摘 要：采用20 L發(fā)酵罐平臺對飼用凝結芽孢桿菌W-02菌株進行分批發(fā)酵，實時監(jiān)測發(fā)酵液的溶氧含量、吸光度、pH值、活菌數(shù)和可溶性總糖含量，在此基礎上采用Logistic方程和Luedeking-Piret方程分別擬合了菌體生長和可溶性總糖消耗的動力學方程，獲得了該菌株分批發(fā)酵的動力學方程模型和參數(shù)。結果表明：菌體生長模型為；可溶性總糖消耗模型為；2個模型計算的模擬值與驗證試驗的試驗值擬合度均較好，平均相對誤差均小于10%。該結果為凝結芽孢桿菌實際生產(chǎn)中發(fā)酵過程自動化監(jiān)測和實時控制提供了依據(jù)。

關鍵詞：凝結芽孢桿菌；液體分批發(fā)酵；菌體數(shù)；可溶性總糖；動力學方程

中圖分類號：TQ920.6 文獻標識碼：A 文章編號：1006-060X（2023）03-0001-05

Abstract： Bacillus coagulans strain W-02 was fermented in batches in 20 L fermentor. During the fermentation process， the dissolved oxygen， absorbance， pH value， viable bacterium count， and soluble total sugar content were measured in real time. Thereafter， the Logistic equation and Luedeking-Piret equation were employed to respectively fit the dynamics of bacterium growth and soluble total sugar consumption. The kinetic models and parameters describing the batch fermentation process were obtained. The results showed that the bacterial growth model was ， and the model of soluble total sugar consumption was .The analogue values calculated from the obtained two kinetic equations were highly in fit with the experimental values， with average relative errors of less than 10%. The results provide a basis for automatic monitoring and real-time control of fermentation process in actual production of Bacillus coagulans.

Key words：Bacillus coagulans; liquid fermentation in batches; viable bacterium count; soluble total sugar; kinetic equations

微生態(tài)制劑具有維持動物腸道微生態(tài)平衡、刺激免疫應答、提高動物消化吸收能力等功效，是當前延緩致病菌耐藥性、降低化學農(nóng)藥殘留的一種抗生素理想替代品[1-3]。凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulans）是乳酸菌的一種，具有降低腸道pH值和黏膜通透性、調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、提高腸道黏膜屏障保護作用和免疫力等特性[4-5]；同時，它也是芽孢桿菌的一種，具有抗逆性強、耐高溫、易貯存等獨特耐受特性[6]。經(jīng)過多年的研究，學者們對凝結芽孢桿菌的益生特性和安全性已有較全面的認識，而且該菌也被農(nóng)業(yè)農(nóng)村部列入可直接飼用的畜禽飼料添加劑品種名錄[7]。當前，對凝結芽孢桿菌發(fā)酵的研究主要集中在菌株篩選[7]、芽孢形成條件[8-9]、培養(yǎng)基優(yōu)化[10-11]、發(fā)酵產(chǎn)物優(yōu)化[12]、高密度發(fā)酵[13-14]、補料工藝[15]等方面，但對其發(fā)酵動力學的研究還未見報道。課題組前期篩選到一株凝結芽孢桿菌W-02菌株，在優(yōu)化培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的基礎上，對該菌株液體分批發(fā)酵過程中菌體生長和可溶性總糖消耗的動力學變化過程進行了研究，進一步擬合和構建了菌體生長、可溶性總糖消耗的發(fā)酵動力學方程，為凝結芽孢桿菌實際生產(chǎn)中發(fā)酵過程自動化監(jiān)測和實時控制提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulans）為課題組前期篩選到的W-02菌株，由筆者實驗室分離保存。

主要設備有WJ-250B生化培養(yǎng)箱、ZHWY-200B恒溫培養(yǎng)振蕩器、PHS-3C型數(shù)顯酸度計、S22型分光光度計、30JS-2002發(fā)酵罐等。

供試培養(yǎng)基有斜面培養(yǎng)基（蛋白胨10 g/L、牛肉膏3 g/L、NaCl 5 g/L、瓊脂20 g/L，pH值7.0～7.2）、種子培養(yǎng)基（蛋白胨10 g/L、牛肉膏3 g/L、NaCl 5 g/L，pH值7.0～7.2）、發(fā)酵培養(yǎng)基（豆粉13.5 g/L、淀粉10.6 g/L、魚粉6.7 g/L、MnSO4·H2O 0.169 g/L、K2HPO4 2.72 g/L、MgSO4 ·7H2O 0.74 g/L、NaNO3 0.34 g/L，初始pH值7.0）和檢測培養(yǎng)基[胰蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L、酵母膏10 g/L、瓊脂18 g/L、鹽溶液10 mL/L（鹽溶液中含有MnSO4·H2O 1 mg/mL、MgSO4 ·7H2O 5 mg/mL、NaCl 5 mg/mL、CaCO3 2 mg/mL）]。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子液培養(yǎng)方法 （1）菌種活化：將凝結芽孢桿菌保藏菌種活化后轉接到斜面培養(yǎng)基，35℃培養(yǎng)24 h，備用。（2）種子液制備：取3環(huán)活化菌種，接入裝有100 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，35℃、200 r/min培養(yǎng)18 h，OD600值介于0.5～0.7。

1.2.2 發(fā)酵罐發(fā)酵參數(shù) 發(fā)酵罐體積20 L 、裝料系數(shù)50%、培養(yǎng)基初始pH值6.5、接種量3%、發(fā)酵溫度35℃、轉速300 r/min、通氣比1.33∶1、溶氧33.6%、罐壓（0.04～0.06）MPa。

1.2.3 發(fā)酵液吸光度檢測方法 取適量發(fā)酵培養(yǎng)基（未進行發(fā)酵）到玻璃比色皿中，設定檢測波長為600 nm，檢測吸光度同時進行調(diào)零，然后分別于發(fā)酵0、6、12、18、24、30、36、42、48 h時取樣檢測發(fā)酵液吸光度，分析發(fā)酵液吸光度在發(fā)酵過程中的變化及其對菌體數(shù)和培養(yǎng)基可溶性總糖的影響。1.2.4 發(fā)酵液溶氧、pH實時在線檢測 分別于發(fā)酵0、6、12、18、24、30、36、42、48 h記錄發(fā)酵液溶氧含量及pH值，分析發(fā)酵液溶氧、pH值在發(fā)酵過程中的變化及其對菌體數(shù)和培養(yǎng)基可溶性總糖的影響。

1.2.5 菌體數(shù)檢測方法 取適量發(fā)酵液，用無菌水進行梯度稀釋，分別取1 mL各稀釋梯度的發(fā)酵液置于無菌培養(yǎng)皿中，倒入冷卻至45℃的檢測培養(yǎng)基，搖勻，充分凝固后置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，計數(shù)，每種濃度重復3次。

1.2.6 發(fā)酵液可溶性總糖含量的測定 按照黃翊鵬等[16]的方法測定發(fā)酵液中的可溶性總糖含量。

2 結果與分析

2.1 凝結芽孢桿菌發(fā)酵過程中發(fā)酵液吸光度和溶氧含量的變化

由圖1可知，發(fā)酵0～30 h時，發(fā)酵液吸光度處于不斷上升階段，溶氧處于不斷下降階段，表明凝結芽孢桿菌在此階段分裂繁殖活躍加劇，菌體數(shù)呈指數(shù)增長，吸光度持續(xù)增加，另一方面，菌體數(shù)呈指數(shù)增長的同時，需要吸收大量的可溶性糖類等有機和無機成分進行新陳代謝，在這個過程中通過有氧呼吸供給自身能量，同時不斷消耗培養(yǎng)基中的氧氣，導致培養(yǎng)基溶氧含量下降。發(fā)酵30 h后，微生物處于穩(wěn)定期衰亡期，前期吸光度稍降，溶氧下降，36 h后部分菌體發(fā)生自溶，菌體數(shù)有所下降，吸光度有所降低，而培養(yǎng)基溶氧則有所回升。

2.2 凝結芽孢桿菌發(fā)酵過程中發(fā)酵液pH值的變化

由圖2可知，凝結芽孢桿菌發(fā)酵過程中pH值持續(xù)下降，發(fā)酵結束時發(fā)酵液pH值下降到5.3，這是因為凝結芽孢桿菌在分裂增殖過程中不斷利用培養(yǎng)基中的可溶性糖類，菌體自身合成能量的同時代謝產(chǎn)生小分子乳酸等有機酸，致使培養(yǎng)基pH值持續(xù)降低。

2.3 發(fā)酵過程中活菌數(shù)和發(fā)酵液可溶性總糖含量的變化

由圖3可知，凝結芽孢桿菌生長曲線為S形，明顯表現(xiàn)為4個時期；其中，0～6 h為延緩期，菌體數(shù)較少；6～30 h為對數(shù)期，菌體數(shù)呈指數(shù)增長；

33～45 h為穩(wěn)定期，菌體數(shù)基本趨于穩(wěn)定，45 h之后為衰亡期。可溶性總糖消耗曲線則呈反S形變化，可溶性總糖消耗程度與菌體生長相適應，發(fā)酵0～6 h菌體耗糖較少，發(fā)酵6 h開始進入快速耗糖期，發(fā)酵33 h后耗糖減慢，至發(fā)酵結束，可溶性總糖含量小于0.5 g/L。

2.4 菌體生長動力學方程及曲線擬合

描述微生物菌體生長動力學的模型很多，其中Monod及Logistic方程最為常用[17]。Monod方程是應用最普遍的微生物生長動力學方程，是一種理論化的簡單模型，未考慮菌體濃度增加對菌體生長的抑制作用，主要用來描述非抑制性單一底物限制情形下的細胞生長，這種理想情況是極少的。

式中：μmax為凝結芽孢桿菌菌體最大比生長速率；X為菌體數(shù)；Ks為半飽和常數(shù)；S為限制性底物濃度（g/L）。

Verhulst-Pear提出的Logistic方程是一個典型的S形曲線[17-18]，能較好地反映分批發(fā)酵過程中因菌體濃度增加對自身生長存在的抑制作用，從而較好地擬合分批發(fā)酵過程中菌體生長規(guī)律。

式中：X為菌體濃度；μmax為最大比生長速率；Xmax為菌體生長上限。

發(fā)酵開始菌體濃度很低，即X比Xmax小得多，X/Xmax項可忽略不計，方程表示菌體呈對數(shù)生長；對數(shù)生長期結束時菌體生長處于穩(wěn)定期，此時X近似于Xmax，方程表示菌體生長停止。凝結芽孢桿菌在分批發(fā)酵過程中，隨著培養(yǎng)的進行，菌體濃度增加對自身生長也會產(chǎn)生抑制作用，此時細胞生長情況可用Logistic方程較好地進行描述。對公式（2）進行積分得公式（3）。

公式（3）可同時表達菌體在對數(shù)生長期和穩(wěn)定期的生長狀態(tài)，μmax可從試驗數(shù)據(jù)獲得；以對時間t進行線性擬合得一直線，

其斜率即為μmax，截距y等于。

因此，最初菌體濃度X0可從公式中求出。經(jīng)線性擬合得到μmax=0.252 4，截距=－4.824，X0=0.470 3，線性擬合見圖4。

公式（3）經(jīng)轉換可得公式（4），根據(jù)公式（4）將模型的計算模擬值與分批發(fā)酵驗證試驗的試驗值進行比較（圖5），模擬值所注誤差線的誤差量為5%，表明模型值與試驗數(shù)據(jù)擬合很好。

2.5 可溶性總糖消耗動力學方程和曲線擬合

凝結芽孢桿菌發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基中可溶性總糖消耗主要用于菌體生長（X）、菌體維持代謝（m）、乳酸合成（P）3個方面，乳酸產(chǎn)物主要在厭氧條件下生成，有氧發(fā)酵過程中，用于乳酸合成的一部分底物可忽略不計，因此，可溶性總糖消耗速率可用類似于Luedeking-Piret方程的公式（5）來表示[19-20]。

由此得到凝結芽孢桿菌發(fā)酵過程可溶性總糖消耗的動力學方程曲線為公式（10）。

根據(jù)公式（10）將模型計算的模擬值與發(fā)酵驗證試驗的試驗值進行比較（見圖7），模擬值所注誤差線的誤差量為10%，表明模擬值與試驗值擬合較好。

3 結論與討論

試驗對凝結芽孢桿菌發(fā)酵過程中發(fā)酵液溶氧、吸光度、pH值、活菌數(shù)和可溶性總糖等參數(shù)指標進行了實時監(jiān)測，在此基礎上對發(fā)酵過程中菌體生長和可溶性總糖消耗的動力學變化進行了研究，采用Logistic方程和Luedeking-Piret方程分別建立了凝結芽孢桿菌（W-02）分批發(fā)酵過程中菌體生長和可溶性總糖消耗隨時間變化的發(fā)酵動力學模型。通過曲線擬合、模型參數(shù)計算和試驗驗證，發(fā)現(xiàn)2個模型的模擬值與試驗值的平均相對誤差均小于10%，表明2個模型均能較好預測實際發(fā)酵過程，該動力學方程的擬合構建對凝結芽孢桿菌發(fā)酵過程監(jiān)測和自動發(fā)酵工藝優(yōu)化具有一定的借鑒和參考意義。

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（責任編輯：成 平）