陳 奎,呂林雯,邢更妹,*

1.中國(guó)科學(xué)院 高能物理研究所,北京 100049;2.散裂中子源科學(xué)中心,廣東 東莞 523808

1 腫瘤靶向的硼中子俘獲治療

放射治療是腫瘤治療的三種經(jīng)典方法之一,尤其是近年快速發(fā)展高線性能量轉(zhuǎn)移(high linear energy transfer, high-LET)放射治療方法(重離子和中子俘獲治療),其細(xì)胞周期狀態(tài)依賴性小、輻射抗性產(chǎn)生比率相對(duì)較低等顯著優(yōu)勢(shì)[1-3],為化療和X射線放療等耐受的惡性腫瘤的治療提供了途徑。世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)發(fā)布的2020年全球最新癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示,2020年中國(guó)新發(fā)癌癥病例457萬(wàn)例,已經(jīng)成為“癌癥大國(guó)”。我國(guó)惡性腫瘤的5年相對(duì)生存率約為40.5%,與發(fā)達(dá)國(guó)家還有很大差距。重離子和中子俘獲治療等,具有提高惡性腫瘤治療效果的明顯優(yōu)勢(shì)。硼中子俘獲治療[4-5](也稱硼中子捕獲治療,boron neutron capture therapy, BNCT)是一種基于10B和熱中子相互作用的二元治療體系。非放射性同位素10B原子中子俘獲截面為3 835 b(1 b=10-28m2),高出機(jī)體其他元素3個(gè)數(shù)量級(jí)。10B吸收低能熱中子(<0.5 eV),發(fā)生核反應(yīng)(10B(n,α)7Li),產(chǎn)生α粒子(4He)和反沖的鋰原子核(7Li)。其中α粒子的穿透距離很短,只有4～9 μm,與細(xì)胞的直徑接近。因此,將10B選擇性遞送至腫瘤細(xì)胞俘獲熱中子,可以實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷,避免對(duì)鄰近正常細(xì)胞的損傷[6]。BNCT對(duì)腫瘤細(xì)胞的DNA的損傷是直接的、不易修復(fù)的,而且不依賴于細(xì)胞周期狀態(tài),因此,極大降低了輻射抗性的產(chǎn)生。BNCT不僅在一些中樞神經(jīng)系統(tǒng)的惡性腫瘤和額面部腫瘤治療中已經(jīng)取得顯著療效,同時(shí)對(duì)一些解剖結(jié)構(gòu)特殊且難治的實(shí)體瘤也顯示了非常好的療效(如生殖器腫瘤)[7-9]。

理想的BNCT治療,是實(shí)現(xiàn)單個(gè)腫瘤細(xì)胞的精確殺傷,而不損傷正常細(xì)胞,這與傳統(tǒng)放療和化療的治療邏輯有所不同[10-11]。最大化的實(shí)現(xiàn)BNCT的物理-生物-治療效應(yīng),需要10B化合物選擇性地積累在腫瘤細(xì)胞達(dá)到足夠高的蓄積濃度(質(zhì)量分?jǐn)?shù)>20×10-6)。同時(shí),在正常臟器和組織中的蓄積較少(腫瘤和正常組織的硼濃度比值(T/N)>3,腫瘤與血液的硼濃度比值(T/B)>3)。由此可見(jiàn),硼藥在腫瘤中的特異性靶向蓄積是實(shí)現(xiàn)腫瘤BNCT治療目標(biāo)的關(guān)鍵。

腫瘤靶向治療(藥物的靶向遞送和腫瘤的靶點(diǎn)治療),一直是腫瘤藥物的研發(fā)熱點(diǎn)。這些靶點(diǎn)本質(zhì)上是調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生發(fā)展的特異性分子位點(diǎn)(如信號(hào)通路的活化、免疫環(huán)境的調(diào)整等)[12]。目前BNCT硼藥的腫瘤靶向遞送研究主要聚焦于腫瘤細(xì)胞表面特異性/差異性表達(dá)受體介導(dǎo)的選擇性識(shí)別、靶向和富集。本文在此重點(diǎn)總結(jié)硼藥研發(fā)過(guò)程中,腫瘤靶點(diǎn)和遞送方法的選擇和挑戰(zhàn),及其改進(jìn)策略和方案。

2 小分子硼藥的腫瘤靶向選擇及改進(jìn)方案

2.1 以L型氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(LAT)為靶點(diǎn)的類氨基酸硼藥

L型氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(L-type amino transporters, LAT)是一種與Na+和pH值無(wú)關(guān)的異二聚體氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[13]。它優(yōu)先轉(zhuǎn)運(yùn)大支鏈和芳香族中性氨基酸進(jìn)入增殖細(xì)胞。包括LAT1、LAT2、LAT3、LAT4四種亞型,其中LAT1在多種人類腫瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá),與腫瘤細(xì)胞快速增殖需要大量吸收和重吸收氨基酸有關(guān),也與腫瘤分期、腫瘤組織血管生成及腫瘤患者的預(yù)后等病理進(jìn)程密切相關(guān)[13]。此外,作為跨越血腦屏障(blood-brain barrier, BBB)的氨基酸的主要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,LAT1對(duì)氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn),也是保證正常大腦完成其生理功能所必須的[14]。因此,許多需要進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥物設(shè)計(jì)與LAT1的內(nèi)源性底物具有高度結(jié)構(gòu)相似性,通過(guò)降解修飾由LAT1轉(zhuǎn)運(yùn)入腦[15]。

1) 以LAT1為靶點(diǎn)的首個(gè)臨床硼藥:BPA

2020年5月,日本厚生省批準(zhǔn)了首個(gè)用于BNCT臨床治療的硼藥——硼法倫(Borofalan [10B],“Steboronine?”)。它的主要成分為(L)-4-二羥基硼基苯丙氨酸(boronophenylalanine, BPA),是中性氨基酸苯丙氨酸的衍生物。BPA依賴LAT1選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞[15],參與特定蛋白質(zhì)的合成[16]。由于其結(jié)構(gòu)與酪氨酸(Tyr)類似,可以作為酪氨酸酶的底物,通過(guò)黑色素代謝途徑合成大分子,因此BPA-BNCT首先被用于治療皮膚黑色素瘤[17]。此外,由于BPA可以通過(guò)LAT1穿過(guò)BBB[18],也被廣泛用于頭頸部惡性腫瘤的BNCT。

但是,LAT1具有雙向轉(zhuǎn)運(yùn)能力,為維持細(xì)胞的生理需要和平衡,也會(huì)將細(xì)胞內(nèi)BPA與細(xì)胞外氨基酸交換,導(dǎo)致BPA的外排[19]。然而,BNCT通常需要30～60 min的熱中子照射,BPA在腫瘤細(xì)胞內(nèi)濃度的持續(xù)降低,影響治療效果[20]。因此硼法倫在BNCT臨床治療中,采用了持續(xù)靜脈滴注給藥以維持較高的瘤內(nèi)硼濃度[21]。但這也增加了BNCT的潛在風(fēng)險(xiǎn),同時(shí)影響治療效果。

為此,日本學(xué)者Nomoto等[22]構(gòu)建合成了聚乙烯醇(PVA)與BPA的硼酸酯復(fù)合物(PVA-BPA復(fù)合物)(圖1)。當(dāng)通過(guò)LAT1轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入腫瘤細(xì)胞,該復(fù)合物可以在細(xì)胞內(nèi)體/溶酶體中積累,降低胞質(zhì)中BPA的含量,減緩LAT1介導(dǎo)的BPA外排,實(shí)現(xiàn)在皮下腫瘤中較長(zhǎng)時(shí)間滯留,提升了BNCT的治療效果。以此為基礎(chǔ),他們進(jìn)一步構(gòu)建了BPA和果糖修飾聚乙二醇-聚(L-賴氨酸)——PEG-P[Lys/Lys(fructose)]-BPA復(fù)合物[23],該復(fù)合物可以通過(guò)LAT1轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入腫瘤細(xì)胞,同時(shí)抑制LAT1介導(dǎo)的BPA外排。此外,該復(fù)合結(jié)構(gòu)的陽(yáng)離子骨架結(jié)果促進(jìn)其腎臟清除效率,增加了在模型鼠中分布的T/B和T/N比。 通過(guò)BNCT實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步證實(shí)了聚合物-BPA策略的有效性。

(a)——BPA的分子結(jié)構(gòu)(白色、灰色、紅色、藍(lán)色和粉色原子分別為H、C、O、N和B);(b)——BPA通過(guò)LAT1細(xì)胞內(nèi)化,LAT1將細(xì)胞外BPA轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)細(xì)胞并外排包括谷氨酰胺在內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)底物;(c)——細(xì)胞內(nèi)BPA的外排,當(dāng)細(xì)胞外BPA濃度降低時(shí),細(xì)胞內(nèi)BPA可以與包括酪氨酸在內(nèi)的細(xì)胞外底物交換;(d)——PVA和PVA-BPA的化學(xué)結(jié)構(gòu),PVA-BPA的形成不涉及BPA中的苯丙氨酸結(jié)構(gòu),這對(duì)LAT1的識(shí)別至關(guān)重要;(e)——PVA-BPA的內(nèi)化途徑,PVA-BPA與LAT1相互作用,然后通過(guò)內(nèi)吞作用內(nèi)化圖1 BPA細(xì)胞攝入和外排示意圖[22]Fig.1 Scheme of cell uptake and exertion of BPA[22]

(a)——FBY、Tyr和BPA的化學(xué)結(jié)構(gòu)和分子靜電勢(shì)圖像(藍(lán)色表示正電荷的分布,紅色表示負(fù)電荷的分布);(b)——LAT1和FBY(黃色)/Tyr(綠色)/BPA(粉色)復(fù)合物的預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu);LAT1(灰色)為實(shí)心帶狀表示,配體和LAT1之間的氫鍵(涉及殘基Trp202、Ser26、Gly27、Ile205和Ile23)顯示為天空藍(lán)色虛線,已知其高度保守圖2 計(jì)算研究表明FBY與酪氨酸(Tyr)和BPA之間存在高度相似性[25]Fig.2 Computational studies show a high degree of similarity between FBY and tyrosine(Tyr) and BPA[25]

2) 以LAT為靶點(diǎn)的其他含硼類氨基酸化合物

3) 以LAT為靶點(diǎn)的巰基十一氫十二烷基鈉(BSH)

巰基十一氫十二烷基鈉(sodium mercaptoundecahydro-closo-dodecaborate, Na2B12H11SH, BSH),是一種富含硼原子的多面體硼烷結(jié)構(gòu),具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性和生物相容性[26]。BSH能夠穿過(guò)BBB,富集在腦腫瘤部位,也已經(jīng)被用于臨床腦腫瘤的BNCT治療研究。然而,由于BSH無(wú)法進(jìn)入腫瘤細(xì)胞,BSH的腫瘤靶向性一直備受質(zhì)疑,也使利用BSH的腫瘤細(xì)胞精準(zhǔn)BNCT難以實(shí)現(xiàn)[27]。

Futamura等[28]將1-氨基-3-氟環(huán)丁烷-1-羧酸(ACBC),一種非天然的α氨基酸連接到BSH上,實(shí)現(xiàn)了LAT介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞的特異性靶向性。進(jìn)一步用18F標(biāo)記ACBC(18F-ACBC),監(jiān)測(cè)硼藥代謝和生物分布。對(duì)F98大鼠腦膠質(zhì)瘤模型治療研究顯示,ACBC-BSH處理后BNCT鼠的中位生存時(shí)間為(44.3±0.8) d,明顯優(yōu)于BSH((37.4±2.6) d)。

2.2 基于細(xì)胞穿膜肽的BSH靶向選擇

細(xì)胞穿膜肽(cell-penetrating peptides, CPPs),又稱蛋白質(zhì)/多肽轉(zhuǎn)導(dǎo)域,是一類以非受體依賴方式、非經(jīng)典內(nèi)吞直接穿過(guò)細(xì)胞膜、進(jìn)入細(xì)胞的多肽分子,它們的長(zhǎng)度一般不超過(guò)30個(gè)氨基酸且富含堿性氨基酸,常帶有正電荷。2014年,Michiue等[29]將BSH連接到多種CPPs(包括HIV-TAT和多聚精氨酸等)上,分別和腦膠質(zhì)瘤U87MG細(xì)胞共孵育,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中硼蓄積具有時(shí)間和濃度依賴性,隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng),BSH可以更多地進(jìn)入細(xì)胞核,有利于增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效果,提高BNCT療效。他們還篩選出了一種含8個(gè)BSH結(jié)構(gòu)和聚11精氨酸結(jié)構(gòu)的含硼化合物(8BSH-11R),硼含量達(dá)20.1 ppm(1 ppm=1×10-6)。給藥24 h后, BSH高濃度的蓄積在細(xì)胞核中。以10 mmol/L 8BSH-11R處理U87MG細(xì)胞,細(xì)胞中10B含量達(dá)到了5 623.7 ng/106細(xì)胞。更重要的是,8BSH-11R的BNCT細(xì)胞殺傷率比BSH提高了100倍以上。該團(tuán)隊(duì)后續(xù)進(jìn)一步優(yōu)化BSH-CPPs結(jié)構(gòu),構(gòu)建了單個(gè)BSH偶聯(lián)3聚精氨酸的BSH-Tmr-3R結(jié)構(gòu),不僅增加了腦膠質(zhì)瘤腫瘤細(xì)胞攝取,在腦膠質(zhì)瘤荷瘤鼠模型上實(shí)現(xiàn)了腫瘤靶向和瘤內(nèi)的均勻分布[30]。將1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)偶聯(lián)到BSH-Tmr-3R上,標(biāo)記放射性核素64Cu,進(jìn)行PET成像,實(shí)現(xiàn)了對(duì)BNCT過(guò)程中的硼濃度變化的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。注射后6 h和24 h,T/N比值分別達(dá)到15.5和8.2,T/B比值分別為2.8和1.9。

3 納米硼攜帶劑的腫瘤靶向選擇

在以小分子硼化合物為基礎(chǔ)的BNCT硼藥靶向遞送研究不斷推進(jìn)的同時(shí),含硼大分子及含硼納米藥物等的設(shè)計(jì)構(gòu)建也取得了進(jìn)展,其中含硼納米顆粒能夠通過(guò)被動(dòng)靶向進(jìn)入腫瘤組織,利用修飾靶向分子再主動(dòng)靶向腫瘤細(xì)胞表面受體,完成細(xì)胞內(nèi)亞定位,成為BNCT新型硼藥的研究熱點(diǎn)。

3.1 腫瘤EPR效應(yīng)介導(dǎo)被動(dòng)靶向

EPR效應(yīng)是指,由于腫瘤部位血管結(jié)構(gòu)的異常,淋巴回流缺乏,導(dǎo)致大分子藥物和納米顆粒在腫瘤部位具有高滲透性和滯留性現(xiàn)象。EPR效應(yīng)自1986年提出以來(lái),成為無(wú)靶向因子的大分子及納米藥物實(shí)現(xiàn)腫瘤部位選擇性蓄積的重要機(jī)制。也成為構(gòu)建納米載藥體系,實(shí)現(xiàn)藥物腫瘤靶向遞送的前提條件之一。

劉志博團(tuán)隊(duì)[31]合成了一種甲氧基-聚乙二醇-聚乙丙交酯的膠束載帶硼化卟啉,形成了硼化卟啉復(fù)合物(BPN),BPN依賴EPR效應(yīng)在腫瘤組織富集(圖3(a))。本課題組[32]構(gòu)建了一種基于鋯(Zr)和四羧基苯基卟啉(TCPP)的金屬有機(jī)框架結(jié)構(gòu)、通過(guò)主客體反應(yīng)負(fù)載10B的硼酸(圖3(b))。利用EPR效應(yīng)靶向遞送到腦膠質(zhì)瘤中,實(shí)現(xiàn)了體內(nèi)腦膠質(zhì)瘤的高硼蓄積(硼質(zhì)量分?jǐn)?shù)>60 ppm(1 ppm=1×10-6)),具有一定的BNCT應(yīng)用前景。當(dāng)然,這類含卟啉結(jié)構(gòu)的納米藥物的靶向是否完全屬于EPR仍然存在爭(zhēng)議,也有人認(rèn)為卟啉分子可以靶向低密度脂蛋白受體(LDL receptor)來(lái)介導(dǎo)納米藥物的腫瘤靶向遞送[33]。

(a)——甲氧基-聚乙二醇-聚乙丙交酯膠束,載帶硼化卟啉[31];(b)——TCPP和鋯組裝的金屬有機(jī)框架通過(guò)主客體反應(yīng)負(fù)載硼酸形成共結(jié)晶,用于腦膠質(zhì)瘤的BNCT和PET成像[32]圖3 含硼膠束[31]和含硼共晶示意圖[32] Fig.3 Scheme of boron-containing micelles[31] and boron-containing co-crystal[32]

Sumitani等[34]合成了聚乙二醇嵌段聚乳酸(PEG-b-PLA)多聚物,核心交聯(lián)碳硼烷形成的含硼膠束也可通過(guò)EPR效應(yīng),實(shí)現(xiàn)在腫瘤區(qū)域的選擇性聚集。文獻(xiàn)[35]用苯乙烯-順丁烯結(jié)合葡萄糖胺形成的多聚物,與硼酸形成穩(wěn)定且水溶性良好的配合物,這種納米復(fù)合體也能夠通過(guò)EPR效應(yīng),在腫瘤組織中達(dá)到十倍于正常組織的硼含量——注射24 h后腫瘤組織中10B質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為24×10-6,同時(shí)這種納米復(fù)合體在偏酸性的腫瘤微環(huán)境和腫瘤細(xì)胞內(nèi)涵體中,可控釋放硼酸阻礙腫瘤細(xì)胞糖酵解,協(xié)同BNCT抑制腫瘤生長(zhǎng),為BNCT硼藥研發(fā)提供了新的思路。

3.2 識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面受體的主動(dòng)靶向

由于BNCT療效對(duì)腫瘤組織中硼濃度的依賴性,納米藥物除了利用EPR效應(yīng)被動(dòng)靶向腫瘤組織,還因其較大的比表面積,可通過(guò)連接靶向分子識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面的受體,更高效介導(dǎo)含10B的載藥體系進(jìn)入腫瘤細(xì)胞,提高全身給藥后的T/N比,降低毒副作用,改善BNCT的療效[36-37]。

1) 利用葉酸受體介導(dǎo)靶向腫瘤細(xì)胞

葉酸受體在多種腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá),已經(jīng)成為一種重要的腫瘤治療靶向分子。葉酸受體與配體葉酸的結(jié)合常數(shù)較高(Kd=10-10mol/L),且具有較好的可修飾性,可以連接多種治療藥物。構(gòu)建葉酸修飾的納米藥物/納米遞送系統(tǒng),可以實(shí)現(xiàn)葉酸受體介導(dǎo)的腫瘤靶向給藥[38]。

Ciofani等[39]合成了氮化硼納米管(BNNTs)硼攜帶劑(圖4)。首先通過(guò)包覆聚-L-賴氨酸(PLL)使其表面暴露氨基基團(tuán),然后再與葉酸的羧酸基團(tuán)相連接,修飾熒光量子點(diǎn),最終得到功能化BNNTs。這種氮化硼納米管載藥系統(tǒng)被證明,能夠被多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞選擇性攝取,自身帶有的熒光也可在未來(lái)BNCT治療實(shí)驗(yàn)中,進(jìn)行體內(nèi)示蹤以配合中子照射。

葉酸作為配體修飾氮化硼納米管,靶向腫瘤細(xì)胞表面葉酸受體,完成硼藥的腫瘤靶向遞送[39] 圖4 葉酸修飾納米顆粒作為靶向策略[39]Fig.4 Functionalization with folic acid for nanoparticles as targeting strategy[39]

除了BNNTs外,Mandal等[40]利用金納米顆粒,將異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的10B-多聚烯丙胺鹽酸鹽(10B-FITC-PAH)和硼化聚苯乙烯磺酸鈉(10B-PSS)交替包覆在金納米顆粒表面,形成多層聚電解質(zhì)外層。為了避免納米顆粒的聚集,以一層PSS和一層PAH進(jìn)行封裝,最后利用靜電相互作用將葉酸分子修飾在顆粒表面,得到功能化金納米顆粒載硼系統(tǒng),這種系統(tǒng)可以被多種腫瘤細(xì)胞攝取。

2) 利用轉(zhuǎn)鐵蛋白受體介導(dǎo)靶向腫瘤細(xì)胞

轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin, Tf)是一種廣泛存在的糖蛋白,能夠?qū)⒀褐械蔫F通過(guò)細(xì)胞表面轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞[41],而TfR在惡性細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),且顯示出和細(xì)胞惡性增殖及腫瘤發(fā)生發(fā)展具有一定相關(guān)性,因此TfR成為一種有潛力的腫瘤靶向治療的靶點(diǎn)[42]。

文獻(xiàn)[43]設(shè)計(jì)合成了一種包封BSH的勻質(zhì)后的脂質(zhì)體,活化其表面的羧基后使其和轉(zhuǎn)鐵蛋白表面的氨基相連,得到直徑小于200 nm的納米硼攜帶劑,由于其表面的PEG基團(tuán),延長(zhǎng)了該攜帶劑的血液循環(huán)時(shí)間,通過(guò)轉(zhuǎn)鐵蛋白介導(dǎo)的靶向能力,使10B在腫瘤組織富集,注射3 d后濃度仍超過(guò)30 ppm,與其他對(duì)照組相比,中子照射后荷瘤模型小鼠,明顯抑制了腫瘤生長(zhǎng),小鼠生存率顯著延長(zhǎng)。Doi等[44]同樣也合成了類似的含硼脂質(zhì)體,腦膠質(zhì)瘤小鼠模型靜脈注射24 h后,腫瘤組織中的硼濃度達(dá)到了20 ppm,中子照射后也顯著延長(zhǎng)了小鼠的生存率。這些結(jié)果表明,靶向TfR的含10B脂質(zhì)體可以提高腫瘤組織中的硼蓄積,有望進(jìn)一步應(yīng)用于BNCT提高療效。

在BNNTs修飾葉酸配體的研究的基礎(chǔ)上,Ciofani團(tuán)隊(duì)[45]也嘗試依賴轉(zhuǎn)鐵蛋白靶向給藥的策略。他們首先在硝酸的強(qiáng)氧化作用下,在BNNTs表面引入羥基,通過(guò)硅烷化使BNNTs表面攜帶氨基,和轉(zhuǎn)鐵蛋白相連,得到主動(dòng)靶向的BNNTs硼遞送系統(tǒng),體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示了腫瘤細(xì)胞對(duì)這種BNNTs的高攝取,說(shuō)明轉(zhuǎn)鐵蛋白的修飾賦予了硼遞送系統(tǒng)腫瘤特異性靶向能力。

3) 利用表皮生長(zhǎng)因子受體介導(dǎo)靶向腫瘤細(xì)胞

表皮生長(zhǎng)因子(EGF)受體EGFR是一種存在于細(xì)胞表面,在多種腫瘤細(xì)胞表面過(guò)表達(dá)或突變后發(fā)生超活化的蛋白,因此EGFR已經(jīng)成為一種重要的腫瘤治療及藥物遞送靶點(diǎn)[46]。

為了硼藥的腫瘤靶向遞送,Kullberg團(tuán)隊(duì)[47]嘗試?yán)肊GF作為靶向分子,他們首先利用EGF末端的氨基,在Traut’s試劑(2-iminothiolane)的存在下,連接一個(gè)硫醇基團(tuán),后者可以和馬來(lái)酰亞胺-PEG-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)相連,使得EGF橋連在一個(gè)脂質(zhì)分子上,脂質(zhì)分子通過(guò)干燥和水化過(guò)程形成膠束后,和載帶了硼藥的脂質(zhì)體混合得到具有EGF靶向配體修飾的載硼脂質(zhì)體,成為具有有效腫瘤靶向性的納米硼藥(圖5)。

圖5 通過(guò)將EGF修飾和膠束與載硼脂質(zhì)體混合,得到具有靶向腫瘤細(xì)胞表面EGFR能力的含硼脂質(zhì)體[47]Fig.5 Boron-loading liposomes, obtained via hybriding EGF-conjugated micelles with boron-containing liposomes, targeting EGFR on tumor cell surface[47]

4) 利用單克隆抗體介導(dǎo)靶向腫瘤細(xì)胞

單克隆抗體(單抗)是指與特異抗原或表位具有高特異性(單特異性)結(jié)合能力的免疫球蛋白[48]。經(jīng)過(guò)數(shù)十年研究,單抗已在臨床診斷、治療包括癌癥、感染類疾病、免疫調(diào)節(jié)等方面得到了廣泛應(yīng)用[49]。在腫瘤治療中,單抗除了直接用于干擾腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、破壞細(xì)胞膜、阻斷免疫抑制通路,還作為靶向分子,修飾載體完成放療或化療藥物的腫瘤靶向遞送。

(1) 癌胚抗原(CEA)

癌胚抗原(CEA)是一種組織特異性蛋白,在多種腫瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá),并分布于細(xì)胞膜表面。針對(duì)CEA+的腫瘤研究表明,CEA體外致敏T細(xì)胞能夠在體內(nèi)產(chǎn)生CEA特異性免疫應(yīng)答,從而殺死腫瘤細(xì)胞,是一種非常有前途的腫瘤免疫治療靶點(diǎn)[50]。

以CEA為配體,構(gòu)建BNCT硼藥靶向給藥系統(tǒng)。Yanagie團(tuán)隊(duì)[51]首先由卵磷脂、膽固醇和3-(2-吡啶二硫)丙?；?二棕櫚酰基磷脂酰乙醇胺(DTP-DPPE)混合制備了多腔室脂質(zhì)體,在水化步驟中引入10B化合物(Cs210B12H11SH),得到表面有巰基的含硼脂質(zhì)體,再在交聯(lián)劑作用下與CEA單抗交聯(lián),得到能夠靶向腫瘤組織的含硼脂質(zhì)體。體外實(shí)驗(yàn)也顯示了其具有腫瘤細(xì)胞靶向硼遞送能力。

(2) 表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)

同前所述,EGFR蛋白在腫瘤細(xì)胞表面過(guò)表達(dá),也可用作腫瘤特異性靶向遞送的靶點(diǎn)。Pan等[52]利用特異性結(jié)合EGFR的西妥昔單抗,將其硫醇化后連接在由馬來(lái)酰亞胺-PEG-膽固醇分子形成的膠束表面,再與載硼脂質(zhì)體相混合,得到靶向富硼免疫脂質(zhì)體。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示出其具有了更高的被腫瘤細(xì)胞攝取的能力,可能成為一種潛在的有效硼遞送載體。

(3) 人表皮生長(zhǎng)因子受體(HER2)

與EGFR類似,HER2也是一種生長(zhǎng)因子受體跨膜蛋白,在惡性乳腺細(xì)胞中過(guò)表達(dá),且可能導(dǎo)致預(yù)后不良。過(guò)表達(dá)的HER2也可以作為腫瘤治療靶點(diǎn)之一,已經(jīng)有研究顯示人源化抗HER2單抗治療和化療結(jié)合能夠有效提高生存率[53]。嘗試將HER2單抗用于BNCT硼攜帶劑的構(gòu)建,可能成為一種極具潛力的BNCT硼藥靶向遞送策略。

Wu等[54]設(shè)計(jì)了功能化金納米顆粒,利用巰基和金納米顆粒的相互作用,將巰基化的硼烷和巰基修飾的HER2的單抗(61 IgG)同時(shí)沉積在金納米顆粒表面。在體外實(shí)驗(yàn)中,這些功能化金納米顆粒與無(wú)修飾的金納米顆粒相比,顯著提高了被腫瘤細(xì)胞攝取的能力。為實(shí)現(xiàn)體內(nèi)示蹤,研究者利用加成點(diǎn)擊反應(yīng),將123I標(biāo)記在金納米顆粒表面,在MicroSPECT/CT成像中顯示了優(yōu)異的體內(nèi)腫瘤組織的靶向成像。

5) 利用去唾液酸糖蛋白受體介導(dǎo)靶向腫瘤細(xì)胞

去唾液酸糖蛋白受體(ASGP-R)表達(dá)于肝癌細(xì)胞表面,而在正常肝細(xì)胞表面極少存在。ASGP-R對(duì)半乳糖等碳水化合物表現(xiàn)了較高的親和力,且能夠通過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞,進(jìn)入腫瘤細(xì)胞。以ASGP-R為靶點(diǎn)的納米載體已經(jīng)成為一種肝腫瘤靶向給藥策略[55]。Zhang等[55]設(shè)計(jì)構(gòu)建了一種表面修飾殼聚糖-乳糖酸-硫辛酸的中空介孔二氧化硅的復(fù)合納米材料,在酸性條件下,表面殼聚糖質(zhì)子化,介孔硅負(fù)載碳硼烷,當(dāng)環(huán)境溶液pH為中性時(shí),殼聚糖去質(zhì)子化,防止碳硼烷的泄露,表面修飾的乳糖酸使納米顆粒通過(guò)ASGP-R主動(dòng)靶向至肝癌細(xì)胞,在腫瘤細(xì)胞中較高的谷胱甘肽(GSH)和較低的pH雙重作用下,刺激釋放碳硼烷,后者吸收中子射線后破壞腫瘤細(xì)胞DNA,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,硫辛酸的釋放還減輕了BNCT產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)及ROS損傷,最終達(dá)到腫瘤治療并降低副作用的效果。

6) 利用唾液酸(SA)介導(dǎo)靶向腫瘤細(xì)胞

腫瘤細(xì)胞在發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,細(xì)胞表面糖基化關(guān)鍵改變之一是唾液酸顯著上調(diào),能夠直接影響免疫細(xì)胞及其與腫瘤細(xì)胞的相互作用,也影響腫瘤細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)移能力[56]。文獻(xiàn)[57]利用PBA與唾液酸的特異性結(jié)合能力,設(shè)計(jì)了一種苯硼酸-PEG-聚乳酸的嵌段共聚物分子,自組裝形成100 nm的聚合物納米顆粒(NanoPBA),相較于臨床硼攜帶劑BPA,依賴于氨基酸濃度梯度的雙向轉(zhuǎn)運(yùn),NanoPBA基于SA主動(dòng)運(yùn)輸,在體外實(shí)驗(yàn)中展現(xiàn)出了較高的腫瘤細(xì)胞攝取能力,盡管由于該納米顆粒的穩(wěn)定性欠佳,導(dǎo)致給藥后腫瘤組織硼蓄積量只有約1 ppm,但在中子照射后仍表現(xiàn)出了顯著的腫瘤抑制作用,這可能由于NanoPBA的細(xì)胞內(nèi)定位更靠近細(xì)胞核,提高了腫瘤細(xì)胞的DNA斷裂率。

3.3 腫瘤細(xì)胞核的主動(dòng)靶向

由于BNCT對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷是基于在細(xì)胞內(nèi)的10B吸收中子后產(chǎn)生的α粒子和7Li核,因此細(xì)胞內(nèi)的10B原子的分布離細(xì)胞核越近,越容易對(duì)核DNA造成損傷,從而更高效地殺死腫瘤細(xì)胞。

為了提高硼藥分布的細(xì)胞核趨向性,Chen等[58]巧妙地將阿霉素(DOX)與碳硼烷(CB)結(jié)合,并將其插入表面修飾有iRGD的陽(yáng)離子脂質(zhì)體中,同時(shí)負(fù)載CRISPR-Cas9系統(tǒng)來(lái)阻斷巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的CD47-SIRPα免疫監(jiān)視通路(圖6)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,這種脂質(zhì)體利用環(huán)狀多肽iRGD完成了腫瘤細(xì)胞的靶向遞送,進(jìn)入細(xì)胞后,載藥系統(tǒng)利用DOX的核易位性,將10B定位于細(xì)胞核,實(shí)現(xiàn)了更有效腫瘤細(xì)胞殺傷,同時(shí)內(nèi)部包載的質(zhì)粒激活了腫瘤免疫,進(jìn)一步阻止了腫瘤復(fù)發(fā),提高了小鼠的存活率,這種復(fù)合脂質(zhì)體不僅實(shí)現(xiàn)了BNCT硼攜帶劑靶向遞送,同時(shí)開(kāi)拓了聯(lián)合免疫治療的新的腫瘤BNCT治療策略。

圖6 DOX-CB利用其疏水性插入脂質(zhì)體膜上,內(nèi)部包載CD47-SIRPα的CRISPR-Cas9系統(tǒng),得到的復(fù)合型脂質(zhì)體將BNCT和免疫治療相結(jié)合,達(dá)到治療腫瘤的目的[58] Fig.6 DOX-CB inserts into membranes of liposomes which contain CD47-SIRPα CRISPR-Cas9 system. The multifunctional liposomes combine BNCT with immunotherapy for cancer treatment[58]

4 總結(jié)與展望

BNCT是依賴于腫瘤細(xì)胞靶向硼藥的精準(zhǔn)二元治療方式。設(shè)計(jì)構(gòu)建新型硼藥的靶向遞送系統(tǒng),是目前BNCT硼藥研發(fā)中的焦點(diǎn)。為此,硼藥遞送腫瘤靶點(diǎn)的選擇和靶向分子的設(shè)計(jì)成為了BNCT硼藥研發(fā)的焦點(diǎn)。

利用組學(xué)等方法識(shí)別和篩選出更多的腫瘤候選靶點(diǎn),通過(guò)機(jī)器學(xué)習(xí)等手段優(yōu)化出識(shí)別這些靶點(diǎn)的靶向分子庫(kù)是目前藥物研發(fā)的一個(gè)重要手段。比如,來(lái)自蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院的研究人員[59]通過(guò)機(jī)器學(xué)習(xí)方法去優(yōu)化治療性抗體,從Herceptin抗體的DNA序列出發(fā),通過(guò)CRTSPR-Cas9介導(dǎo)的同源定向修復(fù),定點(diǎn)突變產(chǎn)生了約40 000個(gè)相關(guān)抗體,利用支持這一優(yōu)化階段的機(jī)器學(xué)習(xí)方法,優(yōu)化出最佳的55個(gè)序列,可以在實(shí)驗(yàn)室中產(chǎn)生抗體并表征其特性。在確定這些靶向分子后,建立模塊化的靶向硼藥構(gòu)筑系統(tǒng)是提高當(dāng)前硼藥研發(fā)速度的一個(gè)重要突破口。這需要首先構(gòu)建出模塊化的硼核,然后將其與靶向分子偶聯(lián),從而構(gòu)建新型靶向硼藥篩選庫(kù),提高靶向硼藥設(shè)計(jì)和篩選的效率,降低開(kāi)發(fā)成本,促進(jìn)BNCT硼藥的快速發(fā)展。

分子靶向藥物是繼抗體靶向藥物之后腫瘤精準(zhǔn)治療的重要發(fā)展方向之一。BPA等硼氨酸以及硼苷酸等核酸類似物均具有明顯分子靶向特征,已成為小分子硼藥研發(fā)的焦點(diǎn)。然而這些小分子硼藥受限于硼含量、內(nèi)化和外排等在腫瘤細(xì)胞內(nèi)蓄積和代謝過(guò)程等因素的影響,需要在提高硼含量、改善在腫瘤細(xì)胞中的代謝、提高在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的靶向蓄積等進(jìn)行進(jìn)一步的開(kāi)拓性研究。

多靶向基團(tuán)的設(shè)計(jì)可能是硼藥研發(fā)的新思路。本課題組前期通過(guò)水熱法將葡萄糖和BPA綴合,合成出了一種含硼量子點(diǎn)(BCDs)。這一結(jié)構(gòu)同時(shí)擁有葡萄糖和BPA的靶向特征,能夠通過(guò)LAT1和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子雙重作用增加腦膠質(zhì)瘤U87MG細(xì)胞的硼攝取[60]。這一結(jié)果提示了復(fù)合靶向硼藥設(shè)計(jì)的可行性,對(duì)小分子硼藥和納米硼攜帶劑靶向性設(shè)計(jì)均有一定的借鑒作用。