摘要：為探索紫花苜蓿（Medicago sativa L.）雄性不育的分子機(jī)制，選取紫花苜蓿細(xì)胞質(zhì)雄性不育系（MSJN1A）與保持系（MSJN1B）花蕾發(fā)育早期的花藥進(jìn)行細(xì)胞學(xué)觀察，并采用高通量Illumine Hiseq2000測(cè)序平臺(tái)，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果注釋、篩選與分析。結(jié)果表明：花粉敗育始于四分體后期，于單核早期出現(xiàn)明顯的不育現(xiàn)象；兩系花藥間共存在4 284個(gè)差異表達(dá)基因（Differentially expressed genes，DEGs）（FDRlt;0.001，|log₂FC|gt;2）；GO功能注釋分析表明，DEGs涉及物質(zhì)代謝、細(xì)胞過程、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性等功能；KEGG通路富集分析表明，DEGs涉及淀粉與蔗糖代謝、戊糖與葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化、糖酵解/糖異生、苯丙烷生物合成等途徑；轉(zhuǎn)錄因子分析表明，DEGs涉及bHLH，MYB，PHD等已知與花粉發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子家族。本研究通過對(duì)紫花苜?；ㄋ幗Y(jié)構(gòu)觀察和轉(zhuǎn)錄組分析，為研究紫花苜蓿雄性不育成因機(jī)制提供參考。

關(guān)鍵詞：紫花苜蓿；雄性不育系；轉(zhuǎn)錄組；細(xì)胞學(xué)

中圖分類號(hào)：S541

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-0435（2023）06-1702-12

Transcriptomic Analysis on the Mechanism of Pollen Abortion in Male Sterile Lines of Alfalfa

YU Wei-jie， MIAO Yi-fan， MU Hai-ting， JIA Xue， YAN Dong， XU Bo*

（College of Forestry and Grass Science， Jilin Agricultural University， Changchun， Jilin Province 130118， China）

Abstract：To explore the molecular mechanism of male sterility in alfalfa （Medicago sativa L.），anthers from early bud development of alfalfa cytoplasmic male sterile lines （MSJN1A） and maintainer lines （MSJN1B） were selected for cytological observation，and the transcriptome was sequenced using the high-throughput Illumine Hiseq2000 sequencing platform，and the sequencing results were then annotated，screened and analysis. The results demonstrated that there were 4284 differentially expressed genes （DEGs） between two lines. GO analysis verified that DEGs were involved in the substance metabolism，cellular processes，transporter protein activities，etc. KEGG analysis indicated that DEGs were enriched in starch and sucrose metabolism，pentose and glucuronide interconversion，glycolysis/gluconeogenesis，and phenyl propane biosynthesis，etc. Transcription factor analysis revealed that DEGs are involved in bHLH，MYB，PHD and other transcription factor families known to be associated with the pollen development. In this work，we observed the anther structure and conducted a transcriptome analysis of alfalfa to provide a reference for studying the mechanism of male sterility in alfalfa.

Key words：Alfalfa;Male sterile lines;Transcriptome;Cytology

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）作為優(yōu)良的蛋白質(zhì)飼料，廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)^［1］。由于我國復(fù)雜的土壤與氣候環(huán)境，牧草種質(zhì)資源保有量較少，加之牧草良種繁育起步較晚，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足生產(chǎn)上的需求，然而我國畜牧業(yè)快速發(fā)展急需大量優(yōu)良牧草新品種^［2］。因此如何快速穩(wěn)定的獲取優(yōu)良的苜蓿新品種是目前急需解決的問題。

苜蓿雜交能有效地提高后代產(chǎn)量與品質(zhì)^［3-4］。然而，雜種優(yōu)勢(shì)的利用受制于各種外界因素，難以高效地大面積推廣。相較其他雜交育種，用雄性不育系作為母本育種，減少去雄的時(shí)間，節(jié)約大量勞動(dòng)力和成本，并且有望在大范圍利用雜種優(yōu)勢(shì)制種^［5］。因此獲取并開發(fā)優(yōu)良細(xì)胞質(zhì)雄性不育系，研究不育形成的原因，是完成紫花苜蓿“三系”配套的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)興起于2008年^［6］。通過對(duì)不同對(duì)象、不同發(fā)育時(shí)期的不同組織中的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行研究，構(gòu)建基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，篩選出關(guān)鍵基因，用以后續(xù)的深入研究。隨著時(shí)間的推移，該技術(shù)已成功應(yīng)用到植物代謝機(jī)制和基因調(diào)控功能的研究之中，并已廣泛應(yīng)用于如玉米（Zea mays L.）^［7］、小麥（Triticum aestivum L.）^［8］、水稻（Oryza sativa L.）、油菜（Brassica campestris L.）^［9］、牽?；ǎ↖pomoea nil）^［10］等植物有關(guān)于雄性不育分子機(jī)制的研究。通過該種研究方法已篩選出許多與育性相關(guān)的基因和轉(zhuǎn)錄因子，如細(xì)胞色素P450（Cytochrome P450）家族中的肉桂酸-4-羥化酶（Cinnamate 4-hydroxylase）催化苯丙素合成的第一步，進(jìn)而合成孢粉素為花藥外壁發(fā)育提供原料^［11］；bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族中的AMS轉(zhuǎn)錄因子（aborted microspores）調(diào)控絨氈層程序性死亡，協(xié)調(diào)孢粉素的生物生成和花藥壁的形成^［12］。此外，該測(cè)序技術(shù)已被用于研究紫花苜蓿生物脅迫和非生物脅迫的響應(yīng)機(jī)制^［13-15］。

本研究選取紫花苜蓿雄性不育系MSJN1A及其同型保持系MSJN1B不同發(fā)育時(shí)期的雄蕊為材料，通過切片觀察比較花藥發(fā)育的形態(tài)區(qū)別，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析的手段比較分析同一時(shí)期兩系雄蕊的差異表達(dá)基因（Differentially expressed genes，DEGs）和代謝通路，為進(jìn)一步解析紫花苜蓿花粉敗育機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

紫花苜蓿細(xì)胞質(zhì)雄性不育系MS-GN，經(jīng)過雜交、輪回自交，篩選出一對(duì)穩(wěn)定的細(xì)胞質(zhì)不育系與保持系^［16-17］，后經(jīng)良種選育，扦插擴(kuò)繁移于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)草學(xué)試驗(yàn)田內(nèi)，將其命名為MSJN1A與MSJN1B。二者在營養(yǎng)生長階段外觀上無明顯區(qū)別；生殖生長階段，MSJN1A無法產(chǎn)生育性正常的花粉粒。

在試驗(yàn)田中，于盛花期選取10組生長階段相同不育系與保持系單株，經(jīng)臨時(shí)花粉切片觀察，選出3組單株，按照花蕾長度分別獲取不同發(fā)育階段的雄蕊^［18］，用鑷子將花蕾的花瓣剝開，用手術(shù)刀將雄蕊切下，用于花藥半薄切片，后剩余樣本于-80℃保存，用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花藥半薄切片的制備 不同發(fā)育階段花藥，用戊二醛溶液臨時(shí)固定，抽真空，后用鋨酸溶液避光室溫固定7 h，依次進(jìn)行室溫脫水，樹脂包埋、切片，最后利用甲苯胺藍(lán)染料進(jìn)行染色^［9］。

1.2.2 花藥總RNA的提取、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與分析 按照花藥切片觀察的結(jié)果，篩選出花藥形態(tài)結(jié)構(gòu)差異明顯的前后時(shí)期。將先前獲取對(duì)應(yīng)發(fā)育階段的雄蕊，使用E.Z.N.A.PLANT RNA Kit（OMEGA） 試劑盒提取花藥RNA，設(shè)置三個(gè)生物學(xué)重復(fù)，使用OneDrop檢測(cè)提取RNA是否符合于后續(xù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的要求。

將樣品交Biomarker Technologies測(cè)序。將測(cè)序獲得的序列與數(shù)據(jù)庫（NR，Swiss-Prot，GO，COG，KOG，KEGG，Pfam）比對(duì)，以獲得相應(yīng)的基因功能注釋信息^［19-20］。

1.2.3 DEGs分析與篩選 采用DESeq2分析花藥早期DEGs集（FDRlt;0.001，F(xiàn)C≥2）^［21］。參照GO功能注釋數(shù)據(jù)庫，對(duì)DEGs按照生物過程、細(xì)胞組分與分子功能分類；參照KEGG通路注釋數(shù)據(jù)庫，并篩選DEGs主要參與的代謝通路；對(duì)DEGs進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子分析。使用軟件TBtools，對(duì)TOP基因與‘中苜1號(hào)’基因組進(jìn)行比對(duì)、注釋。

1.2.4 DEGs定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè) 分別于不育系和保持系花藥發(fā)育早期樣本中提取RNA，參照TOYOBO（FSQ-201 200 reactions）方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄^［22］。按照TAKARA（RR820A）方法在Roche LightCycler 480儀器進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證^［23］。引物使用primer 5.0設(shè)計(jì)，由Sangon進(jìn)行合成純化，引物見表1，β-actin為內(nèi)參基因，以同一發(fā)育階段保持系MSGN1B的雄蕊作為對(duì)照，采用相對(duì)表達(dá)量2^-ΔΔct法計(jì)算^［24］，所有試驗(yàn)均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。使用Excel，SPSS 22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和顯著性檢測(cè)，并使用R語言統(tǒng)計(jì)軟件（R 4.2.2）進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 花藥囊發(fā)育不同階段形態(tài)學(xué)觀察

在花藥發(fā)育的四分體早期，絨氈層細(xì)胞染色較深，不育系與保持系在花藥囊結(jié)構(gòu)形態(tài)上類似。保持系花藥囊中花粉母細(xì)胞經(jīng)減數(shù)分裂為小孢子，花粉粒均勻的分布于花藥囊之中，細(xì)胞核趨于細(xì)胞一邊，液泡變大，絨氈層在此過程中隨之降解。而四分體晚期不育系花藥囊中絨氈層沒有明顯的降解現(xiàn)象，花粉粒呈現(xiàn)不規(guī)則形狀，隨著發(fā)育階段的進(jìn)行，不育系花藥絨氈層依然清晰可見，花粉粒雜亂分布于花藥囊中，花粉粒干癟，存在降解的現(xiàn)象，其不能正常的積累營養(yǎng)物質(zhì)。

2.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果與功能注釋

依據(jù)花藥半薄切片比對(duì)結(jié)果，選取花藥四分體后期與單核早期進(jìn)測(cè)序。測(cè)序原始數(shù)據(jù)共220.34 Gb原始數(shù)據(jù)處理。對(duì)組裝后的基因片段長度進(jìn)行分析（表2），發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄本中1 000～2 000 bp所占比例最高，為23.43%；單基因中200～300 bp所占比例最高，為 33.60%。

2.3 DEGs的統(tǒng)計(jì)和分析

2.3.1 DEGs的篩選與功能注釋 用DESeq2軟件進(jìn)行對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行篩選（|log₂FC|gt;2，F(xiàn)DR＜0.05），結(jié)果顯示：四分體后期與單核早期分別檢測(cè)出57 986和61 538條基因，分別存在2 280和2 509個(gè)DEGs，其中不育系較保持系分別包含1 078和1 358個(gè)上調(diào)表達(dá)基因與1 151和1 358個(gè)下調(diào)表達(dá)基因。將DEGs與各數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)（表3），各時(shí)期分別獲得了1 677與1 761條注釋基因，TOP基因（|log₂FC|gt;4）的詳細(xì)注釋見表4與表5，其中注釋最多的是Nr數(shù)據(jù)庫，分別占DEGs的99.07%與98.07%。

GO功能富集分析注釋如圖3所示，總共有三個(gè)類群，分別是生物過程、細(xì)胞組分和分子功能。經(jīng)統(tǒng)計(jì)表明，本研究DEGs可注釋到GO分類到49個(gè)詞條中，其中，生物過程有20個(gè)小類，集中在細(xì)胞過程、代謝過程、單一生物體過程和生物調(diào)節(jié)；細(xì)胞組分有15個(gè)小類，集中在細(xì)胞、細(xì)胞部分、膜、膜部分和細(xì)胞器；分子功能有14個(gè)小類，集中在結(jié)合、催化活性、轉(zhuǎn)運(yùn)活性和結(jié)構(gòu)分子活性。

KEGG通路分類統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖4所示，DEGs涉及細(xì)胞過程、環(huán)境信息處理、基因信息處理、代謝五個(gè)大類超過20個(gè)通路，進(jìn)一步篩選出了已知參與花藥育性的DEGs顯著富集于以下代謝通路：其他次級(jí)代謝物的生物合成；碳水化合物的代謝；能量代謝；折疊、分類和降解；脂質(zhì)代謝；其他氨基酸的代謝；復(fù)制和修復(fù)等。

2.3.2 花藥發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子分析 獲得的Unigene中有106個(gè)DEGs被注釋為轉(zhuǎn)錄因子與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，其中注釋最多的是AP2/ERF-ERF（14個(gè)）、B3（11個(gè)）、Others（7個(gè)）、TRAF（7個(gè)）等（圖5）。其中包含了幾個(gè)已知參與花粉發(fā)育關(guān)鍵代謝的家族，如MYB家族中的MYB 35（c91687.graph_c0）與PHD家族中的PHD finger protein male sterility 1 （c89108.graph_c0）。

2.3.3 qRT-PCR驗(yàn)證 為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果，從不同代謝途徑，選取10條差異基因進(jìn)行檢驗(yàn)，qRT2PCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序所得表達(dá)模式相類似（圖6），但也存在個(gè)別基因的表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果不相符，可能是該基因表達(dá)量較低造成的。

3 討論

絨氈層存儲(chǔ)大量物質(zhì)，隨著花粉粒發(fā)育，絨氈層細(xì)胞會(huì)發(fā)生程序性死亡^［24］。其中存儲(chǔ)的物質(zhì)被釋放，糖類、脂肪酸類和苯丙烷類相關(guān)代謝活動(dòng)變得活躍，產(chǎn)生蔗糖、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等不同物質(zhì)^［25］。這些物質(zhì)被運(yùn)輸至花粉室中，通過一系列酶的催化反應(yīng)生成孢粉素等一系列結(jié)構(gòu)物質(zhì)，最終形成花粉壁^［26］?；ǚ郾诘男纬蔀榛ǚ哿５陌l(fā)育提供隔絕外界環(huán)境干擾的屏障，從而抵御病原體攻擊、避免了花粉脫水和紫外線照射^［11］。由花藥半薄切片結(jié)果推斷，花粉敗育可能與絨氈層降解及花粉外壁結(jié)構(gòu)異常有關(guān)。因此，選取四分體后期與單核早期進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

將測(cè)序得到的DEGs進(jìn)行富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其被顯著富集于與花粉育性相關(guān)的代謝通路中，如苯丙烷代謝途徑、脂肪酸代謝途徑、淀粉與蔗糖途徑等。其中苯丙烷代謝途徑有兩個(gè)重要的代謝分支：一個(gè)是類黃酮生物合成，另一個(gè)是木質(zhì)素的生物合成。黃酮類代謝影響孢粉素與色氨酸的形成^［27］。孢粉素由長鏈脂肪酸、苯基丙烷與氧化的芳香環(huán)衍生物組合而成，作為花粉發(fā)育的骨架，對(duì)花藥育性至關(guān)重要^［28-29］。研究表明，CYP703a 2是一個(gè)專門參與花粉發(fā)育的細(xì)胞色素基因，主要在催化中鏈飽和脂肪酸C-7位的內(nèi)鏈羥化，進(jìn)而影響花粉外壁孢粉素的合成^［30］。同樣的，本研究存在較多的DEGs（c78022.graph_c0，CYP703a 2；c104620.graph_c1，MsC₄H；c90204.graph_c0，MsMTD）富集于苯丙烷代謝途徑，其中不育系花藥四分體晚期相關(guān)基因的表達(dá)量均低于保持系花藥。推測(cè)四分體后期，絨氈層細(xì)胞內(nèi)苯丙烷相關(guān)代謝受到了抑制，合成的孢粉素前體物質(zhì)減少。孢子體向單核早期過渡時(shí)，花粉外壁異常，花粉小孢子缺乏相應(yīng)保護(hù)屏障抵御外界環(huán)境的屏障，最終致使的花粉敗育。

碳水化合物代謝是植物生長發(fā)育的基本代謝途徑之一^［31］。糖為花藥生長和發(fā)育提供能量與營養(yǎng)^［32］。此外，碳水化合物也是細(xì)胞壁主要成分之一。因此糖代謝的紊亂會(huì)導(dǎo)致花粉發(fā)育的異常。花藥發(fā)育過程中，絨氈層細(xì)胞降解，其中的淀粉粒會(huì)降解為蔗糖運(yùn)輸于花藥之中。在UDP-葡萄糖脫氫酶的作用下，再次合成淀粉并儲(chǔ)存于孢子體中^［33］。同樣的我們發(fā)現(xiàn)該基因（c58162.graph_c0，MsUGPD）在四分體后期下調(diào)，其可能導(dǎo)致四分體后期花藥絨氈層中淀粉的不能正常轉(zhuǎn)移于花藥中儲(chǔ)存，不能為后續(xù)花藥發(fā)育提供足夠的營養(yǎng)。這與之前課題組測(cè)得的不育系較保持系花藥淀粉含量虧缺相符^［34］。

轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別啟動(dòng)子序列，增加或減少下游靶基因的表達(dá)量，從而影響植物的生理生化反應(yīng)。Xu等人通過微陣列分析擬南芥bHLH家族中的AMS轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)現(xiàn)其調(diào)控下游一系列轉(zhuǎn)錄因子，如MYB，PHD，MS，等，進(jìn)而影響脂肪酸的生物合成與黃酮類物質(zhì)的積累，影響花粉壁的形成^［35］。本研究對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的注釋分類，發(fā)現(xiàn)有DEGs屬于bHLH家族（c101778.graph_c0，bHLH19；c94452.graph_c1，bHLH87；c95148.graph_c0，bHLH25；c106230.graph_c0，bHLH18），同樣也存在脂肪酸代謝途徑中關(guān)鍵基因（c89437.graph_c0，MsGELPs）的下調(diào)表達(dá)，這可能是影響花藥壁正常發(fā)育關(guān)鍵原因之一，其具體調(diào)控機(jī)理有待后續(xù)試驗(yàn)驗(yàn)證。同樣本研究也篩選出了隸屬于PHD-finger（c89108.graph_c0，PHD finger protein male sterility 1）與MYB（c91687.graph_c0，MYB 35）家族的轉(zhuǎn)錄因子，分別敲除這兩個(gè)基因?qū)е陆q氈層與花粉壁畸形，導(dǎo)致花粉敗育^［36-38］。以上這些發(fā)現(xiàn)印證了一些bHLH家族、PHD-finger家族與MYB家族轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控花粉的育性的結(jié)論。

4 結(jié)論

本研究對(duì)紫花苜蓿雄性不育系MSJN1A與保持系MSJN1B花藥切片進(jìn)行了觀察，結(jié)果表明花藥敗育始于四分體后期，單核早期花粉粒出現(xiàn)明顯的敗育現(xiàn)象。對(duì)花粉敗育的前后時(shí)期進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，共獲得4 284個(gè)DEGs，后進(jìn)行功能注釋以及轉(zhuǎn)錄因子等初步研究?；ǚ鄣臄∮c苯丙烷代謝、脂肪酸代謝途徑與淀粉與蔗糖途徑異常有關(guān)，這為進(jìn)一步研究紫花苜?；ǚ蹟∮梢蛱峁﹨⒖?。

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（責(zé)任編輯 閔芝智）