軸擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線,進(jìn)行計算得到樣本含量。

1.2.5 PCR檢測肝組織中FXR、CYP7A1、PPAR α的表達(dá) 肝臟組織樣本用液氮充分研磨,取50 mg于離心管中,加1 mL Trizol充分混勻,室溫靜置10 min至組織完全裂解。加200 μL氯仿混勻放置5 min。4 ℃,12 000 r/min,離心15 min,離心半徑8.5 cm。取上清于另一新離心管中,加入等體積異丙醇混勻,-20 ℃靜置30 min。4 ℃,于12 000 r/min,離心15 min,離心半徑8.5 cm,棄上清液。加入75%乙醇,使沉淀漂浮起來洗滌。4 ℃,12 000 r/min,離心15 min,離心半徑8.5 cm,棄上清,重復(fù)步驟1次?？展茈x心,吸盡液體,晾干。用RNase free水溶解沉淀。核酸蛋白定量儀檢測RNA純度,瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。剩余RNA置于-80 ℃保存或直接反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA,用于后續(xù)實驗。第一鏈cDNA合成混勻后25 ℃反應(yīng)10 min,42 ℃反應(yīng)30 min,85 ℃反應(yīng)5 s取出,結(jié)束反轉(zhuǎn)錄實驗。將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA置于-80 ℃保存,用于后續(xù)實驗。熒光定量引物信息見表1。

表1 熒光定量引物信息

2 結(jié)果

2.1 一般觀察 未發(fā)現(xiàn)大鼠一般形態(tài)外觀、狀況活動、飲食情況、分泌物、排泄物等異常。給藥結(jié)束解剖大鼠觀察,結(jié)果蒺藜生藥粉、蒺藜水提取物均可引起大鼠肝臟顏色變深,但與正常對照組比較,給藥各組肝重量、肝系數(shù)均無明顯變化。見表2。

表2 蒺藜對SD大鼠肝臟系數(shù)的影響

2.2 血液生化學(xué)檢測結(jié)果 與正常對照組比較,給藥各組TBIL、ALP無顯著變化,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);JLF高劑量組GOT顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),JLS高劑量組GOT、GPT顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。見表3。

2.3 肝組織能量代謝相關(guān)指標(biāo)檢測結(jié)果 與正常對照組比較,蒺藜生藥粉各劑量組大鼠肝組織中GSH、MDA、SOD蛋白表達(dá)均差異無統(tǒng)計學(xué)意義;蒺藜水提取物高劑量組GSH表達(dá)顯著升高(P<0.05),中、高劑量組MDA蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01),低劑量組SOD顯著降低(P<0.05)。見表4。

2.4 FXR、CYP7A1、PPAR α蛋白表達(dá)結(jié)果 與正常對照組比較,蒺藜生藥粉各劑量組大鼠肝組織中FXR、PPAR α蛋白表達(dá),差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),蒺藜生藥粉中、高劑量組CYP7A1表達(dá)顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。與正常對照組比較,蒺藜水提物各劑量組大鼠肝組織中FXR蛋白表達(dá),差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),蒺藜中劑量組CYP7A1表達(dá)顯著升高(P<0.01),蒺藜高劑量組PPARα顯著降低(P<0.01)。見表5。

表3 蒺藜生藥粉及水提取物對SD大鼠血生化指標(biāo)的影響

表4 蒺藜生藥粉及水提取物對SD大鼠肝組織能量代謝相關(guān)指標(biāo)的影響

2.5 組織病理學(xué)結(jié)果 蒺藜生藥粉、蒺藜水提取物分別以相應(yīng)濃度經(jīng)口給予SD大鼠1個月,結(jié)果蒺藜生藥粉、蒺藜水提取物均可引起大鼠肝臟顏色變深。組織病理學(xué)檢查JLF中、高劑量組及JLS各劑量組均可見肝細(xì)胞水腫、肝細(xì)胞脂肪變性,灶狀炎癥細(xì)胞浸潤,且蒺藜水提取物程度更深。組織病理學(xué)結(jié)果顯示,蒺藜可能對肝臟具有一定的毒性作用。見圖1。

表5 蒺藜生藥粉及水提取物對SD大鼠肝組織FXR、 CYP7A1、PPAR α表達(dá)的影響

圖1 蒺藜生藥粉及水提物對SD大鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)影響(HE染色,×100)

3 討論

中藥藥源性肝損傷是藥物及其代謝物直接損害肝臟所致,可細(xì)分為肝細(xì)胞型、膽汁淤積型和混合型肝損傷[8-9]。中藥肝毒性的評價多以肝細(xì)胞直接毒性為考察指標(biāo)[10],當(dāng)肝臟受到一定損傷時,會導(dǎo)致肝細(xì)胞變性、壞死,使細(xì)胞內(nèi)容物溢出進(jìn)入血液,而血清或者血漿中GOT、GPT等相關(guān)酶含量或活性變化是臨床評價肝細(xì)胞受損程度的重要指標(biāo)[11-13]。NO是一種活性很強的自由基[14],在體內(nèi)的最終氧化產(chǎn)物為MDA,而MDA具有潛在的細(xì)胞毒性,可攻擊神經(jīng)元細(xì)胞功能蛋白,改變其活性,進(jìn)而影響細(xì)胞的正常功能,其含量高低反映了組織過氧化損傷的程度[15-16]。CYP7A1是CYP450酶系中重要的亞型,在肝臟中,CYP7A1的活性與藥物的毒性密切相關(guān)[17-18]。PPAR α是由配體激活的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,參與炎癥反應(yīng)、凋亡和脂質(zhì)代謝[19],對藥物性肝毒性等具有調(diào)控作用,當(dāng)激活PPAR α后,會抑制肝細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷后SOD和GSH的失活,減少活性氧生成并加速其消除,同時降低細(xì)胞內(nèi)MDA的含量,抑制肝細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的脂質(zhì)過氧化反應(yīng),減輕大鼠肝細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的氧化應(yīng)激損傷,保護(hù)肝臟功能[20]。

本實驗結(jié)果顯示,蒺藜粉高劑量組可引起大鼠GOT的顯著升高,而蒺藜水提物高劑量組大鼠GOT、GPT的均顯著升高,表明高劑量的蒺藜粉末和蒺藜水提物均能對大鼠肝臟產(chǎn)生影響,且蒺藜水提物對大鼠肝臟的影響更為嚴(yán)重。通過對大鼠肝組織能量代謝相關(guān)指標(biāo)和相關(guān)因子檢測表明,蒺藜水提物組大鼠PPAR α表達(dá)顯著降低,而CYP7A1、MDA的表達(dá)顯著升高。因此,抑制PPAR α表達(dá),促使CYP7A1、MDA的過盛表達(dá)可能是蒺藜引起肝毒性的原因之一。而實驗中GSH呈現(xiàn)升高趨勢、SOD未見明顯的變化趨勢,這可能是藥物有效成分對肝臟的影響,具體GSH的升高是否與藥物有效成分有關(guān),還需要進(jìn)一步研究。

利益沖突聲明:無。