摘 要：以雪茄CX-14煙葉為材料，研究了初始含水率（30%、34%、38%）對雪茄煙葉發(fā)酵產(chǎn)香的影響，并通過宏基因組測序技術(shù)明確了雪茄煙葉的菌群結(jié)構(gòu)及功能基因變化，分析了優(yōu)勢菌屬在發(fā)酵過程中的貢獻(xiàn)度，探明了菌群演替與雪茄煙葉香氣產(chǎn)量變化的相關(guān)規(guī)律。結(jié)果表明：當(dāng)雪茄煙葉含水率回潮至34%時，發(fā)酵后的苯丙氨酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)物、類胡蘿卜素降解產(chǎn)物、西柏烷類降解產(chǎn)物、棕色化反應(yīng)產(chǎn)物含量和香氣總量分別比發(fā)酵前提高了77.2%、167.1%、28.6%、51.5%和169.3%，香氣總量分別比30%和38%含水率組提高了26.6%和21.7%；通過宏基因組學(xué)分析，發(fā)酵后葡萄球菌屬（Staphylococcus）豐度占比高達(dá)87.8%，是絕對優(yōu)勢菌屬，而且其對發(fā)酵過程中的次生代謝物生物合成、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、氨基酸生物合成等代謝過程的貢獻(xiàn)度超過了85%；經(jīng)發(fā)酵菌屬與煙葉香型相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)類胡蘿卜素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物是香型的主要呈現(xiàn)者，而且葡萄球菌菌屬在香型節(jié)點最突出，是呈現(xiàn)香型的最大貢獻(xiàn)者。綜上所述，雪茄煙葉發(fā)酵前的最適含水率為34%，發(fā)酵過程中葡萄球菌屬對雪茄煙葉發(fā)酵的香氣產(chǎn)量有顯著促進(jìn)作用。

關(guān)鍵詞：雪茄煙葉；初始含水率；香氣成分；宏基因組分析

中圖分類號：S482.4 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-060X（2023）07-0082-07

Abstract：The effects of initial moisture content （30%， 34% and 38%） on the fermentation aroma production of cigar tobacco leaves were investigated using cigar CX-14 leaves as materials. The changes in the bacterial colony structure and functional genes of cigar tobacco leaves were clarified by macro-genome sequencing technology， and the contribution of dominant genera in the fermentation process was analyzed to investigate the correlation law between the bacterial colony succession and the changes in the aroma production of cigar tobacco leaves. The results showed that when the moisture content of cigar leaves regain to 34%， the contents of phenylalanine conversion products， carotenoid degradation products， cembratriendid degradation products， browning reaction products and total aroma of the fermented cigar tobacco leaves were increased by 77.2%， 167.1%， 28.6%， 51.5% and 169.3% compared with those of the pre-fermentation group， and the total aroma of the fermented cigar tobacco leaves was increased by 26.6% and 21.7% compared with that of the 30% and 38% moisture groups respectively; through macro-genomics analysis， the abundance of Staphylococcus accounted for 87.8% after fermentation， which was the absolute dominant genus， and its contribution to the metabolic processes such as secondary metabolite biosynthesis， ABC transporter protein， amino acid biosynthesis， and other metabolism processes in the process of fermentation was more than 85%. Through the correlation analysis between fermentation bacteria and aroma types of tobacco leaves， it was found that carotenoid conversion products were the main presenters of aroma types， and Staphylococcus was the most prominent in the aroma type node and the biggest contributor to aroma types. To sum up， the optimum moisture content of cigar tobacco leaves before fermentation is 34%， and Staphylococcus can significantly promote the aroma yield of cigar tobacco leaves during fermentation.

Key words：cigar tobacco leaves; initial moisture content; aroma components; metagenomic analysis

雪茄煙葉發(fā)酵是微生物利用煙葉本身的營養(yǎng)物質(zhì)在適宜條件下進(jìn)行生長、代謝、轉(zhuǎn)化的過程[1-2]。煙葉含水率是發(fā)酵過程內(nèi)在的生理基礎(chǔ)[3]。雪茄煙葉晾制完成后含水率較低（10%～16%）[4]，不能有效滿足微生物發(fā)酵對水分的要求[5]，從而導(dǎo)致煙葉發(fā)酵過程緩慢、發(fā)酵周期延長。孫建鋒[6]的研究顯示，煙葉工業(yè)醇化過程中含水率為13%，其醇化周期長達(dá)1～3 a。但是，煙葉水分含量過高也會使雪茄煙葉顏色變深[7]，甚至霉變[8]。雪茄發(fā)酵溫度的變化與其含水率也密切相關(guān)[9]，含水率過高會使煙葉快速升溫，發(fā)酵不均；含水率過低，煙葉升溫緩慢，發(fā)酵時間增加[10]。因此，適宜的含水率是雪茄煙葉發(fā)酵香氣產(chǎn)量的前提條件。

目前，國內(nèi)對于雪茄煙發(fā)酵的研究主要集中在煙葉發(fā)酵過程中成分的變化[11-12]、添加不同物料和微生物[13-15]對煙葉品質(zhì)的影響等方面。郭文龍等[16]通過煙葉顏色變化來判斷品質(zhì)的優(yōu)劣，發(fā)現(xiàn)多酚物質(zhì)轉(zhuǎn)化對煙葉顏色變化有直接影響；鄭霖霖等[17]通過添加植酸酶、纖維素酶、果膠酶和中性蛋白酶提高了煙葉的總糖和氨基酸含量，降低了煙葉的蛋白質(zhì)含量，提高了煙葉感官品質(zhì)；張曉瑞等[18]在煙葉發(fā)酵過程中添加淀粉降解菌，有效降低了煙葉的淀粉含量，增加了香氣。

宏基因組（Metagenomics）測序技術(shù)是利用新一代高通量測序技術(shù)（NGS）以特定環(huán)境下微生物群體基因組為研究對象，在分析微生物多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究微生物群體功能活性、相互協(xié)作關(guān)系及與環(huán)境之間的關(guān)系，發(fā)掘潛在生物學(xué)意義的一種新方法。與傳統(tǒng)微生物研究方法相比，宏基因組測序技術(shù)規(guī)避了絕大部分微生物不能培養(yǎng)、痕量菌無法檢測的缺點，因此近年來在環(huán)境微生物學(xué)研究中得到了廣泛應(yīng)用[19-23]。在煙草發(fā)酵方面，王文婷等[24]利用宏基因組學(xué)技術(shù)分析了霍氏腸桿菌F8-1（Enterobacter hormaechei F8-1）發(fā)酵煙葉期間表面微生物的動態(tài)變化。然而該技術(shù)在雪茄煙發(fā)酵過程中的應(yīng)用研究尚未見報道。

試驗以雪茄CX-14煙葉為材料，研究了初始含水率對雪茄煙葉發(fā)酵產(chǎn)香的影響，并通過宏基因組測序技術(shù)明確了雪茄煙葉發(fā)酵過程中菌群結(jié)構(gòu)及功能基因的變化，分析了優(yōu)勢菌屬在發(fā)酵過程中的貢獻(xiàn)度，探明了菌群演替與雪茄煙葉香氣產(chǎn)量變化的相關(guān)規(guī)律。該研究結(jié)果可為雪茄發(fā)酵過程中的精準(zhǔn)化操作提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試煙葉為雪茄CX-14煙葉，由湖北省煙草科學(xué)研究院提供。主要試劑為洗滌緩沖液，配方為：Tris-HCl 15.8 g/L，EDTA-Na2 18.6 g/L，聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）20.0 g/L，NaCl 81.9 g/L，Tween-20 1.0 g/L，pH值8.0。

1.2 試驗方法

1.2.1 雪茄煙葉發(fā)酵方法 雪茄煙葉采用箱式發(fā)酵，每箱煙葉40 kg，使用稱重加濕回潮法對煙葉進(jìn)行回潮，煙葉含水率分別回潮至30%、34%、38%，分別記為T1、T2、T3處理。將發(fā)酵箱置于發(fā)酵房內(nèi)，室內(nèi)溫度控制在28～30℃，相對濕度控制在75%～80%，發(fā)酵周期為30 d。

1.2.2 煙葉中揮發(fā)性香氣成分的測定 發(fā)酵結(jié)束后的煙葉去除主脈烘干粉碎后過60目篩，稱取10 g煙末，使用同時蒸餾萃取裝置提取煙葉中的香氣成分。干燥過濾后進(jìn)行GC-MS分析。GC-MS檢測條件如下。色譜柱：HP-5MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：40℃保持2 min，以2℃/min升至200℃，保持5 min，然后10℃/min升至280℃；載氣（He）流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL；分流比：10∶1；采用電子轟擊離子源；電子能量：70 eV；傳輸線溫度：250℃；離子源溫度：230℃；質(zhì)量掃描范圍：35～550" m/z。目標(biāo)化合物的峰識別以美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（NIST）數(shù)據(jù)庫為準(zhǔn)。

1.2.3 宏基因組樣品預(yù)處理 取10 g煙葉剪碎，置入100 mL洗滌緩沖液中超聲30 min，過濾，將濾液以10 000 r/min的速度離心10 min，棄上清液保留沉淀，重復(fù)操作至上清液幾乎無色。放入液氮罐中冷凍30 s后迅速轉(zhuǎn)入－80℃保存。取34%含水率組發(fā)酵前后的雪茄煙葉作樣品，發(fā)酵前記為HEQ，發(fā)酵后記為HE。

1.2.4 煙葉宏基因提取 采用NEXTFLEX? Rapid DNA-Seq Kit試劑盒提取煙葉宏基因，操作按說明書進(jìn)行。

1.2.5 宏基因測序結(jié)果分析 PE文庫構(gòu)建、基因組測序、序列質(zhì)控與組裝、基因預(yù)測與非冗余基因集構(gòu)建等由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成[25-26]。使用美吉云平臺的在線工具進(jìn)行物種與功能注釋及物種貢獻(xiàn)度分析[27-28]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)為3組平行試驗的均值，采用SPSS 26軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Origin 2019b軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同含水率組發(fā)酵前后香氣含量變化

煙葉內(nèi)的香氣物質(zhì)含量是煙型、吃味形成的重要影響因素[29]。對比T1（含水率30%）、T2（含水率34%）、T3（含水率38%）處理雪茄煙葉發(fā)酵前后的香氣含量，結(jié)果如圖1所示。

苯丙氨酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)物是煙葉香氣成分的重要組成部分，其作用主要是突出煙葉中的花香，協(xié)調(diào)煙葉香氣，使雪茄更具自然風(fēng)格[30]。T1、T2及T3處

理的雪茄煙葉發(fā)酵后苯丙氨酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)物含量分別為11.9、16.3和12.0 μg/g，較發(fā)酵前（9.2 μg/g）分別提高了29.3%、77.2%與30.4%，T2處理的雪茄煙葉發(fā)酵后苯丙氨酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)物含量分別較T1、T3處理提高了37.0%、35.8%。

類胡蘿卜素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物如β-大馬酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯、巨豆三烯酮等可以消除煙葉刺激性，增加果香、花香、木香等，是反映煙葉香氣品質(zhì)的關(guān)鍵成分[31-32]。T1、T2及T3處理雪茄煙葉發(fā)酵后類胡蘿卜素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物含量分別為55.4、126.1和58.6 μg/g，較發(fā)酵前（47.4 μg/g）分別提高了16.9%、167.1%和23.6%，T2處理雪茄煙葉發(fā)酵后類胡蘿卜素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物含量分別較T1、T3處理提高了127.6%、115.2%。

西柏烷類轉(zhuǎn)化產(chǎn)物可使煙氣更加柔和，余味更加醇和[32]。T1、T2及T3處理雪茄煙葉發(fā)酵后西柏烷類降解產(chǎn)物含量分別為25.4、28.3和27.2 μg/g，較發(fā)酵前（22.0 μg/g）分別提高了15.5%、28.6%和23.6%，T2處理雪茄煙葉發(fā)酵后西柏烷類降解產(chǎn)物含量分別較T1、T3處理提高了11.4%、4.0%。

棕色化反應(yīng)產(chǎn)物可增加煙草香氣，改善煙葉品質(zhì)[33]。T1、T2及T3處理雪茄煙葉發(fā)酵后棕色化反應(yīng)產(chǎn)物含量分別為11.7、14.7和18.2 μg/g，較發(fā)酵前（9.7 μg/g）分別提高了20.6%、51.5%和87.6%，T3處理雪茄煙葉發(fā)酵后棕色化反應(yīng)產(chǎn)物含量分別較T1、T2處理提高了55.6%、23.8%。

從香氣總量來看，T1、T2和T3處理雪茄煙葉發(fā)酵后的香氣總量均有較大幅度地升高，分別達(dá)847.8、1 073.7和882.0 μg/g，比發(fā)酵前（398.7 μg/g）分別提高了112.6%、169.3%和121.2%，T2處理雪茄煙葉發(fā)酵后的香氣總量分別較T1、T3處理提高了26.6%、21.7%。這表明發(fā)酵前將雪茄煙葉含水率回潮至34%，發(fā)酵效果較好，煙葉內(nèi)整體香氣物質(zhì)含量明顯提升。

2.2 34%含水率組雪茄煙葉發(fā)酵前后的NR物種注釋

NR數(shù)據(jù)庫（非冗余蛋白質(zhì)氨基酸序列庫）比對結(jié)果（圖2）顯示，在域水平上，34%含水率組雪茄煙葉發(fā)酵前細(xì)菌的相對豐度為84.25%，發(fā)酵后升至99.09%，而真菌的相對豐度從發(fā)酵前的15.68%降至發(fā)酵后的0.76%，表明雪茄煙葉發(fā)酵過程中承擔(dān)煙草香氣風(fēng)味及香味物質(zhì)生成的主要是細(xì)菌。

由圖3可知，在屬水平上，葡萄球菌屬（Staphylococcus）是雪茄煙葉表面的優(yōu)勢屬，發(fā)酵前后均具有優(yōu)勢地位，發(fā)酵后豐度占比高達(dá)87.80%；曲霉（Aspergillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、甲基桿菌屬（Methylobacterium）、煙草屬菌（Nicotiana）在發(fā)酵前期的相對豐度占比總和達(dá)22.13%，其豐度占比總和在發(fā)酵后期降至3.18%。這表明葡萄球菌屬對煙草表面大多數(shù)菌屬存在競爭行為。

由圖4可知，在種水平上，34%含水率組雪茄煙葉發(fā)酵前期微生物多達(dá)11 573種，發(fā)酵后期降至6 754種，其中發(fā)酵前有5 571個獨有種，發(fā)酵后只有752個獨有種，表明34%含水率組雪茄煙葉在發(fā)酵過程中存在菌種多樣性降低的現(xiàn)象。由圖5可知，

發(fā)酵前后煙葉表面主要優(yōu)勢菌種為尼泊爾葡萄球菌（Staphylococcus nepalensis）、木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）、腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）、冠突曲霉（Aspergillus cristatus），其中尼泊爾葡萄球菌、木糖葡萄球菌和腐生葡萄球菌均屬于葡萄球菌屬，且尼泊爾葡萄球菌在發(fā)酵后豐度占比高達(dá)66.28%，為煙葉中的絕對優(yōu)勢種，與屬水平結(jié)果一致。

2.3 34%含水率組雪茄煙葉發(fā)酵前后的菌屬及功能差異分析

對34%含水率組發(fā)酵前后相對豐度前15的菌群及功能進(jìn)行差異分析，結(jié)果如圖6所示，鞘氨醇單胞菌屬、甲基桿菌屬的豐度占比從3.9%、3.1%均下降到0.1%；而羅爾斯頓氏菌屬（Ralstonia）和擬分枝桿菌屬（Mycobacteroides）的豐度占比從不足0.3%分別增加到2.0%和0.5%，其中葡萄球菌屬豐度占比從57.7%增長到87.8%，遠(yuǎn)高于其他菌屬。

另外，相對豐度排前15位的功能通路在發(fā)酵后均有不同程度地提升，其中糖酵解/糖異生途徑提升明顯，氨基酸生物合成、丙酮酸代謝及肽聚糖生物合成也有較大增幅，說明34%的含水率有利于煙葉表面菌群的生長發(fā)育繁殖。菌種數(shù)量大幅提升的同時，由于葡萄球菌屬在煙葉表面具有絕對優(yōu)勢，且對大多菌群存在競爭行為，導(dǎo)致發(fā)酵后期菌群多樣性降低。

2.4 34%含水率組雪茄煙葉發(fā)酵前后的菌屬與KEGG功能貢獻(xiàn)度變化

將34%含水率組發(fā)酵前后體系中相對豐度排前15的菌屬與發(fā)酵代謝功能貢獻(xiàn)度進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果如圖7所示，發(fā)酵前葡萄球菌屬、假單胞菌、鞘氨醇單胞菌、曲霉及甲基桿菌屬對代謝功能均有不同程度的貢獻(xiàn)，而葡萄球菌屬的功能貢獻(xiàn)度最高。發(fā)酵后由于物種多樣性降低，葡萄球菌屬功能貢獻(xiàn)度進(jìn)一步提升，均超過了85%。其中，假單胞菌屬對雙組分系統(tǒng)也有明顯的功能貢獻(xiàn)度，發(fā)酵前、后的貢獻(xiàn)度分別為5.96%、3.24%，說明假單胞菌屬也能較好地適應(yīng)發(fā)酵過程中雪茄煙葉內(nèi)部環(huán)境變化，充分利用各種物質(zhì)來維持自身生存。

2.5 34%含水率組雪茄煙葉發(fā)酵前后的菌群與煙葉香型相關(guān)性分析

為了明確微生物物種與雪茄煙葉中揮發(fā)性香氣之間的相關(guān)關(guān)系，分析了菌屬與煙葉香型的相關(guān)性，將雪茄煙葉中揮發(fā)性香氣成分苯丙氨酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)物、類胡蘿卜素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物、西柏烷類轉(zhuǎn)化產(chǎn)物及棕色化反應(yīng)產(chǎn)物分別記為B、L、X和Z（圖8），在相對豐度占比前20的物種中，葡萄球菌屬、羅爾斯頓氏菌屬和分枝桿菌屬均與B、L、X及Z呈現(xiàn)正相關(guān)，對雪茄煙葉呈香有重要影響；其中，L節(jié)點在4種揮發(fā)性香氣中最大，表明類胡蘿卜素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物是煙葉香型的主要呈現(xiàn)者；而且葡萄球菌菌屬在香型節(jié)點最突出，表明其對雪茄煙葉香型呈現(xiàn)貢獻(xiàn)最大。

3 結(jié) 論

雪茄煙葉在最適含水率（34%）條件下發(fā)酵，發(fā)酵后的苯丙氨酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)物、類胡蘿卜素降解產(chǎn)物、西柏烷類降解產(chǎn)物、棕色化反應(yīng)產(chǎn)物含量和香氣總量分別比發(fā)酵前提高了77.2%、167.1%、28.6%、51.5%和169.3%。香氣總量分別比30%和38%含水率組提高26.6%和21.7%。通過宏基因組學(xué)分析，發(fā)酵后葡萄球菌屬（Staphylococcus）豐度占比高達(dá)87.80%，是絕對優(yōu)勢菌屬。而且其對發(fā)酵過程中的次生代謝物生物合成、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、氨基酸生物合成等代謝過程的貢獻(xiàn)度超過了85%。經(jīng)發(fā)酵菌屬與煙葉香型相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)類胡蘿卜素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物是香型的主要呈現(xiàn)者，而且葡萄球菌菌屬在香型節(jié)點最突出，是呈現(xiàn)香型的最大貢獻(xiàn)者。研究結(jié)果表明：34%的煙葉初始含水率和葡萄球菌屬對雪茄煙葉發(fā)酵產(chǎn)香有顯著促進(jìn)作用，為中式雪茄發(fā)酵技術(shù)提供了重要參考。

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（責(zé)任編輯：成 平）