張敬美 薛思明 李偉利 陳 歡 盧令慧 王其艷

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,北京,100029; 2 北京中醫(yī)藥大學(xué)證候與方劑基礎(chǔ)研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京,100029; 3 北京中醫(yī)藥大學(xué)證候與方劑基礎(chǔ)研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京,100029; 4 北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院,北京,100029)

阿霉素(Doxorubicin,DXR)是一種高效的化療藥物,在臨床上廣泛用于癌癥治療[1-2]。然而其在長(zhǎng)期使用過(guò)程中會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生嚴(yán)重的不良反應(yīng),尤其是心肌損傷[3-6],可導(dǎo)致左心功能不全,甚至心力衰竭。目前右丙亞胺是美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局唯一推薦用于減輕阿霉素心肌損傷的藥物,雖然被證明有一定的心臟保護(hù)作用,但其會(huì)加重骨髓抑制,并出現(xiàn)神經(jīng)毒性、食欲下降、惡心嘔吐、靜脈炎、腹瀉等不良反應(yīng)[7]。因此,還需要更多的基礎(chǔ)和臨床研究積極尋找安全且有效的防治阿霉素心肌損傷的藥物。

芪參顆粒(Qishen Granules,QSG)是由黃芪、丹參、金銀花、玄參、附子、甘草6味藥材組成,臨床研究表明其可顯著提高心力衰竭患者的射血分?jǐn)?shù)和中醫(yī)證候積分[8],降低患者的N末端B型利鈉肽原(N-terminal Pro-B-type Natriuretic Peptide,NT-proBNP)水平[9]。此外,前期本課題組研究表明QSG可顯著改善心力衰竭大鼠和小型豬的心功能并減少心肌纖維化[10-11]。但是關(guān)于QSG治療阿霉素心臟毒性的報(bào)道尚不多,其機(jī)制亦不明確,因此本研究將結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)探索并驗(yàn)證QSG減輕阿霉素心臟毒性的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 無(wú)特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級(jí)雄性C57BL/6J小鼠,6～8周齡,體質(zhì)量(20±2)g,購(gòu)自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司,動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK-(京)-2019-0010,飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)。按照隨機(jī)數(shù)字法分組,動(dòng)物自由進(jìn)食飲水,并按照自然晝夜節(jié)律光照。本實(shí)驗(yàn)獲得了北京中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理審批號(hào):BUCM-4-2018001201-1014)。

1.1.2 藥物 芪參顆粒(由北京中醫(yī)藥大學(xué)自主制備加工處理),普伐他汀(上海第一三共制藥有限公司,貨號(hào):H20060271),阿霉素(GLPbio公司,美國(guó),貨號(hào):GC17576)。

1.1.3 試劑與儀器 BCA定量試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)有限公司,貨號(hào):P1511-1),Cell Counting Kit-8(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司,貨號(hào):KGA317),CBA Mouse Th1/Th2/Th17 Cytokine Kit(BD公司,美國(guó),貨號(hào):560485),磷酸化蛋白激酶B(Phospho-protein Kinase B,p-AKT)抗體(CST,美國(guó),貨號(hào):#13038),磷酸化促分裂原活化的蛋白激酶(Phosphorylated Mitogen Activated-protein Kinase,p-MAPK)抗體(CST,美國(guó),貨號(hào):#9211),促分裂原活化的蛋白激酶P38(Mitogen-activated Protein Kinase P38,MAPKP38)抗體(CST,美國(guó),貨號(hào):#9212),磷酸化核因子κB P65(Phospho-Nuclear Factor kappa-B P65,p-NF-κB P65)抗體(Abcam,美國(guó),貨號(hào):ab28856),甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase,GAPDH)抗體(Abcam,美國(guó),貨號(hào):ab181602),Goat anti Rb二抗(Abcam公司,英國(guó),貨號(hào):ab6721),PBS緩沖液(Servicebio公司,貨號(hào):G4202),多聚甲醛固定液(Servicebio公司,貨號(hào):G1101),DMEM培養(yǎng)基(Gibco,美國(guó),貨號(hào):C11995500BT),Trypsin-EDTA(Gibco公司,美國(guó),貨號(hào):25300-054),雙抗-青鏈霉素混合液(AQ公司,貨號(hào):AQ512),RIPA組織細(xì)胞裂解液(Biorigin公司,貨號(hào):BN25012-A),蛋白酶抑制劑(普利萊,貨號(hào):P1265),蛋白磷酸酶酶抑制劑(普利萊,貨號(hào):P1260),ECL Plus超敏發(fā)光液(Solarbio,貨號(hào):PE0010),無(wú)蛋白快速封閉液(雅酶,貨號(hào):PS105),一抗稀釋液(Biorigin,貨號(hào):BN21010),大小鼠尾靜脈顯像儀(南京卡爾文生物科技有限技術(shù)公司,型號(hào):KW-XXY),小動(dòng)物超聲影像系統(tǒng)(加拿大VisualSonics公司,美國(guó),型號(hào):Vevo TM2100),離心機(jī)(Eppendorf公司,德國(guó),型號(hào):5424R),組織超聲破碎儀(Qiagen公司,德國(guó),型號(hào):HildenTissueLyser II),Multiskan全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Thermo公司,美國(guó),型號(hào):MK3),低溫離心機(jī)(Eppendorf公司,德國(guó),型號(hào):5424R),凝膠成像儀及圖像分析系統(tǒng)(Bio-rad公司,美國(guó),型號(hào):Molecular lmagery ChemiDocTM XRST),流式細(xì)胞儀(BD公司,美國(guó),型號(hào):LSRFortessa)。

1.1.4 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析數(shù)據(jù)庫(kù)及方法 使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)[12]數(shù)據(jù)庫(kù)根據(jù)口服生物利用度(Oral Bioavailability,OB)≥30%和類藥性(Drug Likeness,DL)≥0.18對(duì)QSG中的活性成分及靶點(diǎn)進(jìn)行篩選,通過(guò)人類基因數(shù)據(jù)庫(kù)(The Human Gene Database,GeneCards)(https://www.genecards.org/)[13]、人類孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)(Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM)(https://omim.org/)[14]及遺傳藥理學(xué)與藥物基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)(Pharmacogenetics and Pharmacogenomics Knowledge Base,PharmGKB)(https://www.pharmgkb.org/)[15]等數(shù)據(jù)庫(kù)以“Doxorubicin/Adriamycin Myocardial Injury”為關(guān)鍵詞對(duì)阿霉素心臟損傷疾病靶點(diǎn)進(jìn)行篩選,而后取QSG和阿霉素心肌損傷的交集靶點(diǎn)輸入蛋白互作數(shù)據(jù)庫(kù)(Search Tool for the Retrieval of Interaction Gene/Proteins,STRING)(https://cn.string-db.org/)[16]數(shù)據(jù)庫(kù),物種設(shè)置為“Homo Sapiens”,獲得蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein Interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò),下載此相互作用網(wǎng)絡(luò)的TSV格式文件,導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行可視化分析,使用其Cytohubba插件篩選核心靶點(diǎn),MCODE插件進(jìn)行交集靶點(diǎn)的聚類分析。將聚類后得到前2個(gè)模塊的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)導(dǎo)入Hiplot(https://hiplot.com.cn/)數(shù)據(jù)庫(kù),閾值為P<0.01,進(jìn)行京都基因和基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析的篩選,選取前10個(gè)條目繪制成氣泡圖。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 本實(shí)驗(yàn)選SPF級(jí)C57BL/6J雄性健康小鼠30只,入組時(shí)體質(zhì)量(20±2)g,在動(dòng)物房適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后,根據(jù)隨機(jī)數(shù)字法分為正常組、阿霉素組、芪參顆粒低劑量組、芪參顆粒高劑量組和陽(yáng)性藥物普伐他汀組,每組6只。阿霉素組和給藥組(芪參顆粒低劑量組、芪參顆粒高劑量組和陽(yáng)性藥物普伐他汀組)小鼠在實(shí)驗(yàn)的第1天和第4天尾靜脈注射阿霉素,劑量為6 mg/kg,累計(jì)劑量為12 mg/kg;正常組則尾靜脈注射等體積的生理鹽水。

1.2.2 給藥方法 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前5 d,對(duì)QSG給藥小鼠灌胃給藥,根據(jù)等效劑量換算芪參顆粒給藥劑量,低劑量組為2.5 g/kg,高劑量組為5 g/kg;給予陽(yáng)性藥物組的小鼠灌胃普伐他汀40 mg/kg;同時(shí),給予空白對(duì)照組和模型組小鼠等體積的生理鹽水灌胃,累計(jì)12 d,實(shí)驗(yàn)第7天進(jìn)行超聲取材,實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.3.1 心臟超聲檢測(cè) 對(duì)各組小鼠進(jìn)行超聲檢查以評(píng)估心功能。取胸骨旁短軸切面,由超聲引導(dǎo)M型曲線進(jìn)行檢測(cè),相關(guān)參數(shù)包括心臟射血分?jǐn)?shù)(Ejection Fraction,EF)和短軸縮短分?jǐn)?shù)(Fractional Shortening,FS)。

1.2.3.2 病理學(xué)檢測(cè) 心肌組織在4%多聚甲醛中充分固定后,置于包埋框中進(jìn)行石蠟包埋,切片。經(jīng)蘇木精-伊紅(Hematoxylin Eosin,HE)染色后制作病理切片,在超分辨顯微成像系統(tǒng)拍攝圖像以分析心臟組織局部病理改變。

1.2.3.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) 將心臟組織在低溫條件下充分研磨,蛋白質(zhì)定量試劑盒(Bicinchoninic Acid Assay,BCA)方法蛋白定量后,用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis,SDS-PAGE)(10%)對(duì)蛋白樣品進(jìn)行電泳分離并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(Polyvinylidene Fluoride,PVDF)膜上;將膜與一抗在4 ℃下孵育過(guò)夜,二抗在室溫孵育1.5 h,再用Omni-ECLTM增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(Omni-ECLTMEnhanced Pico Light Chemiluminescence Kit,Omni-ECLTM)在凝膠成像儀中曝光成像。最后,使用Image-Lab軟件對(duì)條帶的灰度進(jìn)行分析,以統(tǒng)計(jì)目的蛋白在不同組中的差異。

1.2.3.4 流式多因子檢測(cè)技術(shù)CBA(Cytometic Bead Array,CBA) 首先使用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑(Cell Counting Kit-8,CCK8)法對(duì)QSG的無(wú)毒范圍和有效范圍進(jìn)行濃度梯度的篩選。而后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9C2細(xì)胞,用含10%胚牛血清的高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后,棄上清液,加入濃度為800 μg/mL QSG預(yù)給藥24 h。棄上清液,1 μmol/L阿霉素刺激的同時(shí)給予800 μg/mL的QSG,24 h后進(jìn)行收集上清,用于后續(xù)細(xì)胞因子的檢測(cè)。具體參照說(shuō)明書(shū)的方法如下,向帶有濾膜(0.22 μm)的96孔板中加入Wash Buffer進(jìn)行潤(rùn)洗,對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋;向孔中分別加入一定體積的Th1/2/17 Capture Beads混合液(40 μL/孔)、標(biāo)準(zhǔn)品或樣品(50 μL/孔)和Mouse Th1/2/17 PE Detection Reagent(40 μL/孔),在室溫條件下孵育2 h,離心去除多余液體,每孔加入120 μL的Wash Buffer,充分混勻珠子,并將珠子轉(zhuǎn)移至新的U型96孔板內(nèi);流式上機(jī)檢測(cè),用FCAP Array軟件分析樣品中細(xì)胞因子的含量。

1.2.3.5 癌細(xì)胞活力測(cè)定 使用CCK-8試劑盒評(píng)估細(xì)胞活性。將MCF-7人乳腺癌細(xì)胞接種在96孔板中,每孔設(shè)有5 000個(gè)細(xì)胞,待1 μmol/L阿霉素造模24 h后每孔加入100 μL含10%CCK-8的完全培養(yǎng)液孵育2 h,培養(yǎng)至檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)后取出培養(yǎng)板,放置酶標(biāo)儀中450 nm處測(cè)定各組光密度(Optical Density,OD)值。

2 結(jié)果

2.1 QSG改善阿霉素誘導(dǎo)的心臟功能障礙 與空白對(duì)照組比較,模型組小鼠的EF和FS顯著降低(P<0.01)。而在不同劑量的QSG治療后,小鼠的EF和FS值顯著升高(P<0.01)。圖1。

圖1 QSG改善小鼠阿霉素誘導(dǎo)的心肌損傷的心功能

2.2 QSG緩解阿霉素誘導(dǎo)的心肌組織損傷 空白對(duì)照組小鼠心肌細(xì)胞排列整齊,形態(tài)完整且著色均勻,細(xì)胞核無(wú)明顯結(jié)構(gòu)性改變。模型組心肌細(xì)胞排列松散,心肌纖維橫紋不清楚甚至消失不見(jiàn),并伴有明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),正常結(jié)構(gòu)喪失。經(jīng)不同劑量QSG治療后,小鼠心肌細(xì)胞排列整齊,且炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少,病理變化被顯著改善。見(jiàn)圖2。

2.3 QSG治療阿霉素心肌損傷的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析 篩選出174種化學(xué)成分,261個(gè)基因靶點(diǎn);疾病基因合并去重后獲得1 521個(gè)基因,二者交集靶點(diǎn)為156個(gè)。排名前10的Hub基因分別為:信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(Signal Transduction and Transcriptional Activator 3,STAT3)、白細(xì)胞介素6(Interleukin 6,IL6)、腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor,TNF)、白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、蛋白激酶B1(Protein Kinase B1,AKT1)、半胱氨酸蛋白酶3(Apoptosis-Related Cysteine Peptidase,CASP3)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VAscular Endothelial Growth Factor A,VEGFA)、TP53、過(guò)氧化物合酶2(Peroxidase Synthase 2,PTGS2)、禽肉瘤病毒17的假定轉(zhuǎn)化基因(V-Jun Avian Sarcoma Virus 17 Oncogene Homolog,JUN)(圖3A)。模塊一包括CASP3、JUN、AKT1等共70個(gè)靶標(biāo)蛋白(圖3B),模塊二包括小窩蛋白1(Caveolin1,CAV1)、熱休克蛋白B1(Heat Shock Protein B1,HSPB1)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 Associated X Protein,BAX)等共21個(gè)靶標(biāo)蛋白(圖3C)。模塊一KEGG共富集到142條通路,結(jié)果顯示,主要與IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、Toll-like Receptor等炎癥及癌癥信號(hào)通路相關(guān);模塊二共富集到56條生物條目,結(jié)果顯示,主要與絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen Activated Protein Kinase,MAPK)、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(Phosphatidylinositol 3 Kinase/protein Kinase B,PI3K/AKT)、p53及癌癥信號(hào)通路等。

圖2 各組小鼠的心臟組織損傷情況(HE染色,×20)

2.4 QSG對(duì)PI3K/AKT及MAPK通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組比較,模型組小鼠心肌細(xì)胞磷酸化蛋白激酶B(Phosphorylated-protein Kinase B,p-AKT)的表達(dá)量顯著下降,磷酸化絲裂原活化蛋白激酶(Phosphorylated Mitogen Activated-protein Kinase,p-MAPK)及磷酸化核因子κB(Phosphorylated Nuclear Factor-κB,p-NF-κB)的表達(dá)量顯著升高;與模型組比較,QSG觀察組小鼠心肌細(xì)胞p-AKT表達(dá)量顯著升高,p-MAPK及p-NFκB的表達(dá)量顯著降低。見(jiàn)圖4。

2.5 QSG對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞相關(guān)炎癥指標(biāo)的影響 結(jié)果顯示,與空白組比較,阿霉素顯著提高了H9C2細(xì)胞中炎癥介質(zhì)γ干擾素(Interferon-γ,IFN-γ)、IL-6、IL-17A和TNF的水平,而QSG可逆轉(zhuǎn)阿霉素誘導(dǎo)的相關(guān)炎癥介質(zhì)水平的升高。見(jiàn)圖5。

圖3 QSG治療阿霉素心肌損傷的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

圖4 QSG對(duì)小鼠心臟組織p-AKT、p-MAPK及p-核因子κB蛋白的影響

2.6 QSG不影響阿霉素的抗腫瘤活性 CCK-8結(jié)果顯示,與單獨(dú)使用阿霉素比較,聯(lián)合使用QSG后未減弱阿霉素對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用。見(jiàn)圖6。

圖5 QSG對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞相關(guān)炎癥指標(biāo)的影響

圖6 QSG對(duì)阿霉素抗腫瘤效果的影響

3 討論

阿霉素是一種廣泛使用的化療藥物,可提高癌癥患者的生存率,但會(huì)誘發(fā)不可逆的心肌損傷[17]。多項(xiàng)研究表明,阿霉素誘發(fā)的心肌損傷與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及凋亡的發(fā)生密切相關(guān)[18-19]。中醫(yī)理論認(rèn)為阿霉素誘發(fā)心肌損傷的主要病機(jī)是心陽(yáng)受損或心之氣陰不足,推動(dòng)血液無(wú)力,氣滯血瘀,以氣虛氣滯夾瘀為主,推薦使用溫陽(yáng)益氣類藥物進(jìn)行治療。QSG作為溫陽(yáng)益氣類方劑,由黃芪、丹參、玄參、金銀花、甘草、附子等6味中藥組成,在多種心力衰竭動(dòng)物模型中表現(xiàn)出對(duì)心功能有顯著的改善作用,而且在臨床使用的過(guò)程中也具有比較顯著的治療效果[8-9]。但是關(guān)于QSG治療阿霉素心肌損傷的報(bào)道尚不多,其藥效物質(zhì)及作用機(jī)制不清。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門研究疾病機(jī)制和藥物作用機(jī)制的新學(xué)科,其主要目標(biāo)是多層次、多角度、更系統(tǒng)地解釋中藥復(fù)方成分復(fù)雜,治療疾病的活性成分不清晰等問(wèn)題,被廣泛用于探索中藥治療疾病的分子藥理學(xué)機(jī)制的研究[20-21]。故本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析及體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,初步探析QSG治療阿霉素心肌損傷的作用機(jī)制,以期為QSG的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。我們首先采用體內(nèi)尾靜脈注射阿霉素的方式構(gòu)建阿霉素心臟損傷模型,通過(guò)超聲心動(dòng)圖和病理組織染色等對(duì)QSG的藥效進(jìn)行了評(píng)價(jià)。超聲結(jié)果顯示:與阿霉素組比較,經(jīng)QSG治療后,小鼠心臟EF值和FS值顯著增加,表明QSG給藥后可改善阿霉素誘導(dǎo)的心功能障礙。HE是常用的組織學(xué)及病理學(xué)檢測(cè)的基本方法,可直觀反映小鼠心肌組織形態(tài)與結(jié)構(gòu)的改變。結(jié)果顯示,空白對(duì)照組小鼠心肌細(xì)胞排列有序,形態(tài)完整;在模型組中觀察到心肌纖維斷裂,心肌細(xì)胞排列紊亂及炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)。與模型組比較,QSG組表現(xiàn)出心肌細(xì)胞排列紊亂狀態(tài)改善,細(xì)胞核趨于完整,且炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少,表明QSG減輕了阿霉素誘導(dǎo)的小鼠心臟的病理改變。

而后我們從PPI網(wǎng)絡(luò)互作結(jié)果發(fā)現(xiàn)QSG治療阿霉素心肌損傷的核心靶點(diǎn)主要STAT3、IL6、TNF、IL1B、AKT1、CASP3、VEGFA、TP53、PTGS2。一些研究表明,心臟STAT3可通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡和自噬來(lái)預(yù)防阿霉素誘導(dǎo)的心肌病[22-23],此外可參與調(diào)控血管穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵生長(zhǎng)因子VEGFA的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),減少阿霉素誘導(dǎo)的心肌損傷[24]。AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,參與細(xì)胞存活、增殖和代謝的調(diào)節(jié),在阿霉素處理的小鼠心臟中其活性受到抑制[25]。越來(lái)越多的研究表明,AKT激活可預(yù)防阿霉素引起的心肌細(xì)胞凋亡,而抑制AKT的活性則會(huì)加重阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和心功能障礙[26-27]。IL-6、TNF、IL-1β是炎癥介質(zhì),據(jù)報(bào)道,核因子κB可在阿霉素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷后的1 h內(nèi)被激活,激活的核因子κB可誘導(dǎo)合成TNF-α、IL-1β及IL-6等炎癥介質(zhì),這些炎癥介質(zhì)可形成炎癥反應(yīng)微環(huán)境并募集白細(xì)胞進(jìn)入心肌,進(jìn)而加重炎癥反應(yīng)損傷[28-33]。

根據(jù)KEGG通路富集分析,QSG治療阿霉素心肌損傷與IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、Toll-like Receptor信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、PI3K/AKT信號(hào)通路及癌癥信號(hào)通路等相關(guān),大多數(shù)參與炎癥反應(yīng),提示炎癥反應(yīng)在QSG治療阿霉素心肌損傷中發(fā)揮重要作用。其中MAPK是真核生物中一組高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,由p38-MAPK激酶(p38-MAPKα,β,γ和δ亞型)、c-jun氨基末端激酶(JNK1-3)和胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1-2(Extracellular Signal-regulated Kinase1-2,ERK1-2)組成,該通路的功能是調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)有絲分裂和胞外刺激的反應(yīng)[34]。PI3K/AKT信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)最重要的信號(hào)通路之一,在細(xì)胞代謝、細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)等基本細(xì)胞活動(dòng)中起主要作用[35]。既往的研究發(fā)現(xiàn),MAPK和PI3K/AKT信號(hào)通路與自身免疫性疾病[36-37]、炎癥疾病[38-39]、心血管疾病[40-41]、癌癥[42-43]和神經(jīng)退行性疾病[44-45]等密切相關(guān),并針對(duì)其開(kāi)發(fā)出一系列的藥物。在阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性模型中,炎癥反應(yīng)是阿霉素導(dǎo)致心臟毒性的一個(gè)重要病理特征,研究者們也對(duì)MAPK和PI3K/AKT信號(hào)通路進(jìn)行了一系列研究。據(jù)報(bào)道,阿霉素激活p38 MAPK,JNK,ERK和NFκB可誘導(dǎo)心臟組織炎癥反應(yīng)[46]。SHI等[47]發(fā)現(xiàn)甘草素可以抑制阿霉素誘導(dǎo)的小鼠心臟組織中p65、IκBα和磷酸化的p38 MAPK、JNK和ERK的水平,表明其可以通過(guò)抑制MAPK/NFκB途徑發(fā)揮對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性的抗炎作用。THANDAVARAYAN等[48]發(fā)現(xiàn)五味子苷B以劑量依賴性的方式減弱阿霉素誘導(dǎo)的小鼠心臟p38 MAPK的激活和IL-1β,IL-16和TNF-α等炎癥介質(zhì)的表達(dá),進(jìn)而發(fā)揮抗炎作用。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)阿霉素也通過(guò)下調(diào)PI3K/AKT生存途徑誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡[49]。YU等[50]發(fā)現(xiàn)姜黃素通過(guò)PI3K/AKT依賴性方式抑制阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞焦亡,進(jìn)而改善阿霉素誘導(dǎo)的心肌損傷。同樣的,SAHU等[51]發(fā)現(xiàn)芹菜素和阿魏酸對(duì)阿霉素處理的大鼠心肌細(xì)胞表現(xiàn)出濃度依賴性的保護(hù)作用,其主要的機(jī)制與PI3K/AKT信號(hào)通路密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)QSG可以顯著減輕阿霉素誘導(dǎo)的小鼠心臟組織中炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn),并且其可以抑制阿霉素處理的H9C2中IFN-γ、IL-6、IL-17A和TNF等炎癥介質(zhì)的水平,減輕炎癥反應(yīng)。在QSG的抗炎機(jī)制中,我們發(fā)現(xiàn)QSG可抑制心臟組織中p-MAPK及p-核因子κB的表達(dá),并促進(jìn)p-AKT的水平。因此,QSG可以在體內(nèi)和體外表現(xiàn)出明顯的抗炎能力,具體機(jī)制可能與核因子κB、MAPK和PI3K/AKT信號(hào)通路有關(guān)。

為了評(píng)價(jià)與QSG聯(lián)用后是否會(huì)影響阿霉素本身的抗腫瘤效果,本研究使用人乳腺癌細(xì)胞MCF-7進(jìn)行驗(yàn)證。CCK-8結(jié)果表明在與QSG聯(lián)用后,MCF-7的細(xì)胞活力與模型組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明阿霉素與QSG聯(lián)用后不會(huì)影響阿霉素本身的抗腫瘤效果。

4 小結(jié)

綜上所述,本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)系統(tǒng)分析了QSG治療阿霉素心肌損傷的潛在機(jī)制,并通過(guò)體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)了QSG治療阿霉素心肌損傷的有效性及安全性,主要表現(xiàn)為減少炎癥反應(yīng)損傷并且不影響阿霉素本身的抗腫瘤效果,從而改善心功能。但本研究只是對(duì)QSG抗阿霉素心肌損傷的機(jī)制進(jìn)行了初步探究,后續(xù)還需要更多的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證,比如對(duì)動(dòng)物進(jìn)行敲減基因的處理,對(duì)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)使用干擾小分子或抑制劑來(lái)抑制相關(guān)蛋白的表達(dá),進(jìn)一步明確QSG治療阿霉素心肌損傷的確切機(jī)制,從而為闡明QSG的作用機(jī)制奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

利益沖突聲明:無(wú)。