摘要：本研究為探究北陵鳶尾（Iris typhifolia）葉綠體基因組的基本特征，明確其在鳶尾屬的系統(tǒng)發(fā)育位置，采用Illumina二代測(cè)序技術(shù)對(duì)北陵鳶尾葉綠體基因組進(jìn)行測(cè)序，對(duì)其葉綠體基因組基本特征進(jìn)行分析，結(jié)果表明：北陵鳶尾葉綠體基因組大小為152 405 bp，具有典型的環(huán)狀四分體結(jié)構(gòu)，包含82 335 bp的大單拷貝區(qū)（LSC）、18 018 bp的小單拷貝區(qū)（SSC）和一對(duì)26 026 bp的反向重復(fù)區(qū)（IRs），總GC含量為38.04%；共注釋得到133個(gè)基因，包含87個(gè)蛋白編碼基因、8個(gè)rRNA基因和38個(gè)tRNA基因；共檢測(cè)到57個(gè)SSR位點(diǎn)，其中單核苷酸重復(fù)數(shù)量最多；系統(tǒng)發(fā)育分析表明北陵鳶尾和溪蓀（I. sanguinea）關(guān)系較近，支持率為100%。本研究通過(guò)對(duì)北陵鳶尾葉綠體基因組重復(fù)序列、IR邊界、系統(tǒng)發(fā)育等進(jìn)行分析，為北陵鳶尾的分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)、系統(tǒng)發(fā)育分析、物種鑒定和種質(zhì)資源開(kāi)發(fā)及利用提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：北陵鳶尾；鳶尾屬；葉綠體基因組；高通量測(cè)序；簡(jiǎn)單重復(fù)序列；系統(tǒng)發(fā)育

中圖分類號(hào)：S945.79

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-0435（2023）06-1656-09

Complete Chloroplast Genomes and Characteristics Analysis of Iris typhifolia

LU Zheng-yang¹， YU Feng-yang²， XIAO Yue-e²， SHI Yu¹， BI Xiao-ying^1*

（1.Shenyang Agricultural University， Shenyang， Liaoning Province 110866， China； 2．Shanghai Botanical Garden， Shanghai 200231， China）

Abstract：To obtain the basic characteristics of the chloroplast genome of Iris typhifolia，and identify its phylogenetic position in Iris，Illumina next-generation sequencing technology was used to sequence the chloroplast genome of I. typhifolia，and to investigate the basic characteristics of the chloroplast genome. The results showed that：the chloroplast genome of I. typhifolia was 152 405 bp in length. That genome had a typical annular quadripartite structure，including one large single copy region （LSC） of 82 335 bp，one small single copy region （SSC） of 18 018 bp and two inverted repeat regions （IR） of 26 026 bp. The total GC content in the genome was 38.04%. The genome encoded 133 genes，including 87 protein-coding genes，8 rRNA genes and 38 tRNA genes. The total of 57 SSR loci within the genome were detected，and the number of mononucleotide repeats was the most. The phylogenetic analysis on that genome showed that I. typhifolia had a close relationship with I. sanguinea with 100% support. This study enriched the information on the genetic resources of Iris，and provided reference for molecular marker development，phylogenetic analysis，species identification，and germplasm resources development and utilization of I. typhifolia.

Key words：Iris typhifolia;Iris; Chloroplast genome;High-throughout sequencing;Simple sequence repeat;Phylogeny

鳶尾屬（Iris）是鳶尾科（Iridaceae）中物種數(shù)量最多、分布范圍最廣的屬，約有300個(gè)種，主要分布在北半球溫帶地區(qū)^［1］。由于種類繁多、形態(tài)變異大，且存在天然雜交，鳶尾屬的分類一直是該屬研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。目前，鳶尾屬本身的分類地位已經(jīng)明確，但其組成和分類地位尚存爭(zhēng)議^［2］。

北陵鳶尾（Iris typhifolia Kitag.）是鳶尾屬多年生草本植物，又稱香蒲葉鳶尾，主要分布在中國(guó)東北的遼寧、吉林和內(nèi)蒙古地區(qū)^［3-4］，通常在沼澤地、河邊或靠近湖泊附近生長(zhǎng)^［3］。該植物由日本植物學(xué)家Kitagawa于1934年發(fā)現(xiàn)，模式標(biāo)本采自遼寧省沈陽(yáng)市北陵^［5］。北陵鳶尾的葉片纖細(xì)，開(kāi)花時(shí)間較早，適應(yīng)范圍廣，觀賞價(jià)值高，具有大面積推廣應(yīng)用的潛力^［6］，同時(shí)還是西伯利亞鳶尾（Siberian irises）育種的重要親本。

北陵鳶尾在外觀上與同亞系的西伯利亞鳶尾（I. sibrica）和溪蓀（I. sanguinea）近似，在傳統(tǒng)分類系統(tǒng)中，三者均隸屬于西伯利亞鳶尾亞系。北陵鳶尾最初被認(rèn)定為西伯利亞鳶尾^［7］，但Kitagawa認(rèn)為北陵鳶尾的葉片更加纖細(xì)，葉片寬度在0.15～0.22 cm，且葉態(tài)較為扭曲，與同亞系的另外兩個(gè)物種明顯不同，應(yīng)當(dāng)作為一個(gè)獨(dú)立種^［5］。Waddick等同意Kitagawa對(duì)北陵鳶尾的分類處理^［8］。在栽培條件下北陵鳶尾葉片比原始描述更寬^［3］，因此，其物種地位仍然存在爭(zhēng)議^［7］。

僅依靠形態(tài)特征的分類方法容易受到環(huán)境因子的影響，而以基因序列等分子數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)的分類方法不容易受到環(huán)境因子的干擾，可為解決存在爭(zhēng)議的分類問(wèn)題提供更加可靠的理論依據(jù)和數(shù)據(jù)參考。葉綠體是綠色植物進(jìn)行光合作用的細(xì)胞器，對(duì)維持植物生命中起到至關(guān)重要的作用，具有半自主性，其基因組被稱為葉綠體基因組（Chloroplast genome）^［9］。葉綠體基因組在被子植物中大多為母系遺傳，非常保守，重組事件發(fā)生次數(shù)極少或不發(fā)生，種內(nèi)變異極少或不發(fā)生，可直接建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)^［10］。葉綠體基因組核苷酸置換率適中，大小適中，良好的共線性便于比對(duì)和分析^［11］。此外，其編碼區(qū)和非編碼區(qū)的演化速率差異較大，適用于不同分類層次的研究^［12］。正因?yàn)檫@些優(yōu)點(diǎn)，越來(lái)越多的研究人員將其用于植物系統(tǒng)發(fā)育和親緣關(guān)系等方面的研究^［13］。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，獲得完整葉綠體基因組的成本大大降低，越來(lái)越多鳶尾屬植物的葉綠體基因組得到解析且被收錄在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)^［14-17］。

本研究通過(guò)高通量測(cè)序獲得北陵鳶尾的葉綠體基因組全序列，明確其序列特征、基因組結(jié)構(gòu)及與近緣物種間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，以期為深入揭示鳶尾屬植物的系統(tǒng)演化關(guān)系提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。此外，北陵鳶尾葉綠體基因組還可為鳶尾屬的遺傳多樣性等研究提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料采自黑龍江省佳木斯市申家店（引種號(hào)：YW116），采集地生境為干旱林緣草叢，后移栽至沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)鳶尾種質(zhì)資源圃，經(jīng)沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院畢曉穎副教授鑒定為北陵鳶尾。在2021年10月取其健康無(wú)病蟲(chóng)害的新鮮葉片，放置于取樣袋后加入硅膠干燥保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總DNA提取和測(cè)序 使用新型植物基因組DNA提取試劑盒（康為世紀(jì)公司，北京）提取總DNA，利用瓊脂糖凝膠電泳和微量分光光度計(jì)（NanoDrop-2000）對(duì)DNA進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。樣本檢測(cè)合格后，構(gòu)建插入片段為350 bp的測(cè)序文庫(kù)，采用Illumina Novaseq 6000測(cè)序平臺(tái)對(duì)文庫(kù)進(jìn)行雙末端測(cè)序，測(cè)序由惠通生物科技有限公司（深圳市）完成。使用NGS QC Tool-Kit v2.3.3軟件對(duì)測(cè)序得到的的原始數(shù)據(jù)（Raw reads）進(jìn)行低質(zhì)量數(shù)據(jù)過(guò)濾，獲得高質(zhì)量的過(guò)濾后數(shù)據(jù)（Clean reads）4.91 G。

1.2.2 葉綠體基因組組裝和注釋 使用SPAdes v3.11.0軟件對(duì)clean reads進(jìn)行從頭組裝得到葉綠體全基因組^［18］。使用PGA軟件對(duì)葉綠體基因組進(jìn)行注釋^［19］，將溪蓀（GenBank登錄號(hào)：NC_029227）^［14］的葉綠體基因組作為參考基因組，經(jīng)手動(dòng)矯正后得到最終注釋結(jié)果。將得到的基因組注釋信息以及基因組序列生成文件提交至NCBI（GenBank登錄號(hào)：OP114060），使用在線軟件OGDRAW繪制葉綠體基因組圖譜^［20］。

1.2.3 密碼子偏好性分析 利用CodonW1.4.2軟件對(duì)葉綠體基因組的密碼子使用頻率和相對(duì)密碼子使用頻率RCSU（Relative synonymous codon usage）進(jìn)行估計(jì)。RSCU值gt;1表明該密碼子使用頻率較高，RSCU值lt;1表示該密碼子使用頻率較低，RSCU值=1表示對(duì)密碼子的使用沒(méi)有偏好^［21］。

1.2.4 簡(jiǎn)單重復(fù)序列分析和IR區(qū)收縮和擴(kuò)張分析 利用MISA軟件檢測(cè)葉綠體基因組的簡(jiǎn)單重復(fù)序列（Simple sequence repeat，SSR）^［22］。軟件參數(shù)設(shè)置為單核苷酸數(shù)≥10，二核苷酸重復(fù)數(shù)≥ 5，三核苷酸重復(fù)數(shù)≥ 4，四核苷酸≥ 3，五核苷酸重復(fù)數(shù)≥ 3，六核苷酸重復(fù)數(shù)≥ 3。若兩個(gè)SSR之間的距離小于100 bp，則認(rèn)為是復(fù)合簡(jiǎn)單重復(fù)序列。

選取北陵鳶尾的三個(gè)近緣種：溪蓀（I. sanguinea）、燕子花（I. laevigata）和黃菖蒲（I. pseudacorus），使用在線軟件IRscope分析其IR區(qū)收縮和擴(kuò)張情況^［23］。

1.2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析 從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)上選取已公開(kāi)的8種鳶尾屬植物的葉綠體基因組：溪蓀（I. sanguinea，NC_029227）、燕子花（I. laevigata，NC_056176）、黃菖蒲（I. pseudacorus，NC_056179）、馬藺（I. lactea，NC_056175）、野鳶尾（I. dichotoma，NC_056172）、射干（I. domestica，NC_050833）和I. gatsii（NC_024933），以番紅花（Crocus sativus，NC_041460）作為外類群，對(duì)北陵鳶尾和其余8個(gè)鳶尾屬物種構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。使用MAFFT軟件對(duì)所有選擇物種的葉綠體基因組序列進(jìn)行比對(duì)^［24］，使用門戶網(wǎng)站CIPRES（https：//www.phylo.org/ portal2/login！input.action）的RAxML-HPC構(gòu)建基于最大似然法（Maximum Likelihood，ML）的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)^［25］，自舉檢驗(yàn)值設(shè)置為1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠體基因組結(jié)構(gòu)分析

北陵鳶尾葉綠體基因組全長(zhǎng)152 405 bp。具有絕大多數(shù)高等植物葉綠體基因組典型的，北陵鳶尾葉綠體基因組具有典型的四段式結(jié)構(gòu)，包含1個(gè)大單拷貝區(qū)（Large single copy，LSC，82 335 bp）、1個(gè)小單拷貝區(qū)（Small single copy，SSC，18 018 bp）和兩個(gè)反向重復(fù)區(qū)（Inverted repeat，IR，26 026 bp）（圖1）。北陵鳶尾葉綠體基因組的總GC含量為38.04%，其中IR區(qū)的GC含量（43.07%）明顯要高于LSC區(qū)（36.22%）和SSC區(qū)（31.84%）。

北陵鳶尾葉綠體基因組共注釋到133個(gè)基因，包含87個(gè)蛋白編碼基因、8個(gè)rRNA基因和38個(gè)tRNA基因（表1），按照基因的功能可以將注釋的基因分為光合系統(tǒng)基因（Genes for photosynthesis）、自我復(fù)制基因（Self-replication）、其他基因（Other genes）和未知功能基因（Genes of unknown function）四大類。其中19個(gè)基因含有2份拷貝，包括8個(gè)tRNA基因（trnA-UGC，trnH-GUG，trnI-CAU，trnI-GAU，trnL-CAA，trnN-GUU，trnR-ACG和trnV-GAC）和4個(gè)rRNA基因（rrn4.5，rrn5，rrn16，rrn23），以及ndhB，rps12，rps19，rps7，rpl23，ycf1和ycf2基因。共有17個(gè)基因內(nèi)存在內(nèi)含子，其中trnK-UUU，rps16，trnG-UCC，atpF，rpoC1，trnL-UAA，trnV-UAC，petB，petD，rpl16，rpl2，ndhB，trnI-GAU，trnA-UGC和ndhA基因各含有一個(gè)內(nèi)含子，clpP，ycf3基因含有兩個(gè)內(nèi)含子。rps12基因存在反式剪接情況。

2.2 SSR位點(diǎn)分析

在北陵鳶尾葉綠體基因組中一共檢測(cè)到57個(gè)SSR位點(diǎn)，主要分布在LSC區(qū)（40個(gè)，占比70.18%），其次是SSC區(qū)（13個(gè)）和IR區(qū)（4個(gè)）。SSR位點(diǎn)包含33個(gè)單核苷酸重復(fù)、14個(gè)雙核苷酸重復(fù)、2個(gè)三核苷酸重復(fù)、7個(gè)四核苷酸重復(fù)和1個(gè)五核苷酸重復(fù)（表2）。單核苷酸類型重復(fù)占比最大，為57.9%，且全部由A/T組成。由A/T組成的SSR占全部SSR的87.7%，表明北陵鳶尾葉綠體基因組偏好使用A堿基和T堿基。大部分SSR位于基因間區(qū)（37個(gè)，65.91%），其次是位于基因編碼區(qū)的14個(gè)和基因內(nèi)含子區(qū)的6個(gè)（表3）。

2.3 密碼子偏好性分析

從北陵鳶尾葉綠體基因組中共得到了69種密碼子，編碼24種已知氨基酸，總密碼子數(shù)量為50 801個(gè)。編碼亮氨酸（Leu）的密碼子數(shù)量最多，為4 973個(gè)（9.79%）；編碼半胱氨酸（Trp）的數(shù)量最少，為711個(gè)（2.15%）（表4）。RSCU值大于1.00的密碼子為33個(gè)。其中29個(gè)以A（15）或U（14）結(jié)尾，占比87.87%，表明北陵鳶尾葉綠體基因組偏好使用A/U結(jié)尾的密碼子。RSCU值小于1.00的密碼子為34個(gè)，其中26個(gè)以C（15）或G（11）結(jié)尾，RSCU值等于1的密碼子有2個(gè)，表明該密碼子使用無(wú)偏好性。

2.4 IR邊界分析

將北陵鳶尾與4個(gè)鳶尾屬葉綠體基因組的IR邊界進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)所選5種鳶尾屬植物葉綠體基因組長(zhǎng)度差異較小（在151 081～152 562 bp之間），其中北陵鳶尾和溪蓀的長(zhǎng)度僅相差3 bp。LSC、SSC和IR區(qū)的長(zhǎng)度相似，IR區(qū)與SSC區(qū)邊界基因的組成和分布高度保守，但他們之間仍有略有差異（圖2）。位于IRb區(qū)的rps19基因距離LSC/IRb邊界在33～45 bp，其中北陵鳶尾和溪蓀相同且為37 bp。ycf1基因和ndhF基因均橫跨SSC/IRb邊界，整體長(zhǎng)度和向IRb和SSC區(qū)延伸的長(zhǎng)度均一致。ycf1基因橫跨JSA邊界，在IRa區(qū)均延伸了902 bp，在SSC區(qū)延伸了4 339～4 495 bp，北陵鳶尾和溪蓀的延伸長(zhǎng)度一致，為4 474 bp。rps19基因距離LSC/IRa邊界在22～38 bp，北陵鳶尾和溪蓀的長(zhǎng)度相同，為38 bp。因此，北陵鳶尾與溪蓀的IR邊界完全一致，只在LSC和SSC的長(zhǎng)度上有差別。

2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

為明確北陵鳶尾的系統(tǒng)發(fā)育位置，以番紅花為外類群，構(gòu)建基于鳶尾屬9個(gè)物種葉綠體基因組的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果顯示，外類群番紅花單獨(dú)聚成一個(gè)分支，北陵鳶尾和其他鳶尾屬植物組成一個(gè)單系群。鳶尾屬進(jìn)一步分成兩個(gè)分支，其中一個(gè)分支由Iris gatsii、射干和野鳶尾組成，另一個(gè)分支由馬藺、燕子花、黃菖蒲、溪蓀和北陵鳶尾組成，其中北陵鳶尾和溪蓀聚成一個(gè)單系分支，表明二者親緣關(guān)系最近。各節(jié)點(diǎn)的支持率均為100%（圖3）。用MEGA X軟件獲得的最大簡(jiǎn)約樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與本樹(shù)一致。

3 討論

本研究得到的北陵鳶尾葉綠體基因組具有多數(shù)被子植物典型的四分體結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)度為152 405 bp，處于被子植物葉綠體基因組正常長(zhǎng)度范圍之內(nèi)^［26］。葉綠體GC含量為38.04%，這與溪蓀等鳶尾屬植物的葉綠體基因組研究結(jié)果相似^［13-16］。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）又稱微衛(wèi)星序列，是指1～5個(gè)核苷酸為重復(fù)單位，首尾相連形成的DNA序列^［27］，大量存在于生物體的基因組中，影響著細(xì)胞多種生命活動(dòng)，對(duì)開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記、遺傳多樣性分析和物種鑒定等領(lǐng)域的研究有重要意義^［28-29］。本研究在北陵鳶尾cpDNA中發(fā)現(xiàn)57個(gè)SSR位點(diǎn)，半數(shù)以上（65.91%）的位點(diǎn)分布在基因間區(qū)，出現(xiàn)最多的SSR類型為單核苷酸，全部由A或T組成，這與前人的研究一致，即植物葉綠體SSR標(biāo)記富含A/T重復(fù)^［30］。本研究填補(bǔ)了北陵鳶尾SSR位點(diǎn)研究的空白，為北陵鳶尾分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)和物種鑒定奠定了一定基礎(chǔ)。

密碼子偏好性是物種對(duì)所處環(huán)境長(zhǎng)期適應(yīng)的表現(xiàn)，在生物中廣泛存在，該偏好性受到突變、遺傳漂變和自然選擇等多種因素的影響，能為研究物種親緣關(guān)系、起源和進(jìn)化提供參考^［31］。RSCU指在編碼同一氨基酸時(shí)，某一特定密碼子在所有同義密碼子中出現(xiàn)的相對(duì)概率，能夠直觀反映密碼子偏好性。在北陵鳶尾葉綠體基因組33個(gè)RSCU值gt;1的密碼子中，以A/T為結(jié)尾的占了87%，表明其偏好使用A/T為結(jié)尾，基因組在堿基組成上A和T的占比更高，這與大多數(shù)被子植物葉綠體基因組一致^［32］。

將葉綠體基因組和其序列作為依據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，能為物種間的親緣關(guān)系判斷提供依據(jù)。本研究系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果與傳統(tǒng)鳶尾屬分類一致，且北陵鳶尾和溪蓀親緣關(guān)系最近，支持率為100%。Wlison基于葉綠體序列matK，trnK和trnL-F建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，發(fā)現(xiàn)西伯利亞鳶尾亞系為多系，西伯利亞鳶尾嵌入燕子花系（I. series Laevigatae）的支系中^［33］。Boltenkov利用trnL-trnF、 psbA-trnH、trnS-trnG和rps4-trnS片段構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)高度支持西伯利亞鳶尾亞系為單系群，這與Wilson得出的結(jié)論不一致，有學(xué)者認(rèn)為Wilson研究中唯一代表西伯利亞鳶尾的標(biāo)本為錯(cuò)誤鑒定，結(jié)合形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)，作者建議將溪蓀、西伯利亞鳶尾和北陵鳶尾合并成一個(gè)物種^［7］。本研究支持西伯利亞鳶尾亞系為單系群的結(jié)論。溪蓀葉綠體基因組大小為152 408 bp，LSC區(qū)、SSC區(qū)和IR區(qū)的長(zhǎng)度分別為82 340，18 016和26 026 bp，總GC含量為38.04%，編碼133個(gè)基因，包擴(kuò)87個(gè)蛋白編碼基因、38個(gè)tRNA基因和8個(gè)rRNA基因^［13］。北陵鳶尾和溪蓀的葉綠體基因組相比，總長(zhǎng)度和各區(qū)域長(zhǎng)度差異甚微，在IR區(qū)邊界和基因組成方面則完全一致，表明北陵鳶尾和溪蓀的親緣關(guān)系非常近。但鳶尾屬分類難度較大，種間具有復(fù)雜的形態(tài)變異，關(guān)于北陵鳶尾、溪蓀和西伯利亞鳶尾是否應(yīng)當(dāng)作為同一個(gè)物種來(lái)看待，還需要在未來(lái)的研究中引入更全面的葉綠體基因組數(shù)據(jù)，同時(shí)將形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)和微觀數(shù)據(jù)與之相結(jié)合，才能徹底解決該問(wèn)題。

4 結(jié)論

本研究完成了北陵鳶尾葉綠體基因組測(cè)序、組裝和注釋，并對(duì)其結(jié)構(gòu)、基因組成、SSR位點(diǎn)、密碼子偏好性及系統(tǒng)發(fā)育位置進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示北陵鳶尾葉綠體基因組大小為152 405 bp，總GC含量為38.04%，呈現(xiàn)四段式結(jié)構(gòu)，注釋得到133個(gè)基因；密碼子偏向使用A和T這兩種堿基；北陵鳶尾與溪蓀親緣關(guān)系最近。本研究可為后續(xù)開(kāi)展該植物的系統(tǒng)演化、遺傳多樣性和資源開(kāi)發(fā)利用等研究提供參考。

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（責(zé)任編輯 彭露茜）