摘要：本研究以‘草原3號(hào)’雜花苜蓿（Medicago varia ‘Caoyuan No.3’）為材料，采用第二代高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)葉綠體基因組序列進(jìn)行分析、組裝及注釋，以探究雜花苜蓿在系統(tǒng)發(fā)育中的位置及在分子水平上與其近緣物種的關(guān)系。結(jié)果表明：雜花苜蓿綠體基因組全長(zhǎng)125 317 bp，為典型四分體結(jié)構(gòu)，不存在IR區(qū)缺失的情況，GC含量為33.87%。葉綠體基因組共編碼106個(gè)基因，其中蛋白質(zhì)編碼基因54個(gè)，涉及36 498個(gè)密碼子。3種不同類型的88個(gè)SSR位點(diǎn)分布不均衡，在LSC，SSC，IR區(qū)域的SSR數(shù)量各自為79，7和2個(gè)。對(duì)苜蓿屬7個(gè)植物進(jìn)行共線性分析發(fā)現(xiàn)其重排現(xiàn)象嚴(yán)重。系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)雜花苜蓿與紫花苜蓿的親緣關(guān)系最近。本研究可為苜蓿屬植物遺傳變異、特異基因挖掘以及品種選育改良等研究提供參考。

關(guān)鍵詞：雜花苜蓿；葉綠體基因組；高通量測(cè)序；系統(tǒng)發(fā)育

中圖分類號(hào)：S732

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-0435（2023）06-1665-08

Characteristics and Phylogenetic Analysis of Chloroplast Genome of Medicago varia

HAO Xin-yan¹， ZHAO Shu-wen¹， LIU Jia-wei¹， SHI Rui²， WANG Xiao-long³，

LI Ying⁴， WANG Xiao-yu¹， MI Fu-gui^1*

（1.Inner Mongolia Agricultural University College of Grassland and Resource Environment， Hohhot， Inner Mongolia 010010， China;

2. Baotou Medical College， Baotou， Inner Mongolia 014040， China; 3. Branch of Animal Husbandry and Veterinary of Heilongjiang

Academy of Agricultural Sciences， Qiqihar， Heilongjiang Province 161005， China; 4. Alxa Institute of Forestry and Grassland，Alxa， Inner

Mongolia 750306，China）

Abstract：In this study，the chloroplast genome sequence of Medicago varia ‘Caoyuan No.3’ was analyzed，assembled and annotated by the second-generation high-throughput sequencing technology to explore the phylogenetic position and molecular relationship of M. varia with its related other species. The results showed that the total length of the chloroplast genome of M. varia was 125 317 bp，which had a typical tetrad structure. There was no deletion of IR region，and the GC content was 33.87 % in that genome. That chloroplast genome encodes a total of 106 genes，including 54 protein-coding genes，involving 36 498 codons. It was that 88 SSR loci of 3 different types were unevenly distributed;from which 79，7 and 2 SSR loci located in LSC，SSC and IR respectively. The collinearity analysis on seven species in the alfalfa genus showed that the rearrangement of chloroplast genome of M. varia was much profound. Phylogenetic analysis showed that the relationship between M.sativa and M. varia was closer than that with other species. The results of this study could provide a reference or basis for further study on the genetic variation，specific gene unearthing and variety breeding and improvement of Medicago spp.

Key words：Medicago varia;Chloroplast genome;High-throughput sequencing;Phylogeny

苜蓿是畜牧業(yè)中重要的優(yōu)質(zhì)蛋白飼料，也是全球范圍內(nèi)種植面積最廣、栽培歷史最悠久的優(yōu)良豆科牧草^［1］。我國(guó)苜蓿栽培品種主要分布在黃河流域及其以北的廣闊區(qū)域，其中紫花苜蓿（Medicago sativa）種植面積最廣，黃花苜蓿（M. falcata）、雜花苜蓿（M. varia）、南苜蓿（M. polymorpha）、天藍(lán)苜蓿（M. lupulina）等在特定區(qū)域內(nèi)亦有不同程度的栽培利用^［2］。紫花苜蓿飼草產(chǎn)量高、飼用品質(zhì)好，素有“牧草之王”的美譽(yù)。黃花苜?？购?、耐寒，適應(yīng)性強(qiáng)，是豆科牧草中優(yōu)良的抗性種質(zhì)。雜花苜蓿為紫花苜蓿與黃花苜蓿的種間雜交種，因其花色多樣，又名多變苜蓿；自身攜帶變異基因，兼具紫花苜蓿與黃花苜蓿的許多優(yōu)良性狀，具有抗寒、抗旱、抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)^［3］，適于我國(guó)北方干旱、半干旱地區(qū)以及輕度鹽漬化土壤上種植，在我國(guó)草業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著重要作用^［4］。

葉綠體是植物能量轉(zhuǎn)化和光合作用的重要細(xì)胞器，也是母本遺傳信息的重要載體^［5］。與核基因組相比，葉綠體基因組大小、基因種類及密碼子組成等方面表現(xiàn)均十分保守，具有拷貝數(shù)高、進(jìn)化速率適中等優(yōu)點(diǎn)^［6］。在高等植物中，葉綠體基因?qū)儆趩斡H遺傳，其中被子植物一般為母系遺傳^［7］，且因物種或基因型等不同，葉綠體基因組序列及基因數(shù)量存在較大差異，因而便成為種質(zhì)鑒別分析與種質(zhì)創(chuàng)制等的有效分子手段和生物新技術(shù)，在物種鑒定^［8］、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析^［9］、物種演變^［10-11］等研究中得到廣泛應(yīng)用。近年來(lái)，隨著高通量測(cè)序技術(shù)不斷完善及測(cè)序成本降低，越來(lái)越多的植物葉綠體基因組被收錄到基因庫(kù)中。

雜花苜蓿的研究主要集中在種子萌發(fā)^［3］、形態(tài)特征^［12］、農(nóng)藝性狀^［13］等方面，而作為苜蓿屬中的優(yōu)良抗性種質(zhì)資源，其在系統(tǒng)發(fā)育中的位置及在分子水平上與其近緣物種的關(guān)系還尚不明晰，為從葉綠體基因組角度探究以上問(wèn)題。本研究以‘草原3號(hào)’雜花苜蓿為試驗(yàn)材料，采用高通量測(cè)序技術(shù)分析葉綠體基因組序列特征及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，來(lái)探討材料雜種異質(zhì)性的分子基礎(chǔ)，并挖掘相關(guān)特異基因，以便為該優(yōu)良種質(zhì)的開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)育成的‘草原3號(hào)’雜花苜蓿（Medicago varia ‘Caoyuan No.3’），種子由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)牧草育種研究室提供，于2021年采集自校內(nèi)品種展示區(qū)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料培養(yǎng)與取樣 選取顏色較淺、籽粒飽滿且形狀完整的雜花苜蓿種子，消毒后置于培養(yǎng)皿中于25℃培養(yǎng)箱中萌發(fā)，待種子萌動(dòng)后將其播種于無(wú)菌土中，然后每隔3 d澆一次改良霍格蘭溶液以維系種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)。幼苗生長(zhǎng)30 d時(shí)，用剪刀剪取長(zhǎng)勢(shì)較好且無(wú)病害的新鮮葉片0.5 g，快速放入液氮速凍30 min以上，保存于-80℃冰箱備用。

1.2.2 葉綠體基因組提取及測(cè)序 采用CTAB（Cetyltrimethylammonium Bromide）法提取雜花苜蓿葉綠體基因組DNA，利用瓊脂糖凝膠電泳分析DNA降解程度以及是否存在RNA或蛋白污染；使用Nanodrop檢測(cè)DNA的純度（OD₂₆₀/OD₂₈₀比值）；使用Qubit3.0對(duì)DNA濃度進(jìn)行精確定量。質(zhì)檢合格后的葉綠體DNA先用Covaris超聲波破碎儀隨機(jī)打斷，再經(jīng)末端修復(fù)、加A尾和加測(cè)序接頭、純化及PCR擴(kuò)增等步驟，最終完成文庫(kù)構(gòu)建。構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)Qubit3.0程序初步定量、稀釋，用Qsep100軟件對(duì)文庫(kù)中的插入片段進(jìn)行檢測(cè)，最后采用Q-PCR準(zhǔn)確定量文庫(kù)的有效濃度。文庫(kù)檢測(cè)合格后，使用Illumina高通量測(cè)序平臺(tái)（HiSeq X）測(cè)序。

1.2.3 基因組裝和注釋 用Gurevich對(duì)主流的高通量序列拼接軟件進(jìn)行了測(cè)試，其中SPAdes和IDBA-UD的拼接效果最佳。優(yōu)化序列的多個(gè)Kmer參數(shù)（107，117，127）經(jīng)SPAdes v3.11.1（http：/ /cab.spbu.ru/software/spades/）拼接軟件拼接后，得到最優(yōu)組裝結(jié)果。以NCBI發(fā)表的紫花苜蓿（MK460489）葉綠體數(shù)據(jù)庫(kù)為參照，用bowtie軟件提取試驗(yàn)材料的葉綠體基因組reads，并用Spades軟件進(jìn)行組裝。組裝好的葉綠體基因組功能注釋由軟件GeSeq（https：//chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/geseq.html）完成；基因組的CDS，tRNA，rRNA，Intergenic Regions和Intron長(zhǎng)度、GC含量和占基因組的百分比等用python腳本統(tǒng)計(jì)。最后，使用在線工具OGDRAW（https：//chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/OGDraw.html）繪制雜花苜蓿葉綠體基因組圖譜^［14］。

1.2.4 密碼子偏好性和SSR分析 雜花苜蓿葉綠體基因組的相對(duì)同義密碼子RSCU（relative synon-ymous codon usage）采用CodonW1.4.2軟件（http：//mobyle.pas-teur/fr/cgi-bin/portal.py？from=codonw）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析^［15］。結(jié)果中如某一密碼子的RSCU＞1.00，表示其編碼的蛋白質(zhì)偏好該密碼子；同理，RSCU＜1.00表示不偏好，RSCU=1.00表示無(wú)偏好。

1.2.5 共線性分析 使用Mauve（http：//darlinglab.org/mauve/mauve.html）軟件^［16］對(duì)苜蓿屬內(nèi)7個(gè)不同物種的葉綠體基因組序列進(jìn)行比對(duì)分析。操作過(guò)程中，首先選擇“Align sequences”，然后提交其Gen Bank格式文件，經(jīng)對(duì)基因組注釋序列共線性分析后，檢測(cè)葉綠體基因組中的基因重排情況。

1.2.6 系統(tǒng)發(fā)育分析 從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載已發(fā)表的28種相關(guān)物種葉綠體序列數(shù)據(jù)，再加上雜花苜蓿序列數(shù)據(jù)，基于在線程序MAFFT（https：//mafft.cbrc.jp/align-ment/serever/index.html）進(jìn)行BLAST多重比對(duì)^［17］。比對(duì)后，葉綠體基因組序列與雜花苜蓿的相似性（Mega blast）達(dá)95%以上者，即為雜花苜蓿的近緣種，并以此為據(jù)借助MEGAv7.0軟件，用最大似然法（Maximum likelihood，ML）構(gòu)建雜花苜蓿系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠體基因組結(jié)構(gòu)、分類、功能及特征

根據(jù)葉綠體基因組圖譜可知（圖1），組裝后的‘草原3號(hào)’雜花苜蓿葉綠體基因組（登錄號(hào)：OQ024844）為典型的四分體結(jié)構(gòu)，分別由大單拷貝區(qū)（LSC）、小單拷貝區(qū)（SSC）及2個(gè)反向重復(fù)區(qū)（IR）組成，全長(zhǎng)125 317 bp，GC含量33.87%。LSC，SSC，IR的序列長(zhǎng)度分別為74 836，50 327，77 bp，其各自的GC含量分別為32.84%，35.41%，36.36%，圖譜最外層的基因?yàn)槟鏁r(shí)針轉(zhuǎn)錄，內(nèi)層的為順時(shí)針轉(zhuǎn)錄。雜花苜蓿葉綠體基因組共編碼106個(gè)基因，其中包括光合作用基因、蛋白質(zhì)編碼基因、和一些未知功能基因。所有類別基因中，蛋白質(zhì)編碼基因數(shù)量最多，達(dá)54個(gè)，其中轉(zhuǎn)運(yùn)RNA基因的數(shù)量占比較大，為28個(gè)；光合作用基因數(shù)量次之，其中光系統(tǒng)Ⅱ亞基數(shù)多達(dá)14個(gè)，NADH脫氫酶亞基11個(gè)。106個(gè)注釋基因中，包含1個(gè)內(nèi)含子的基因有17個(gè)，分別為ndhA，ndhB，petB，petD，atpF，rpl2，rps12，rpoC1，tRNA-Val，trnA-UGC，trnE-UUC，trnK-UUU，trnL-UAA，trnT-CGU，clpP，accD和ycf1；包含兩個(gè)內(nèi)含子的基因有1個(gè)，為ycf3（表1）。雜花苜蓿與紫花苜蓿的葉綠體基因組注釋信息稍有差異，在光合作用基因-光系統(tǒng)Ⅱ亞基及蛋白質(zhì)編碼基因-核糖體小亞基方面，紫花苜蓿分別多出了PsbL和rps2兩個(gè)基因。在轉(zhuǎn)運(yùn)RNA方面，二者表現(xiàn)出的基因差異更大（表2）。

2.2 密碼子偏好性

雜花苜蓿葉綠體基因組密碼子的檢測(cè)結(jié)果表明，54個(gè)蛋白編碼基因中共有36 498個(gè)密碼子參與。其中，編碼亮氨酸（Leu）的密碼子3 819個(gè)，占總密碼子總數(shù)的10.46%，頻率最高；其次是異亮氨酸（Ile），數(shù)量為3 303個(gè)，占比為9.05%；參與頻率低于1 000的密碼子有半胱氨酸、色氨酸、甲硫氨酸及組氨酸；所有三個(gè)終止密碼子都存在，其中UAA最常見(jiàn)。在存在使用偏好性的密碼子中，相對(duì)同義密碼子（RSCU）大于1的有32個(gè)，其中29個(gè)密碼子的堿基構(gòu)成以A/U結(jié)尾，其余3個(gè)以G結(jié)尾，以A/U結(jié)尾的密碼子占比為90.6%。因此，雜花苜蓿對(duì)A/U結(jié)尾的密碼子較為偏好（圖2）。

2.3 簡(jiǎn)單重復(fù)序列分析

雜花苜蓿葉綠體基因組SSR位點(diǎn)分析結(jié)果如圖3所示，大多數(shù)SSR位于編碼區(qū)，3種不同類型的88個(gè)SSRs位點(diǎn)在葉綠體基因組中的分布并不均衡，LSC，SSC，IR區(qū)域SSR數(shù)量分別為79，7和2個(gè)，占比分別為90%，8.0%，2.0%。從序列的重復(fù)情況來(lái)看（表3），單核苷酸重復(fù)序列出現(xiàn)頻率較高，為79個(gè)，其中僅有A堿基的重復(fù)序列51 SSRs，T堿基28 SSRs。由AT/TA組成的兩種二核苷酸類型共7個(gè)；三核苷酸重復(fù)序列較少，僅為2個(gè)。雜花苜蓿葉綠體基因組SSR位點(diǎn)A/T堿基占優(yōu)勢(shì)，具有堿基偏好性。

2.4 共線性分析

使用Mauve軟件對(duì)7個(gè)苜蓿屬植物在葉綠體基因組水平的共線性關(guān)系進(jìn)行分析（圖4）。隸屬于苜蓿屬的7個(gè)不同物種之間葉綠體基因組結(jié)構(gòu)存在

復(fù)雜的重排現(xiàn)象，雜花苜蓿在長(zhǎng)度方面與紫花苜蓿及野苜蓿較為接近，在位置方面雜花苜蓿與紫花苜蓿有4個(gè)共性區(qū)域，但存在一段基因重排現(xiàn)象。野苜蓿與花苜蓿、蒺藜苜蓿的共性區(qū)域最多，為5個(gè)。由此可見(jiàn)雜花苜蓿與紫花苜蓿具有一定的相似性，與其他物種的種間差異較大，其變異程度較高。

2.5 雜花苜蓿及其近緣物種系統(tǒng)發(fā)育分析

為鑒定雜花苜蓿在苜蓿屬植物中的進(jìn)化位置，本文基于29個(gè)物種的葉綠體基因組序列，用最大似然法（Maximum likelihood，ML）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖5）。結(jié)果顯示，煙草（Micotiana tabacum）作為外群聚為一類，其余苜蓿屬相關(guān)的28個(gè)物種聚為另一類，在后者類別中可看出，雜花苜蓿與紫花苜蓿親緣關(guān)系最近，二者具有99%的支持率。

3 討論

葉綠體是植物進(jìn)行光合作用的主要場(chǎng)所，也是植物所特有的重要細(xì)胞器之一。葉綠體自身?yè)碛歇?dú)立且完整的基因組，攜帶有大量遺傳信息^［18］。葉綠體基因組一般為共價(jià)閉合環(huán)狀雙鏈分子，具有較強(qiáng)的保守性，主要分為單拷貝區(qū)（Large single-copy，LSC）、小單拷貝區(qū)（Small single-copy，SSC）和一對(duì)反向重復(fù)序列（Inverted repeats，IR），共4個(gè)區(qū)域。本研究以紫花苜蓿葉綠體基因組為參考組，采用第二代高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)‘草原3號(hào)’雜花苜蓿葉綠體基因組測(cè)序分析后發(fā)現(xiàn)，該材料葉綠體基因組全長(zhǎng)125 317 bp，其大小在多數(shù)被子植物中居中^［19］，GC含量33.87%，與苜蓿屬其他物種的葉綠體基因組差異較小^［20］。

大部分豆科牧草如三葉草（Trifolium）、蒺藜苜蓿和鷹嘴豆（cicer arietinum）等葉綠體基因組結(jié)構(gòu)都較為特殊，存在一個(gè)反向重復(fù)區(qū)完全丟失的現(xiàn)象^［21］。雜花苜蓿屬豆科牧草，但其葉綠體基因組結(jié)構(gòu)完整，為典型四分體，不存在IR區(qū)丟失現(xiàn)象。雜花苜蓿葉綠體基因組共編碼到106個(gè)基因，這與陶曉麗等^［5］的牧草葉綠體基因組通常有120～130個(gè)基因的情況稍有出入，原因在于不同物種葉綠體基因組編碼基因數(shù)目存在一定差異，而這些差異主要是由于蛋白編碼基因數(shù)目不一致所致^［20］，基因類別涉及光合作用基因、蛋白質(zhì)編碼基因和未知功能基因。

密碼子偏好性是指物種對(duì)編碼相同氨基酸的同義密碼子的不均等使用。在雜花苜蓿葉綠體基因組中篩選出54個(gè)蛋白編碼基因，共檢測(cè)出36 498個(gè)密碼子參與其中，編碼亮氨酸的密碼子數(shù)量最多，是所有密碼子使用最為頻繁的，相對(duì)統(tǒng)一密碼子（RSCU）大于1的有32個(gè)，密碼子構(gòu)成的堿基大部分是以A/U結(jié)尾，這與蒺藜苜蓿及紫花苜蓿等苜蓿屬植物分析結(jié)果一致^［22-23］。故此，今后苜蓿屬植物葉綠體基因工程在設(shè)計(jì)外源基因載體時(shí)，選用以A/U堿基結(jié)尾為最優(yōu)密碼子，可適當(dāng)提高外源基因的表達(dá)效率。葉綠體基因標(biāo)記物，如簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSRs）具備很好的重復(fù)性、豐富的多態(tài)性等優(yōu)點(diǎn)，尤其在遺傳多樣性研究^［24］及種質(zhì)資源鑒定方面有重要的應(yīng)用價(jià)值^［25］。本研究鑒定到的3種不同類型的88個(gè)SSR位點(diǎn)，分布在LSC、SSC、IR三個(gè)區(qū)域，單核苷酸重復(fù)序列出現(xiàn)頻率較高，三核苷酸重復(fù)序列出現(xiàn)頻率較低，這與陶曉麗等^［22］的研究結(jié)果一致。對(duì)苜蓿屬的7個(gè)物種進(jìn)行共線性分析發(fā)現(xiàn)，均出現(xiàn)較嚴(yán)重的重排的現(xiàn)象，表明雜花苜蓿的變異程度較高。

苜蓿存在種內(nèi)和種間的天然雜交，種間以及種群間的遺傳學(xué)研究受到干擾，從而造成苜蓿屬植物分類的困擾。葉綠體基因組數(shù)據(jù)能有效進(jìn)行植物物種鑒定和系統(tǒng)親緣關(guān)系分析，尤其在近緣物種間具有更理想的效果。有學(xué)者從形態(tài)學(xué)主成分分析特征的角度研究，可將雜花苜蓿作為紫花苜蓿的復(fù)合體^［26］，本文通過(guò)對(duì)27個(gè)苜蓿屬物種系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)雜花苜蓿與紫花苜蓿的親緣關(guān)系最近，這也從葉綠體基因組角度證明其分類的準(zhǔn)確性。雜花苜蓿作為苜蓿屬的優(yōu)異種質(zhì)資源，探究其發(fā)育關(guān)系能夠更有效的利用其雜種優(yōu)勢(shì)，挖掘相關(guān)特異基因，以便為紫花苜蓿的抗逆性研究提供有力的理論依據(jù)。

4 結(jié)論

‘草原3號(hào)’雜花苜蓿葉綠體基因組全長(zhǎng)125 317 bp，為典型的四分體結(jié)構(gòu)，堿基GC含量33.87%，密碼子更偏好以A/U結(jié)尾。葉綠體基因組共編碼106個(gè)基因，其中蛋白質(zhì)編碼基因54個(gè)，涉及36 498個(gè)密碼子。3種不同類型的88個(gè)SSR位點(diǎn)分布不均衡，單核苷酸重復(fù)序列出現(xiàn)頻率較高。共線性分析其存在嚴(yán)重的基因重排現(xiàn)象，與其他物種的種間差異較大，變異程度較高。在系統(tǒng)發(fā)育上，雜花苜蓿與苜蓿屬內(nèi)各相關(guān)物種的遺傳距離均較近，尤以與紫花苜蓿具的親緣關(guān)系最近，這也從葉綠體的角度驗(yàn)證了傳統(tǒng)分類學(xué)的結(jié)論。

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（責(zé)任編輯 彭露茜）