摘要：尿苷二磷酸（Uridine diphosphate，UDP）糖基轉(zhuǎn)移酶（UDP-glycosyltransferase，UGT）催化植物體內(nèi)黃酮等次生代謝產(chǎn)物的糖基化反應，在植物抵御逆境脅迫過程中具有重要作用。本研究從紫花苜蓿（Medicago sativa）中克隆UGT家族基因MsUGT87A1，利用生物信息學方法對其蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、二級結構和亞細胞定位等進行分析，并通過熒光定量PCR分析MsUGT87A1基因的組織表達特異性及對不同非生物脅迫的響應情況。結果表明，MsUGT87A1基因全長1 353 bp，編碼450個氨基酸，蛋白質(zhì)相對分子量為50.98 kDa，理論等電點（pI）為5.78，屬于親水性蛋白，主要定位于細胞質(zhì)中。系統(tǒng)進化樹結果表明紫花苜蓿MsUGT87A1與蒺藜苜蓿、紅三葉等豆科植物的UGT87A1同源性較高。MsUGT87A1基因在紫花苜蓿根中表達量最高，對干旱、鹽和ABA處理均有響應，初步確定MsUGT87A1基因參與紫花苜蓿應對干旱及鹽脅迫響應。該研究為進一步探究MsUGT87A1基因功能奠定基礎，為紫花苜蓿抗逆性遺傳改良提供理論依據(jù)。

關鍵詞：紫花苜蓿；糖基轉(zhuǎn)移酶；MsUGT87A1；基因克隆；表達模式

中圖分類號：S541.9

文獻標識碼：A

文章編號：1007-0435（2023）06-1682-11

Cloning of MsUGT87A1 Gene in Alfalfa and Analysis of its Expression in the

Response to Abiotic Stresses

CEN Hui-fang， HUANG Jie-qiong， SHEN Wang-hui， ZHU Hui-sen*， XIA Fang-shan， XU Tao

（College of Grassland Science， Shanxi Agricultural University， Taigu， Shanxi Province 030801， China）

Abstract：Uridine diphosphate （UDP）-glycosyltransferase （UGT） catalyzes the glycosylation of secondary metabolites such as flavonoids in plants，which plays important roles in plant resistance to various stresses. In this study，an UGT family gene MsUGT87A1 was cloned from alfalfa. The physicochemical properties，secondary structure and subcellular localization of MsUGT87A1 protein were analyzed by bioinformatics. The tissue-specific expression pattern of MsUGT87A1 gene and its response to different abiotic stresses were investigated by fluorescence quantitative real-time PCR. The results showed that the full-length of MsUGT87A1 gene was 1 353 bp，encoding 450 amino acids. The relative molecular weight of MsUGT87A1 was 50.98 kDa，and the theoretical isoelectric point （pI） was 5.78. The MsUGT87A1 protein was mainly located in cytoplasm. Phylogenetic tree results showed that the MsUGT87A1 in alfalfa had a high homology with the UGT87A1 in Medicago truncatula and Trifolium pratense. The expression of MsUGT87A1 gene was highest in the roots of alfalfa and positively responded to drought，salt and ABA treatments. It was preliminarily determined that the MsUGT87A1 gene was involved in response to drought and salt stresses of alfalfa. This study laid a foundation for the further exploring the function of MsUGT87A1 gene and provided a theoretical basis for genetic improvement of stress resistance of alfalfa.

Key words：Alfalfa;Glycosyltransferase;MsUGT87A1;Gene cloning;Expression pattern

紫花苜蓿（Medicago sativa）是世界上最重要的豆科（Fabaceae）牧草之一，其草質(zhì)優(yōu)良，富含蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)元素、黃酮類物質(zhì)等活性成分，具有很高的營養(yǎng)價值，被廣泛用于飼料添加來促進家畜生長、改善畜產(chǎn)品品質(zhì)以及提高家畜生產(chǎn)和繁殖性能，在畜牧業(yè)生產(chǎn)中具有重要地位^［1］。在生長過程中干旱、鹽堿等非生物脅迫會嚴重影響紫花苜蓿的正常生長發(fā)育，導致牧草產(chǎn)量和品質(zhì)降低^［2-3］。因此，利用分子生物學手段培育優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗逆的紫花苜蓿新品種對于畜牧業(yè)的發(fā)展具有重要意義。黃酮類化合物是存在于自然界中含量最豐富的一類多酚化合物，具有多種生物活性和藥用功效，對人體具有很高的營養(yǎng)及醫(yī)療價值^［4］。黃酮類化合物也是一類非常重要的植物次生代謝產(chǎn)物，它廣泛地存在于植物之中，已有研究表明，黃酮類化合物的生物學功能非常豐富，參與到植物生長發(fā)育及適應環(huán)境過程中，如調(diào)控植物根系生長發(fā)育、抗氧化傷害、促進豆科植物形成根瘤、抵御病蟲害等^［5-6］。

黃酮類化學物在細胞內(nèi)主要以糖苷形式存在。糖基化是黃酮類物質(zhì)形成過程中的重要修飾之一，這種修飾可增強黃酮類物質(zhì)的溶解性、穩(wěn)定性和生物活性，以防御和適應環(huán)境變化^［7］。糖基轉(zhuǎn)移酶（Glycosyltransferase，GT）催化生物體內(nèi)的糖基化反應，糖基轉(zhuǎn)移酶以活化的糖基供體為底物，將其轉(zhuǎn)移到糖類、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸、抗生素和次生代謝物等多種受體分子上來調(diào)節(jié)其生化特性，從而形成多種糖苷化合物^［8］。根據(jù)底物特異性、氨基酸序列相似性和催化特異性可將糖基轉(zhuǎn)移酶分為106個家族，其中尿苷二磷酸-糖基轉(zhuǎn)移酶（Uridine diphosphate-glycosyltransferase，UGT）屬于家族1，成員數(shù)量最多，在植物體內(nèi)功能最重要，它催化的糖基化反應中的受體底物包括蛋白質(zhì)、核酸、黃酮等次生代謝產(chǎn)物和植物激素等，能夠調(diào)控植物的代謝物合成、調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育、維持細胞穩(wěn)態(tài)、抵御各種生物和非生物脅迫^［8-9］。植物體內(nèi)黃酮類化合物的糖基化普遍由尿苷二磷酸（Uridine diphosphate，UDP）糖基依賴的轉(zhuǎn)移酶催化實現(xiàn)^［7］。目前，植物UGT家族基因在擬南芥（Arabidopsis thaliana）^［10］，水稻（Oryza sativa）^［11］，小麥（Triticum aestivum）^［12］，大豆（Glycine max）^［13］，花生（Arachis hypogaea）^［14］，玉米（Zea mays）^［15］，葡萄（Vitis vinifera）^［16］等多個物種中均有報道。植物UGT主要以葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、木糖等UDP糖類為供體，對類黃酮、萜類及植物激素等受體化合物進行糖基化修飾，產(chǎn)生的各種糖類和糖苷化合物參與植物次生代謝物的合成與代謝^［8］。

植物UGT在調(diào)控黃酮類化合物的糖基化修飾過程中的重要作用受到廣泛關注，有研究報道UGT73B3，UGT73C6，UGT76E11，UGT79B2，UGT87A1，UGT88 E19等都會影響植物中黃酮類物質(zhì)的糖基化過程，促進植物中黃酮類物質(zhì)的合成^［7］。Zhang等^［17］在擬南芥中過表達白穎薹草（Carex rigescens）的CrUGT87A1基因，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株中查爾酮合成酶基因（CHS）上調(diào)表達，黃酮含量顯著增加，轉(zhuǎn)基因植株的抗旱耐鹽性顯著提高。在大豆毛狀根中分別過表達糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT72X4，UGT72Z3，UGT73C20，UGT88A13，UGT88E19和UGT92G4可顯著增加毛狀根中異黃酮和黃酮醇糖苷的含量，將其分別在擬南芥中過表達也會影響轉(zhuǎn)基因幼苗和種子中黃酮醇糖苷的含量^［18］。在擬南芥中過表達百脈根（Lotus japonicus）的UGT72D1和UGT72Z2，轉(zhuǎn)基因植株中山柰酚3-O-鼠李糖苷和7-O-鼠李糖苷含量分別顯著增加^［19］。因此，調(diào)控植物體內(nèi)UGT編碼基因的表達可能會調(diào)控植物中黃酮類物質(zhì)的合成，進而對植物的品質(zhì)及抗逆性產(chǎn)生影響。

目前盡管已從紫花苜蓿中分離鑒定了大量的黃酮糖苷類化合物，但關于參與紫花苜蓿黃酮類物質(zhì)糖基化修飾的相關基因研究還較少?！熊僖惶枴茸匣ㄜ俎Ｈ蚪M測序的完成，使紫花苜蓿中進行基因的克隆和功能分析也變得尤為便利。本研究利用已有的紫花苜蓿轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的UGT87A1轉(zhuǎn)錄本序列，在‘中苜一號’紫花苜蓿中克隆了MsUGT87A1基因，對MsUGT87A1基因編碼的蛋白質(zhì)進行了生物信息學分析，并分析了MsUGT87A1基因的表達模式，為深入研究紫花苜蓿糖基轉(zhuǎn)移酶基因功能提供理論依據(jù)，為后續(xù)利用基因工程手段對紫花苜蓿營養(yǎng)品質(zhì)及其抗逆性進行遺傳改良奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

‘中苜一號’紫花苜蓿種子由中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所楊青川研究員提供。選取飽滿的種子種植于混合營養(yǎng)土中（營養(yǎng)土∶蛭石=1∶1），于溫室中恒溫培養(yǎng)（（25±2）℃，16 h光照/8 h黑暗）。

1.2 MsUGT87A1基因克隆

根據(jù)原有紫花苜蓿轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中UGT87A1的轉(zhuǎn)錄本序列，在已發(fā)表的‘中苜一號’紫花苜?；蚪M數(shù)據(jù)庫中進行對比，找到該基因的序列，然后利用Primer 5.0和NCBI Primer-BLAST（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）在線工具設計基因克隆引物，設計的引物序列如下：上游引物MsUGT87A1-F：5′-ATGAATATCTCCGGCGATGCTGTG-3′，下游引物MsUGT87A1-R：5′-TCAAGACGAAATGTCACTGATAAATGCGTC-3′。利用北京華越洋生物科技有限公司植物RNA提取試劑盒（ZH120）提取‘中苜一號’紫花苜?？俁NA，RNA質(zhì)量檢測合格后，使用PrimeScript^TMRT reagent kit with gDNA Eraser（Code No. RR047A，TakaRa）將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以反轉(zhuǎn)錄得到的紫花苜蓿cDNA第一鏈為模板利用高保真Tks酶（Tks Gflex^TM DNA Polymerase，Code No. R060A，TakaRa）進行PCR擴增，擴增反應體系參照說明書。PCR反應程序為：94℃預變性2 min，94℃變性30 s；60℃退火30 s，72℃延伸90 s，32個循環(huán)；72℃延伸5 min。擴增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的片段切膠回收并進行加A反應，將膠回收產(chǎn)物連接到克隆載體pMD18-T（Code No. 6011，TakaRa），菌液PCR檢測后送至上海生工生物工程有限公司進行測序。

1.3 生物信息學分析

對MsUGT87A1基因進行生物信息學分析所用軟件名稱及網(wǎng)址如表1所示。

1.4 MsUGT87A1基因表達模式分析

分別取‘中苜一號’紫花苜蓿幼苗不同組織及不同非生物脅迫后的幼苗葉片為材料，提取各樣品總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以此為模板進行實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測。不同組織材料為二月齡紫花苜蓿的根，幼莖（從上往下數(shù)第二個節(jié)間，用ys表示），老莖（從上往下數(shù)第7～8個節(jié)間，用os表示），幼葉（從上往下數(shù)第三片展開葉，用yl表示），成熟葉（從上往下數(shù)第10片成熟葉，用ol表示）；不同非生物脅迫是選取一月齡的紫花苜蓿幼苗分別進行模擬干旱脅迫（500 mmol·L^-1甘露醇）、鹽脅迫（250 mmol·L^-1 NaCl）和脫落酸（Abscisic acid，ABA）處理（80 μmol·L^-1），分別在處理0 h，0.5 h，1 h，3 h，6 h，12 h，24 h，48 h時取相同部位的成熟葉，每個處理設置3個重復。根據(jù)MsUGT87A1基因序列，設計特異性定量PCR引物（表2），以紫花苜蓿Actin基因作為熒光定量PCR的內(nèi)參基因^［20］，使用Takara TB Green Premix Ex Taq^TM II （Tli RNaseH Plus） （Code No. RR420A）實時熒光定量PCR試劑盒，反應體系為：TB Green Premix Ex Taq II （Tli RNaseH Plus）10 μL，上下游引物各1 μL，ddH₂O 7 μL，template 1 μL。PCR反應程序為：95℃預變性2 min；95℃變性5 s，60℃退火延伸30 s，40個循環(huán)。利用Excel處理數(shù)據(jù)和制作圖表，以2^-ΔΔCt法計算MsUGT87A1基因的相對表達量。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 18.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，使用WPS Office軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 MsUGT87A1基因的克隆與序列分析

以反轉(zhuǎn)錄得到的紫花苜蓿cDNA第一鏈為模板進行紫花苜蓿內(nèi)源MsUGT87A1基因的克隆。經(jīng)過PCR擴增，獲得大小約1 400 bp的條帶，與預期片段大小基本相符（圖1）。測序結果表明，克隆得到的MsUGT87A1基因編碼區(qū)大小為1 353 bp，包含完整的CDS，含起始密碼子ATG和終止密碼子TGA，編碼450個氨基酸（圖2）。通過NCBI BLAST-conserved domain對MsUGT87A1基因編碼蛋白質(zhì)的保守結構域進行預測分析，發(fā)現(xiàn)MsUGT87A1在第20～345個氨基酸之間有TDP結合位點和激活位點，屬于GT-B類型糖基轉(zhuǎn)移酶超家族基因（圖3）。

2.2 MsUGT87A1基因編碼蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

利用ExPASy在線軟件對MsUGT87A1基因編碼的蛋白質(zhì)進行理化性質(zhì)分析，推測MsUGT87A1蛋白分子式為C2290H3575N607O673S19，相對分子量為50.98 kDa，理論等電點（pI）為5.78，脂溶指數(shù)為90.51，帶正電荷氨基酸殘基（Arg+Lys）有48個，帶負電荷氨基酸殘基（Asp+Glu）59個，堿性氨基酸殘基46個，酸性氨基酸殘基46個，表明該蛋白為中性蛋白，其中含量較多的氨基酸是絲氨酸（Ser），占9.8%，其次是亮氨酸（Leu），占9.3%（表3）；脂肪系數(shù)為90.51，總平均親水系數(shù)為-0.212，不穩(wěn)定系數(shù)為47.31，初步推測MsUGT87A1為不穩(wěn)定的親水性蛋白。

2.3 MsUGT87A1基因編碼蛋白質(zhì)二級、三級結構分析

利用SOPMA在線軟件對紫花苜蓿MsUGT87A1基因編碼的蛋白質(zhì)二級結構進行分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白的二級結構包含α-螺旋（41.56%）、無規(guī)則卷曲（37.56%）、延伸鏈（17.11%）和β-轉(zhuǎn)角（3.78%）（圖4A）。利用Swiss-Model在線軟件預測MsUGT87A1基因編碼蛋白質(zhì)的三級結構（圖4B），其與牛角瓜強心甾類3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶UGT74AN2的蛋白質(zhì)三級結構相似，相似度為30.30%，同為UGT蛋白單體分子（圖4C）。

2.4 MsUGT87A1基因編碼蛋白質(zhì)的其他結構分析

利用NetPhos在線軟件預測MsUGT87A1基因編碼蛋白質(zhì)的磷酸化位點，分析結果顯示，MsUGT87A1蛋白含有絲氨酸（Ser）位點23個、蘇氨酸（Thr）位點14個和酪氨酸（Tyr）位點3個，表明該蛋白在發(fā)生磷酸化時主要以絲氨酸磷酸化為主（圖5A）。利用ProtScale在線軟件對MsUGT87A1蛋白的親水性和疏水性進行分析，結果表明第29位半胱氨酸、第43位蘇氨酸和第44位苯丙氨酸的疏水性最強，預測值均為2.122，第366位脯氨酸的親水性最強，預測值為-2.722，推測MsUGT87A1蛋白屬于親水性蛋白（圖5B）。利用TMHMM Server 2.0在線軟件預測MsUGT87A1蛋白的跨膜結構域，發(fā)現(xiàn)該蛋白的跨膜螺旋線數(shù)目為0，其1～450位氨基酸都位于細胞膜表面，推測該蛋白沒有跨膜轉(zhuǎn)運信號，沒有蛋白質(zhì)的跨膜運動（圖5C）。利用SignalP4.1對MsUGT87A1蛋白信號肽在線分析，結果表明該蛋白不存在信號肽，屬于非分泌蛋白（圖5D）。利用Cello在線軟件對MsUGT87A1蛋白的亞細胞定位情況進行預測，發(fā)現(xiàn)其定位于細胞質(zhì)中。

2.5 MsUGT87A1基因編碼蛋白質(zhì)序列同源性分析

為進一步了解紫花苜蓿MsUGT87A1基因編碼的蛋白質(zhì)與其他植物UGT87A1蛋白的同源關系，在NCBI Blast中對UGT87A1基因編碼的蛋白序列進行同源性檢索，獲得多個常見物種的UGT87A1蛋白序列，包括蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）MtUGT87A1（XM_003615782.4），大豆（Glycine max）GmUGT-87A1（XM_028345013.1），紅三葉（Trifolium pratense）TpUGT87A1（XM_0459745991.1），相思豆（Abrus precatorius）ApUGT87A1（XM_027477117.1），木豆（Cajanus cajan）CcUGT87A1（XM_0203 73293.2），花生（Arachis hypogaea）AhUGT87A1（XM_025810955.2），鷹嘴豆（Cicer arietinum）CaUGT87A1（XM_004490597.3），豇豆（Vigna unguiculata）VuUGT87A1（XM_028082715.1），擬南芥（Arabidopsis thaliana）AtUGT87A1（AT2G30140.1），蘋果（Malus domestica）MdUGT87A1（MD11G1062000），馬鈴薯（Solanum tuberosum）StUGT87A1（Soltu.DM.06G032600.1），葡萄（Vitis vinifera）VvUGT87A1（VIT_206 s0004 g07220.1），百脈根（Lotus japonicus）LjUGT87A1（LjContig00141 g0016214.1），白羽扇豆（Lupinus albus）LaUGT87A1（Lalb_Chr04 g0252001），大麥（Hordeum vulgare）HvUGT87A1（HORVU3 Hr1G078860.2），小麥（Triticum aestivum）TaU-GT87A1（Traes_3B_A37829D67.1），玉米（Zea mays）ZmUGT87A1（ZmPHJ40.06G201200.1.p），柳枝稷（Panicum virgatum）PvUGT87A1 （Pavir.5KG58-9200.1.p），高粱（Sorghum bicolor）SbUGT-87A1（Sobic.003G328400.1.p），水稻（Oryza sativa）OsUGT87A1（LOC_Os05 g41400.1）和二穗短柄草（Brachypodium distachyon）BdUGT87A1（Bradi2 g21317.3.p）。利用MEGA6.0構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果表明，不同物種中的UGT87A1蛋白明顯聚為單子葉植物和雙子葉植物兩簇，說明UGT87A1在進化上保守（圖6）。MsUGT87A1蛋白和蒺藜苜蓿MtUGT87A1的同源性最高，其次為紅三葉TpUGT87A1和鷹嘴豆CaUGT87A1，說明紫花苜蓿MsUGT87A1與它們在進化上親緣關系最為相近。將紫花苜蓿MsUGT87A1與進化樹分析中另外14種雙子葉植物的UGT87A1氨基酸序列進行同源比對，結果如圖7所示，不同物種UGT87A1氨基酸序列的C端更為保守，均具有一個植物次生代謝糖基轉(zhuǎn)移酶保守區(qū)（Plant secondary product glycosyltransferase box，PSPG box）（紅色方框標注），該結構域由44個氨基酸殘基組成，起始氨基酸W和終止氨基酸Q具有很高的保守性，表明紫花苜蓿MsUGT87A1蛋白屬于UDP糖基轉(zhuǎn)移酶家族，并且與蒺藜苜蓿、紅三葉、鷹嘴豆、相思豆、大豆、木豆、豇豆、花生、百脈根等9種豆科植物的UGT87A1氨基酸序列同源性更高。

2.6 MsUGT87A1基因的表達模式分析

實時熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，MsUGT87A1基因在紫花苜蓿根、莖、葉中均有表達，但表達量存在較大差異。MsUGT87A1基因在紫花苜蓿根中的相對表達量最高，顯著高于其在莖、葉中的表達量，其次為老葉和莖，在幼葉中的表達量最低（圖8A）。

為進一步探究MsUGT87A1基因在紫花苜蓿中可能發(fā)揮的功能，通過熒光定量PCR檢測了干旱、鹽和ABA脅迫下MsUGT87A1基因的相對表達量。結果顯示，MsUGT87A1基因在紫花苜蓿應對干旱、鹽和ABA脅迫時都有響應。甘露醇模擬干旱脅迫處理下，MsUGT87A1基因的相對表達量先顯著上調(diào)（Plt;0.05），處理6 h時表達量達到最高，而后表達量又顯著下降（Plt;0.05），在處理24 h時表達量降到最低，隨后在處理48 h時其表達量又有升高的趨勢（圖8B）。在NaCl脅迫下，MsUGT87A1基因的相對表達量同樣是先顯著上調(diào)（Plt;0.05），在處理6 h時達到最高，然后表達量又呈現(xiàn)顯著下降的趨勢（Plt;0.05），在處理24 h時表達量降到最低，隨后在處理48 h時其表達量又有升高的趨勢（圖8C）。在ABA處理下，MsUGT87A1基因的相對表達量顯著上調(diào)（Plt;0.05），在處理6 h時迅速達到最高，隨著處理時間的延長，MsUGT87A1基因的相對表達量顯著降低（Plt;0.05）（圖8D）。以上結果表明，MsUGT87A1基因?qū)Ω珊怠Ⅺ}和ABA等逆境脅迫均有響應，并且呈現(xiàn)出相似的表達特點，說明MsUGT87A1基因可能在調(diào)控紫花苜蓿響應干旱、鹽和ABA脅迫中發(fā)揮作用。

3 討論

近年來，由于紫花苜?；蚪M數(shù)據(jù)的不斷公布，在紫花苜蓿中進行優(yōu)質(zhì)基因的克隆及功能驗證技術也愈發(fā)成熟。UGT是植物中最大的糖基轉(zhuǎn)移酶超家族，目前，UGT家族基因已經(jīng)在小麥^［12］、大豆^［13］、水稻^［11］、擬南芥^［10］、紫花苜蓿^［21］等多個物種中被鑒定出來。尤章等^［21］在紫花苜蓿中克隆得到MsUGT73B2基因，其對干旱和鹽脅迫等有響應。本研究從紫花苜蓿中克隆得到了一個UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶基因MsUGT87A1并對其進行了序列分析。多序列比對及系統(tǒng)發(fā)育樹分析結果表明，該基因編碼的蛋白與豆科植物的UGT87A1蛋白具有很高的同源性，因此，同樣將其命名為MsUGT87A1。系統(tǒng)發(fā)育結果顯示，雙子葉植物和單子葉植物的UGT87A1蛋白分別聚為兩簇，其中紫花苜蓿MsUGT87A1與蒺藜苜蓿、紅三葉、鷹嘴豆、花生、百脈根等豆科植物的親緣關系較近，與擬南芥及單子葉植物如水稻、二穗短柄草的UGT87A1親緣關系較遠，基本符合植物發(fā)育進化規(guī)律。

在植物中，黃酮類化合物、萜類化合物和類固醇等是重要的次生代謝產(chǎn)物，通常以α或β糖苷的形式穩(wěn)定存在，其糖基化過程主要由UGT催化完成^［22］。已有研究表明，植物UGT的結構較保守，其C端比N端更加保守，N端負責識別與結合糖基受體，C端負責識別和結合糖基供體，在C端通常含有一個由大約40個氨基酸組成的PSPG box保守序列，該序列是與UDP-糖供體結合的區(qū)域，在不同植物中的序列相似性較高，具有PSPG box的UGT與植物次生代謝產(chǎn)物的合成有關^［22-24］。本研究通過序列分析發(fā)現(xiàn)，紫花苜蓿MsUGT87A1蛋白C端具有由44個氨基酸組成的PSPG box保守結構域，說明其可能參與紫花苜蓿某種次生代謝產(chǎn)物的合成。PSPG box的第一個氨基酸殘基為W，最后一個氨基酸殘基為Q，表明MsUGT87A1屬于UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶，具有UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶活性，并且更偏好于以UDP-葡萄糖作為糖供體^［9］。

研究表明，植物UGT一般定位于細胞質(zhì)中^［25］。本研究中，對紫花苜蓿MsUGT87A1進行亞細胞定位預測，發(fā)現(xiàn)其同樣定位于細胞質(zhì)中，屬于一類細胞質(zhì)酶，但是對于MsUGT87A1蛋白的作用底物還需進一步通過實驗鑒定。植物UGT家族蛋白作用底物多樣，功能及作用機制復雜，序列差異性較高，但它們的三維結構卻高度相似，都屬于GT-B結構類型，由兩個β/α/β Rossmann折疊區(qū)域組成，參與糖受體和糖供體結合的結構域分別位于N端和C端的Rossmann結構域^{［23，26-27］}。同源建模結果顯示，MsUGT87A1蛋白屬于典型的GT-B構象，與蒺藜苜蓿、擬南芥UGT蛋白相似。

大量研究表明，UGT參與植物體內(nèi)黃酮等次生代謝物質(zhì)的合成、修飾與運輸，能夠調(diào)節(jié)植物激素平衡和響應逆境脅迫。UGT通過對生物脅迫和非生物脅迫調(diào)節(jié)因子進行糖基化修飾來響應病蟲害等生物脅迫和干旱、鹽等非生物脅迫^［28］。將小麥的UGT基因Traes_2BS_14CA35D5D在二穗短柄草中過表達，轉(zhuǎn)基因植株對赤霉病的抗性顯著增強^［29］。董麗麗等^［30］從矮牽牛（Petunia hybrida）中克隆了PhUGT74E2基因，該基因參與到矮牽牛應對干旱及鹽脅迫的響應中。Liu等^［31］在水稻中過表達糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT85E1，轉(zhuǎn)基因植株通過誘導ABA積累，氣孔關閉，增強活性氧清除能力來提高其抗旱性。已有研究也證實UGT87A1基因可能通過調(diào)控植物體內(nèi)黃酮的合成來提高植物的抗旱耐鹽性^［17］。本研究中，通過熒光定量PCR分析，MsUGT87A1基因?qū)Ω珊?、鹽和ABA脅迫的響應結果顯示，處理前期該基因的相對表達量均呈現(xiàn)上升趨勢，隨脅迫時間的延長該基因表達量逐漸降低，表明MsUGT87A1基因參與紫花苜蓿非生物脅迫響應。另外，本研究是基于前期在紫花苜蓿中過表達褪黑素合成基因MsASMT1，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株中槲皮素、山柰酚等黃酮類物質(zhì)含量顯著降低，轉(zhuǎn)錄組學分析發(fā)現(xiàn)多個與黃酮合成相關基因的表達受到調(diào)控，其中包括UGT87A1等UDP糖基轉(zhuǎn)移酶基因^［32］。因此，我們推測紫花苜蓿MsUGT87A1可能會通過使某一種黃酮類物質(zhì)糖基化之后改變其生物功能，使得紫花苜蓿體內(nèi)發(fā)生一系列生物化學反應進而提高其對干旱和鹽等非生物脅迫的抵抗能力。但是，紫花苜蓿MsUGT87A1基因究竟是否在植物黃酮類物質(zhì)合成及逆境脅迫應答中發(fā)揮重要作用有待后續(xù)進一步驗證。另外，MsUGT87A1基因主要在紫花苜蓿根中表達，其具體功能同樣有待進一步解析。本研究為后期探究MsUGT87A1基因在紫花苜蓿生長發(fā)育、營養(yǎng)品質(zhì)及抗逆性方面的功能奠定了基礎，也為紫花苜蓿品質(zhì)和抗逆育種提供了理論依據(jù)。

4 結論

本研究從紫花苜蓿中成功克隆得到一個UDP糖基轉(zhuǎn)移酶基因MsUGT87A1，編碼區(qū)全長1 353 bp，編碼450個氨基酸。利用生物信息學軟件分析顯示MsUGT87A1蛋白屬于細胞質(zhì)酶，具有植物次生代謝糖基轉(zhuǎn)移酶保守區(qū)（PSPG box），屬于UDP糖基轉(zhuǎn)移酶。系統(tǒng)進化樹分析顯示，MsUGT87A1與蒺藜苜蓿等豆科牧草UGT87A1親緣關系最近。MsUGT87A1基因在紫花苜蓿根中表達量最高，并且對干旱、鹽和ABA處理均有響應，初步確定MsUGT87A1基因參與紫花苜蓿干旱及鹽脅迫應答，為后續(xù)深入探究MsUGT87A1基因在紫花苜蓿中的功能奠定了基礎。

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（責任編輯 閔芝智）