陳麗霞 葉麗芳 張 英,2 吳孟華,2 曹 暉,3 馬志國,3

(1 暨南大學(xué)嶺南傳統(tǒng)中藥研究中心,廣州,511400; 2 國家中藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心嶺南資源分中心,廣州,511400; 3 廣東省中醫(yī)藥信息化重點(diǎn)實(shí)驗室,廣州,510632)

干燥的中藥材在切制前通常會進(jìn)行適當(dāng)?shù)能浕幚?使其質(zhì)地變得柔軟適中,便于切制。而潤法便是常用的軟化處理方法。另外,在達(dá)到切制要求的前提下,盡可能減少與水接觸的時間,減少有效成分的流失,做到藥材軟硬適度、藥透水盡、避免傷水[1]。但是,檢查軟化程度是否符合切制要求的評判標(biāo)準(zhǔn)過于依賴人的主觀感受,主要是憑老藥工的主觀經(jīng)驗,傳統(tǒng)經(jīng)驗的科學(xué)性得不到合理解析[2]。因此,對潤制過程中藥材的軟化程度進(jìn)行科學(xué)解析是很有必要的。

近年來,由于低場核磁共振(Low-field Nuclear Magnetic Resonance,LF-NMR)及磁共振成像技術(shù)(Magnetic Resonance Imaging,MRI)具有準(zhǔn)確、快速、無毒、無害的優(yōu)點(diǎn),已被應(yīng)用于農(nóng)作物體內(nèi)水分變化、油脂組成、品質(zhì)等的測定[3-4]。質(zhì)構(gòu)儀又叫物性測定儀,由于其客觀性強(qiáng)、操作性強(qiáng),也越來越受到研究人員的青睞,已廣泛應(yīng)用于各領(lǐng)域[5]。LF-NMR和質(zhì)構(gòu)儀可從水分和質(zhì)地兩方面分別闡釋藥材的潤制機(jī)制。劉慶珊等[6]采用LF-NMR/MRI、質(zhì)構(gòu)儀表征白芍的潤制過程,對研究白芍軟化“看水頭”的傳統(tǒng)經(jīng)驗的數(shù)據(jù)化表征提供了一種客觀的評價手段。中藥潤制其實(shí)是一個動態(tài)的吸水膨脹過程,研究其動力學(xué)過程,可為優(yōu)選藥材潤制工藝參數(shù)、表征中藥潤制過程提供理論數(shù)據(jù)依據(jù)。采用吸水動力學(xué)結(jié)合LF-NMR/MRI、質(zhì)構(gòu)儀研究中藥潤制過程,為闡明中藥潤制傳統(tǒng)經(jīng)驗的科學(xué)內(nèi)涵提供了客觀依據(jù)[7-9]。

肉蓯蓉為列當(dāng)科植物肉蓯蓉CistanchedeserticolaY.C.Ma或管花肉蓯蓉Cistanchetubulosa(Schenk)Wight干燥帶鱗葉的肉質(zhì)莖,具有補(bǔ)腎陽、益精血、通腸潤便的功效[10]。肉蓯蓉片的炮制方法為“除去雜質(zhì),洗凈,潤透,切厚片,干燥”。但關(guān)于肉蓯蓉炮制的研究多以酒肉蓯蓉、黑豆制肉蓯蓉蒸制的化學(xué)成分變化為主,缺少對肉蓯蓉潤制過程中水分及質(zhì)地變化的研究[11-12]。本研究以肉蓯蓉為研究對象,在潤制動力學(xué)的基礎(chǔ)上,利用LF-NMR和質(zhì)構(gòu)儀對潤制過程中水分分布和質(zhì)地進(jìn)行直觀、量化表征,為肉蓯蓉潤制關(guān)鍵技術(shù)參數(shù)的確定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材 肉蓯蓉藥材購自內(nèi)蒙古巴彥淖爾市,經(jīng)暨南大學(xué)馬志國教授鑒定為列當(dāng)科植物肉蓯蓉CistanchedeserticolaY.C.Ma干燥帶鱗葉的肉質(zhì)莖。參照中華中醫(yī)藥學(xué)會2018年發(fā)布的《中藥材商品規(guī)格等級——肉蓯蓉》,同時結(jié)合樣品實(shí)際情況,對肉蓯蓉藥材進(jìn)行分檔:中部直徑>2.5 cm定為大檔;2 cm<中部直徑≤2.5 cm定為中檔;中部直徑≤2 cm定為小檔[13]。

1.1.2 試劑與儀器 松果菊苷(批號:PFS-S00301904003,純度>98%)、肉蓯蓉苷A(批號:PFS-R05002009014,純度>98%)、毛蕊花糖苷(批號:M-011-181106,純度>98%)均購自成都瑞芬思生物科技有限公司,甲酸(上海麥克林生化科技有限公司,批號:C14200290)、甲醇[賽默飛世爾科技(中國)有限公司,批號:F22M77201]均為色譜純,甲醇(上海泰坦科技股份有限公司,批號:P2219181),為分析純;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗設(shè)備有限公司,型號:DHG-9123A)、質(zhì)構(gòu)儀(Stable Micro System公司,英國,型號:TA-HD plus)、中尺寸核磁共振成像分析儀(上海紐邁分析儀器股份有限公司,型號:MesoMR23-060H-1)、液相色譜儀[賽默飛世爾科技(中國)有限公司,型號:U-3000]、萬分之一電子天平(上海佑科儀器儀表有限公司,型號:FA 2204B)、十萬分之一天平(奧豪斯儀器有限公司,型號:EX225DZH)、數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司,型號:KQ5200DE)。

1.2 方法

1.2.1 潤制過程吸水動力學(xué)和膨脹動力學(xué)考察 稱取大中小檔肉蓯蓉藥材各約500 g,稱重,采用排水法測量體積。將藥材放入潤制容器中,用濕紗布覆蓋,潤制過程中每4 h稱重1次,同時測量不同潤制時間藥材的體積,計算各時間點(diǎn)樣品的吸水率及膨脹率,平行操作3次,計算平均值。吸水率=(Mn-M0)/M0×100%,式中Mn為不同潤制時間肉蓯蓉的質(zhì)量,M0為肉蓯蓉初始質(zhì)量;膨脹率=(Vn-V0)/V0×100%,式中Vn為不同潤制時間肉蓯蓉的體積,V0為肉蓯蓉初始體積。

1.2.2 吸水動力學(xué)、膨脹動力學(xué)非線性擬合 采用Origin 2021 64Bit軟件,以潤制時間(h)為橫坐標(biāo),分別以藥材的吸水率(%)和膨脹率(%)為縱坐標(biāo),對肉蓯蓉潤制過程進(jìn)行動力學(xué)非線性擬合。

1.2.3 潤制過程水分遷移分析 橫向弛豫時間(Transverse Relaxation Time,T2)測定:取不同潤制時間的中檔肉蓯蓉樣品,用吸水紙吸去表面水分后稱重,放入永久磁場的中心位置,利用多脈沖回波序列(Carr-purcell-meiboom-gill,CPMG)檢測樣品T2,平行測定3次,取平均值。采用CPMG掃描采集核磁信號,通過調(diào)整多層自旋回波序列(Multi-slice Spin Echo,MSE)的選層梯度、相位編碼梯度和頻率編碼梯度,分別獲取樣品俯視和正視成像數(shù)據(jù),然后利用sirt算法,迭代次數(shù)為100 000次進(jìn)行反演得到T2譜圖。T2試驗主要參數(shù):主頻為21 MHz,偏移頻率為252 158.18 Hz,90°脈寬為8.00 μs,180°脈寬為17.04 μs,累加采集次數(shù)為4,回波時間為0.300 ms,回波個數(shù)為8 000,采樣頻率為100 kHz。T2可以反映氫質(zhì)子所受的束縛力及其自由度,H質(zhì)子所受束縛越小或自由度越大,T2弛豫時間越長,在T2圖譜上峰位置較靠右;反之則T2弛豫時間越短,在T2譜上峰位置較靠左[14]。肉蓯蓉潤制過程中H質(zhì)子主要源于水分子,所以可以通過弛豫時間的變化來分析物質(zhì)的含水量和水分分布[15]。T2在0.1～10 ms之間的可表示為結(jié)合水T21,10～100 ms之間的可表示自由水T22,而100～1 000 ms之間的可表示為油脂T23[16]。

MRI檢測:采用MSE采集T2測定項下各樣品橫斷面的氫(Hydrogenium,H)質(zhì)子密度圖像,使用圖像處理軟件繪制和處理MRI圖像。MRI成像參數(shù):層數(shù)6,層厚2 mm,層間隙1 mm,采集次數(shù)4,重復(fù)時間1 000 ms,回波時間20 ms,視野100 mm×100 mm,頻率方向256,編碼步數(shù)192。MRI利用現(xiàn)代空間編碼技術(shù)處理H質(zhì)子磁共振信號來獲得H質(zhì)子的密度圖像,進(jìn)而得到水分在樣品的內(nèi)部分布情況[17]。MRI圖像為灰度圖,亮度越高說明H質(zhì)子狀態(tài)越活躍,亮度低則反之[18]。用圖像處理軟件將灰度圖轉(zhuǎn)化為偽彩圖,能更好地判斷圖像的細(xì)節(jié)部分。

1.2.4 潤制過程質(zhì)構(gòu)特性分析 采用質(zhì)構(gòu)儀測定1.2.3項下各樣品的質(zhì)構(gòu)特性,參數(shù)設(shè)置:選用TA-9探頭,觸發(fā)點(diǎn)載荷4 g,預(yù)測試速度2 mm/s,測試速度1.5 mm/s,返回速度1.5 mm/s,穿刺距離10 mm,每個樣品重復(fù)測定3次,選擇負(fù)載單元為10 000 g的質(zhì)構(gòu)儀感應(yīng)元件?？色@得物性指標(biāo)有:樣品硬度(g)、壓縮循環(huán)功(mJ)、黏力(g)、黏性(mJ)、膠著性(g)等。采用Origin 2021 64Bit軟件進(jìn)行分析處理。

1.2.5 潤制過程中浸出物考察 將1.2.3項中不同潤制時間的肉蓯蓉樣品,切片,干燥,按照2020年版《中華人民共和國藥典》中肉蓯蓉項下浸出物的測定方法,分別測定各樣品的浸出物含量[10]。

1.2.6 潤制過程中指標(biāo)性成分考察 1)色譜條件:采用COSMOSIL Packed Column 5C18-MS-Ⅱ(250 mm×4.6 mm)色譜柱;流動相為甲醇(A)-0.1%甲酸溶液(B),梯度洗脫(0 min,30%A;30 min,40%A;35 min,30%A;40 min,30%A),流速1.0 mL/min;柱溫30 ℃;檢測波長330 nm;進(jìn)樣量為10 μL。2)對照品溶液的制備:取松果菊苷、肉蓯蓉苷A、毛蕊花糖苷的對照品適量,精密稱定,加30%甲醇制成每1 mL含松果菊苷、肉蓯蓉苷A、毛蕊花糖苷分別為1.02 mg、0.23 mg、1.30 mg的混合溶液,即得。3)供試品溶液的制備:取不同潤制時間的干燥肉蓯蓉粉末(65目)1 g,精密稱定,加70%甲醇溶液50 mL,稱量,浸泡30 min后,超聲提取30 min,放冷后加70%甲醇補(bǔ)足減失的量,濾過,取續(xù)濾液以0.45 μm微孔濾膜濾過,即得[19]。

2 結(jié)果

2.1 吸水動力學(xué)與膨脹動力學(xué)

2.1.1 吸水動力學(xué)/膨脹動力學(xué)曲線 36 h內(nèi),肉蓯蓉的吸水率和膨脹率隨著潤制時間的增加而增大,且在同一溫度下,肉蓯蓉檔次越小,吸水率和膨脹率越大。另外,在同一檔次下,溫度越高吸水率和膨脹率越大;不同檔次的潤制終點(diǎn)也不同。見圖1。

圖1 肉蓯蓉吸水動力學(xué)及膨脹動力學(xué)曲線

圖2 肉蓯蓉吸水動力學(xué)及膨脹動力學(xué)擬合曲線

2.1.2 吸水動力學(xué)和膨脹動力學(xué)擬合曲線 肉蓯蓉吸水動力學(xué)和膨脹動力學(xué)非線性擬合曲線及方程,肉蓯蓉潤制過程吸水率與膨脹率的變化情況可被ExpDec1非線性方程擬合,R2均達(dá)到98.9%以上,擬合效果良好。這表明肉蓯蓉潤制過程中吸水率和膨脹率隨潤制時間的變化曲線符合一級動力學(xué)方程:y=A1*exp(-x/t1)+y0。此模型可簡單預(yù)測各檔次肉蓯蓉在10 ℃、20 ℃、30 ℃下不同潤制時間的吸水率和膨脹率,可及時了解肉蓯蓉潤制過程中的水分含量變化,避免藥材在潤制過程中造成傷水,有利于保證飲片質(zhì)量。見圖2,表1～2。

表1 肉蓯蓉潤制過程中吸水動力學(xué)擬合參數(shù)值

2.2 潤制過程水分遷移分析

2.2.1 T2測定 肉蓯蓉潤制過程中,水分的狀態(tài)和變化。在譜圖上有出現(xiàn)3個波峰,根據(jù)T2的差異將水劃分為3種存在狀態(tài)。潤制開始時,內(nèi)部所含水分幾乎均為結(jié)合水T21,隨著潤制時間的增加,自由水T22比例增加。24 h時T21峰面積比例為14.484%,T22峰面積比例為85.005%。見圖3,表3。

表2 肉蓯蓉潤制過程中膨脹動力學(xué)擬合參數(shù)值

2.2.2 MRI檢測 隨著潤制時間的增加,水分逐漸由外向內(nèi)滲入。24 h時,表皮和皮層區(qū)已是亮黃色,說明含水量高。但是由于肉蓯蓉含糖量高,髓部本身較柔軟,此時內(nèi)外硬度已經(jīng)一致。繼續(xù)潤制,內(nèi)部水分含量也并未顯著增長。見圖4。

2.3 潤制過程質(zhì)構(gòu)特性分析 隨著潤制時間的增加,肉蓯蓉各物性指標(biāo)逐漸下降。24 h時,肉蓯蓉內(nèi)外硬度一致,硬度為1 560 g,此時藥材便于切制,未見傷水;32 h后,各物性指標(biāo)趨于穩(wěn)定,此時切制藥材有水分滲出。見表4,圖5。

表3 肉蓯蓉潤制過程中各峰面積變化(n=3)

圖3 肉蓯蓉潤制過程的T2譜圖

圖4 不同潤制時間肉蓯蓉MRI偽彩圖

圖5 不同潤制時間肉蓯蓉的質(zhì)構(gòu)變化

2.4 潤制過程中浸出物和指標(biāo)成分變化 隨著潤制時間的增加,浸出物有逐漸下降趨勢;松果菊苷、肉蓯蓉苷A、毛蕊花糖苷含量未發(fā)生明顯變化。這說明肉蓯蓉在潤制36 h內(nèi),所含成分未損失。見表5。

3 討論

中藥切制前,常需要對藥材進(jìn)行軟化處理,使干燥的藥材質(zhì)地變軟,利于切制[20]。肉蓯蓉一般以片狀入藥,須經(jīng)潤制后才利于切片[21]。另外,對潤制終點(diǎn)的判斷,缺乏可量化的評判指標(biāo),導(dǎo)致潤制工藝難以把握,甚至影響飲片質(zhì)量。本研究基于吸水膨脹動力學(xué)模型結(jié)合LF-NMR/MRI、質(zhì)構(gòu)儀等現(xiàn)代技術(shù)來直觀量化表征肉蓯蓉的潤制機(jī)制,表明肉蓯蓉潤制過程是一個符合一級動力學(xué)吸水膨脹的過程,水分逐漸由外周向中心滲入,硬度逐漸變低。潤制動力學(xué)過程、水分相態(tài)、物性指標(biāo)的結(jié)合可以較好的表征藥材潤制過程,為闡明肉蓯蓉潤制傳統(tǒng)經(jīng)驗提供科學(xué)、可量化的數(shù)據(jù)支持,為優(yōu)選潤制工藝提供科學(xué)依據(jù)。

表4 不同潤制時間肉蓯蓉的質(zhì)構(gòu)變化(n=3)

表5 不同潤制時間肉蓯蓉浸出物和指標(biāo)成分含量變化(%,n=3)

同一溫度下,隨著潤制時間的增加,藥材的吸水率和膨脹率逐漸增大。在同一檔次下,溫度越高,吸水率、膨脹率越大。這可能是隨著溫度的增高,加速了水分子的運(yùn)動,使其擴(kuò)散速度增加,進(jìn)而增加了潤制速度。由擬合曲線可知,可采用一級動力學(xué)解釋肉蓯蓉潤制過程中的吸水、膨脹過程。隨著潤制時間的增加,自由水和結(jié)合水的比例并不是連續(xù)增多或減少,同時,MRI偽彩圖相鄰時間點(diǎn)的圖片亮黃色區(qū)域面積相差不大,24 h達(dá)到適合切制的軟硬程度,繼續(xù)潤制橫切面中心區(qū)域的自由水含量仍然低于儀器檢出限,這說明肉蓯蓉難以潤制。這可能是由于肉蓯蓉髓部細(xì)胞間間隙小,不利于水分滲入[22]。另外,肉蓯蓉的油性也會造成水分難以滲透。對此,可以對藥材孔道大小及多少、藥材潤濕的難易作進(jìn)一步考察,更深入地闡釋藥材的潤制過程。質(zhì)構(gòu)儀可以監(jiān)測潤制過程中藥材各物性指標(biāo)的變化。對質(zhì)構(gòu)儀測試模式和探頭進(jìn)行優(yōu)化,使其更適合中藥炮制。將質(zhì)構(gòu)儀與潤藥機(jī)結(jié)合,利用質(zhì)構(gòu)儀作檢測系統(tǒng),便可實(shí)現(xiàn)潤制的智能化,將傳統(tǒng)經(jīng)驗變成可量化操作的工藝。

利益沖突聲明:無。