摘 要：為了了解垃圾中轉(zhuǎn)站空氣中主要細(xì)菌的種類，給氣溶膠的防治策略提供參考依據(jù)，采用Andersen-6級(jí)撞擊式空氣微生物采樣器在多個(gè)生活垃圾中轉(zhuǎn)站采集樣品，采用傳統(tǒng)分離純化方法獲得了4株優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，菌種編號(hào)分別為3、5、6和9號(hào)，這4個(gè)菌落總和占到了總菌落數(shù)的84.3%；通過菌落和菌體形態(tài)、革蘭氏染色、生理生化指標(biāo)、16S rRNA基因序列分析和同源性比較等方法，3、5、6和9號(hào)菌株分別被鑒定為極考克氏菌、拉浩爾谷農(nóng)球菌、條紋微桿菌和解淀粉芽孢桿菌。

關(guān)鍵詞：垃圾中轉(zhuǎn)站；生物氣溶膠；優(yōu)勢(shì)細(xì)菌；形態(tài)學(xué)鑒定；分子生物學(xué)鑒定

中圖分類號(hào)：S511 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-060X（2023）05-0001-04

Abstract：In order to know dominant bacteria species in bioaerosol from the refuse transfer station and provide reference for the control strategy of aerosol， Anderson six-stage sampler was used to collect samples from several refuse transfer stations. And four dominant strains were obtained by traditional separation and purification methods， which were coded No. 3， No. 5， No. 6 and No. 9， accounting for 84.3% of the total colonies. Based on colony and bacterium morphology， Gram stain， physiological and biochemical indexes， sequence analysis of 16S rRNA gene， and homology comparison， strains No.3， No. 5， No. 6 and No. 9 were identified as Kocuria polaris， Agrococcus lahaulensis， Microbacterium lacus， and Bacillus amyloliquefaciens.

Key words：refuse transfer station; bioaerosol; dominant bacteria; morphological identification; molecular biological identification

生物氣溶膠是源自植物、動(dòng)物和微生物死的或活的空氣粒子[1]，粒徑在0.001～100 μm之間。由于它們體積極小，重量極輕，可以在大氣層中停留足夠長的時(shí)間，并進(jìn)行長距離飄移，在大氣、生物圈和生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮作用，從而對(duì)人類健康和生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生一定影響[2]。生物氣溶膠微生物是生物氣溶膠中的重要一類，包括細(xì)菌、真菌、放線菌和病毒等，其在大氣中的濃度具有明顯的時(shí)空差異，受到許多因素的影響，包括微生物來源、人類活動(dòng)和環(huán)境條件等，需要在不同地區(qū)進(jìn)行長期監(jiān)測(cè)[3]。

隨著城鎮(zhèn)化進(jìn)程的加快，城市生活垃圾的產(chǎn)量與日俱增。據(jù)靈動(dòng)核心的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2019年我國城市生活垃圾產(chǎn)生量達(dá)3.43億t，且自我國實(shí)施垃圾分類政策以來，生活垃圾中有機(jī)質(zhì)含量大副提升，在中轉(zhuǎn)站堆放的過程中容易滋生細(xì)菌、真菌和病毒等微生物。附著在垃圾表面的這些微生物伴隨著垃圾的收集、翻倒和轉(zhuǎn)運(yùn)等處置活動(dòng)形成微生物氣溶膠，在空氣中傳播擴(kuò)散，時(shí)間一長這些微生物氣溶膠便有可能通過口鼻吸入和皮膚接觸等途徑影響站內(nèi)工作人員及中轉(zhuǎn)站附近居民的健康，導(dǎo)致人體出現(xiàn)如哮喘、過敏性鼻炎、支氣管炎、閉鎖性結(jié)膜炎和器質(zhì)性塵埃中毒綜合征等致敏性、毒性和致病性癥狀[4-5]。

為了解垃圾中轉(zhuǎn)站空氣中細(xì)菌微生物的種類，筆者從垃圾中轉(zhuǎn)站環(huán)境中采集樣本進(jìn)行優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的分離與鑒定，以確定垃圾中轉(zhuǎn)站內(nèi)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種類，為進(jìn)一步研究中轉(zhuǎn)站內(nèi)生物氣溶膠中細(xì)菌的生物學(xué)特性及微生物氣溶膠的防治策略提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

微生物氣溶膠樣品采自不同的生活垃圾中轉(zhuǎn)站，每個(gè)垃圾站設(shè)置5 個(gè)取樣點(diǎn)。試驗(yàn)所用培養(yǎng)基有LB培養(yǎng)基（蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，NaCl 10.0 g，水1 000 mL，用1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.2±0.2，121℃高溫滅菌15 min，在LB液體培養(yǎng)基中加入15.0 g瓊脂即為固體培養(yǎng)基）和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，牛肉膏3.0 g，水1 000 mL，用1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.2±0.2）。

主要儀器設(shè)備有Andersen-6級(jí)撞擊式空氣微生物采樣器（ETW-6型，常州億通分析儀器制造有限公司）、立式壓力蒸氣滅菌鍋（BXM-30R，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）、恒溫振蕩培養(yǎng)箱（ZQZY-AS9，上海知楚儀器有限公司）、生化培養(yǎng)箱（LRH-400A，廣東泰宏君科學(xué)儀器股份有限公司）、光學(xué)顯微鏡（Axiolab 5，德國ZEISS）、移液器（1 000 μL、100 μL、10 μL， Eppendorf Research plus）、快速混勻器（XH-C，金壇市醫(yī)療儀器廠）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的采集 取樣時(shí)間為每天上午9：00—9：30，每個(gè)采樣點(diǎn)每次采集2組平行樣品，2個(gè)采樣器同時(shí)工作，收集垃圾中轉(zhuǎn)站空氣中的生物氣溶膠顆粒。該采樣器共有6級(jí)，第一級(jí)直徑＞7.0 μm，第二級(jí)直徑為4.7～7.0 μm，第三級(jí)直徑為3.3～4.7 μm，第四級(jí)直徑為2.1～3.3 μm，第五級(jí)直徑為1.1～2.1 μm，第六級(jí)直徑為0.65～1.10 μm。每級(jí)篩板下面放置1個(gè)直徑為90 mm、帶有LB固體培養(yǎng)基的玻璃培養(yǎng)皿。抽吸泵將流量為28.3 L/min的氣流泵送至各級(jí)，空氣流速逐級(jí)增大，從而把空氣中的帶菌粒子按粒徑的大小分別捕獲到各級(jí)培養(yǎng)皿上?？諝獠蓸悠骶嚯x地面1.5 m（人體呼吸高度）。每次取樣3 min，當(dāng)吸入的空氣量達(dá)到所需值時(shí)，逐級(jí)取出培養(yǎng)皿，迅速密封后放入樣品箱帶回實(shí)驗(yàn)室，將采集回的培養(yǎng)皿置于（37±2）℃下恒溫培養(yǎng)48 h。在樣品采集的同時(shí)，使用溫濕度計(jì)監(jiān)測(cè)并記錄采樣時(shí)的溫度和空氣相對(duì)濕度。

1.2.2 菌株的分離與純化 將取回的樣品恒溫培養(yǎng)48 h后，挑取平板中單個(gè)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌于LB液體培養(yǎng)基中再培養(yǎng)48 h，取菌液梯度稀釋后繼續(xù)于LB固體培養(yǎng)基中劃線培養(yǎng)，（37±2）℃下恒溫培養(yǎng)48 h，觀察菌落在平板中的形態(tài)，并進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，若菌落形態(tài)或菌體形態(tài)多樣，則存在雜菌。重復(fù)上述操作，直至菌落和顯微鏡觀察時(shí)菌落及菌體形態(tài)均單一，則菌株已純化，放于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 菌株生理生化鑒定 菌種的生理生化鑒定方法參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，對(duì)各菌進(jìn)行了過氧化氫酶、葡萄糖產(chǎn)氣、MR試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、水解淀粉和明膠液化等試驗(yàn)。

1.2.4 菌株分子生物學(xué)鑒定 以LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌液為模板，采用通用引物27F/1492R[6]擴(kuò)增16S rRNA基因。正向引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；反向引物1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR反應(yīng)體系（50 μL）：10×buffer 5 μL，dNTP 1 μL，正反向引物各1 μL，模版DNA 0.5 μL，Taq聚合酶0.5 μL，超純水41 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；95℃變性1 min，52℃復(fù)性1 min，72℃延伸1.5 min，循環(huán)34次；72℃延伸10 min。將產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用BLAST軟件與GenBank中的16S rRNA基因序列進(jìn)行比對(duì)。采用Mega5軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

優(yōu)勢(shì)菌所占百分比=單一菌種數(shù)/總菌數(shù)×100%

式中：單一菌種數(shù)是指5個(gè)垃圾站內(nèi)菌落形態(tài)一致的細(xì)菌之和；總菌數(shù)是指5個(gè)垃圾站樣品菌落數(shù)之和。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)勢(shì)菌株的分離

根據(jù)菌落形態(tài)及菌體形態(tài)觀察，對(duì)5個(gè)站點(diǎn)采集到的細(xì)菌菌落進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然取樣垃圾站不同，但不同站點(diǎn)的細(xì)菌菌落基本是一致，這可能是因?yàn)榫用竦纳盍?xí)慣差不多，垃圾的組分相近，氣候環(huán)境一致導(dǎo)致站內(nèi)空氣中微生物相近。如表1所示，菌種編號(hào)為3、5、6和9號(hào)的這4種菌落總和占到了總菌落數(shù)的84.3%，因此對(duì)這4種菌落做進(jìn)一步分離純化。

2.2 優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的形態(tài)

對(duì)4株優(yōu)勢(shì)微生物進(jìn)行革蘭氏染色，結(jié)果如表2和圖1所示，其中3株為革蘭氏陽性菌，1株為革蘭氏陰性菌。

2.3 菌種的理化特性

菌株的生理生化試驗(yàn)結(jié)果如表3所示，3號(hào)菌株過氧化氫酶、葡萄糖產(chǎn)氣、MR試驗(yàn)及H2S試驗(yàn)的結(jié)果均為陽性，其他試驗(yàn)結(jié)果為陰性；5號(hào)菌株除葡萄糖產(chǎn)氣、吲哚試驗(yàn)和檸檬酸鹽的利用試驗(yàn)為陰性外，其他試驗(yàn)結(jié)果均為陽性；6號(hào)菌株除VP試驗(yàn)和明膠液化試驗(yàn)結(jié)果為陰性外，其他各項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果均為陽性；9號(hào)菌株的過氧化氫酶、MR試驗(yàn)、明

膠液化及檸檬酸鹽的利用試驗(yàn)結(jié)果為陽性，其他試征基本一致[7]。

2.4 菌種鑒定

16S rRNA基因是細(xì)菌染色體上編碼16S rRNA相對(duì)應(yīng)的DNA序列，可變區(qū)序列因細(xì)菌不同而異，恒定區(qū)序列基本保守，因此可通過比對(duì)可變區(qū)序列的差異對(duì)不同屬、種的細(xì)菌進(jìn)行分類鑒定[8]。

將4個(gè)菌株的測(cè)序結(jié)果分別在NCBI用Blast進(jìn)行同源性檢索，然后采用鄰接法構(gòu)建菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果如圖2所示，3號(hào)菌株的序列與極考克氏菌（Kocuria polaris）的序列有超過99%的相似性，5號(hào)菌株的序列與拉浩爾谷農(nóng)球菌（Agrococcus lahaulensis）的序列有超過98%的相似性，6號(hào)菌株 的序列與條紋微桿菌（Microbacterium lacus）的序列100%相似，9號(hào)菌株的序列與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）的序列有超過99%的相似性。

3 結(jié) 論

微生物氣溶膠是含有包括細(xì)菌、真菌、病毒以及致敏花粉、霉菌孢子、蕨類孢子和寄生蟲卵等有生物性粒子的氣溶膠[9]，它除有一般氣溶膠的特征外，還具有致病性和傳染性。垃圾處理場(chǎng)所微生物氣溶膠的擴(kuò)散和傳播是造成生物性危害的主要原因，當(dāng)垃圾轉(zhuǎn)運(yùn)站工作人員與微生物氣溶膠密切接觸，吸入了這些致病菌或人體的防御能力下降的時(shí)候，就會(huì)引發(fā)各種疾病，產(chǎn)生如鼻炎、哮喘、慢性支氣管炎、皮膚過敏等癥狀[10]。

該研究從垃圾中轉(zhuǎn)站生物氣溶膠中分離純化得到了4株優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，通過菌落和菌體形態(tài)觀察、生理生化特性和16S rRNA基因序列比較分析，確定了3號(hào)菌株為極考克氏菌、5號(hào)菌株為拉浩爾谷農(nóng)球菌、6號(hào)菌株為條紋微桿菌、9號(hào)菌株為解淀粉芽孢桿菌。其中，9號(hào)的解淀粉芽孢桿菌由于自身生長過程中會(huì)產(chǎn)生一系列代謝產(chǎn)物，使其具有廣泛的抑制真菌和細(xì)菌的能力，從而抑制環(huán)境中有害微生物的生理生化活動(dòng)；而6號(hào)的Microbacterium lacus菌與馬嘉偉等[9]發(fā)現(xiàn)的Microbacterium 菌是一致的，該菌是垃圾滲濾液處理區(qū)空氣中的優(yōu)勢(shì)菌，存在可能誘發(fā)疾病的風(fēng)險(xiǎn)；3號(hào)的Kocuria polaris菌和5號(hào)的Agrococcus lahaulensis菌對(duì)人和動(dòng)物沒有直接的危害。然而，生物氣溶膠的危害除了菌體本身可能致病外，還與菌體的濃度及氣溶膠粒徑大小情況等因素有關(guān)，為了更清楚地了解各菌是否對(duì)人體健康有影響，還需做進(jìn)一步的試驗(yàn)研究。

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（責(zé)任編輯：成 平）