陳敏氡，王彬，劉建汀，李永平，白昌輝，葉新如，裘波音，溫慶放，朱海生

基于轉(zhuǎn)錄組和WGCNA篩選絲瓜果長和果徑發(fā)育調(diào)控相關(guān)基因

陳敏氡，王彬，劉建汀，李永平，白昌輝，葉新如，裘波音，溫慶放，朱海生

福建省蔬菜遺傳育種重點實驗室/福建省蔬菜工程技術(shù)研究中心/福建省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所，福州 350013

【目的】鑒定絲瓜果長和果徑發(fā)育基因共表達模塊并篩選關(guān)鍵調(diào)控基因，為后續(xù)絲瓜果形控制的分子機制研究提供理論依據(jù)?！痉椒ā恳越z瓜9個發(fā)育階段（開花前2 d以及花后0、2、4、6、8、10、15和20 d）果實為研究材料，測定各階段的果長和果徑，利用WGCNA方法聯(lián)合分析轉(zhuǎn)錄組與果長和果徑數(shù)據(jù)，鑒定與果長和果徑發(fā)育相關(guān)的共表達基因模塊，篩選關(guān)鍵調(diào)控基因?！窘Y(jié)果】利用WGCNA鑒定出14個共表達模塊，與果長和果徑顯著相關(guān)（相關(guān)系數(shù)的絕對值=0.9）的共表達模塊有2個，顯著正相關(guān)的模塊為Turquoise模塊，顯著負相關(guān)的模塊為Lightpink4模塊。KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，Turquoise模塊顯著富集在內(nèi)吞作用和苯丙烷生物合成通路，與果實膨大、伸長調(diào)控密切相關(guān)，可作為研究絲瓜果長和果徑的關(guān)鍵基因模塊。根據(jù)Turquoise模塊內(nèi)基因的連接度以及功能注釋，篩選出10個關(guān)鍵調(diào)控基因，包括木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)葡糖基酶/水解酶基因、肌動蛋白解聚因子基因、伴侶蛋白基因、擴展蛋白基因（、和）、驅(qū)動蛋白基因、生長素反應基因和。RT-qPCR結(jié)果顯示，10個調(diào)控基因的表達量均在果實進入快速生長期（花后8 d）后顯著升高，增加倍數(shù)約為2—50倍。通過構(gòu)建基因互作網(wǎng)絡，發(fā)現(xiàn)部分調(diào)控基因與WRKY、bHLH和HSF轉(zhuǎn)錄因子家族存在互作關(guān)系?！窘Y(jié)論】獲得了絲瓜果長和果徑基因共表達重要模塊Turquoise模塊，篩選到10個調(diào)控基因可作為絲瓜果形控制的潛在候選基因，并發(fā)現(xiàn)絲瓜果長和果徑的發(fā)育調(diào)控主要涉及細胞壁的重構(gòu)、細胞的發(fā)育與分化、生長素的調(diào)控等過程。

轉(zhuǎn)錄組；WGCNA；絲瓜；果長；果徑；調(diào)控基因

0 引言

【研究意義】絲瓜（L.）為葫蘆科絲瓜屬作物，是我國夏秋供應市場的主要瓜類蔬菜之一。絲瓜果肉清香軟滑、營養(yǎng)豐富且具有較高的藥用功能，可用于治療筋骨酸痛、月經(jīng)不調(diào)或產(chǎn)后乳汁不通等癥狀，因此深受消費者喜愛[1-2]。不同地區(qū)對絲瓜的消費習慣并不一致，南方地區(qū)比較傾向于棒形的絲瓜，而北方地區(qū)以圓筒形絲瓜和皺皮絲瓜為主。隨著現(xiàn)代家庭結(jié)構(gòu)的改變，單瓜重約500 g的短棒、厚肉型絲瓜也逐漸受到消費者的追捧[3]。‘福研1號’[4]、‘雙豐1號’[5]、‘早優(yōu)3號’[6]等短肉型絲瓜新品種相繼問世，現(xiàn)已在我國福建、浙江、廣東等沿海地區(qū)大面積種植，具有廣闊的市場前景和巨大的經(jīng)濟潛力。由此可見，果長和果徑已成為絲瓜育種的重要考量指標，解析絲瓜果形控制的分子調(diào)控機制顯得尤為必要?！厩叭搜芯窟M展】果長和果徑是絲瓜重要的商品性狀，反映絲瓜果實的發(fā)育動態(tài)，與品質(zhì)、產(chǎn)量性狀緊密相關(guān)。前人對于絲瓜果長、果徑的遺傳研究已有少量文獻報道，高軍等[7]認為，普通絲瓜的果長遺傳由一對加性主基因控制，同時存在多基因的修飾作用。林明寶等[8]研究發(fā)現(xiàn)，有棱絲瓜中控制果長性狀的最少基因數(shù)目為4對。蘇小俊等[9]研究顯示，普通絲瓜果長、果徑的主基因遺傳力均較大，宜在分離早代采取表型選擇法進行選擇。崔竣杰等[10-11]在絲瓜連鎖群scaf1上定位到1個貢獻率為28.90%的果長QTL位點，表明絲瓜果長受環(huán)境影響較大，認為需要在高世代中進行選擇。近年來，隨著絲瓜全基因組的公布，少數(shù)果實發(fā)育基因被研究。曾美娟等[12]發(fā)現(xiàn)6個生長素酰胺合成酶家族基因（gretchen hagen 3，）在普通絲瓜長、短果品種中差異表達，推測這些基因與絲瓜果長發(fā)育相關(guān)。隨后又發(fā)現(xiàn)SUN-domain蛋白家族基因在絲瓜花后12 d短果中的表達量極顯著高于長果，可能是育種潛力基因[13]。然而，目前已獲得的這些基因依然是對前人研究結(jié)果的驗證，調(diào)控絲瓜果長和果徑的主效基因及功能尚未可知。權(quán)重基因共表達網(wǎng)絡分析（WGCNA）方法能夠有效地整合轉(zhuǎn)錄組、代謝組和蛋白質(zhì)組等多組學數(shù)據(jù)，正在成為發(fā)掘新基因功能和探索基因網(wǎng)絡與特定性狀間關(guān)聯(lián)關(guān)系的重要方法[14]。近幾年，在臍橙[15]、黃瓜[16]、西瓜[17]等果蔬形態(tài)發(fā)生研究中均可見利用WGCNA方法的報道。馮貴芝[15]發(fā)現(xiàn)介導柑橘果實ABA信號調(diào)節(jié)過程，在果實膨大期間起主要作用。李情[16]在黃瓜果實形態(tài)發(fā)生過程共鑒定出235個細胞分裂相關(guān)、1 020個細胞伸長相關(guān)的差異表達轉(zhuǎn)錄本，并發(fā)現(xiàn)、在其中起著至關(guān)重要的作用。孫蕾[17]發(fā)現(xiàn)胞壁酶和激素相關(guān)的基因，如聚半乳糖醛酸酶基因、果膠酯酶基因、生長素反應蛋白基因、脫落酸受體基因、乙烯反應轉(zhuǎn)錄因子、糖基轉(zhuǎn)移酶基因和擴展蛋白基因等參與調(diào)控了西瓜果實的膨大、成熟軟化過程?！颈狙芯壳腥朦c】WGCNA為果蔬形態(tài)調(diào)控基因的挖掘提供了新途徑，目前尚未見采用WGCNA方法篩選絲瓜果長和果徑發(fā)育調(diào)控基因的報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究以普通絲瓜9個發(fā)育階段的果實為研究材料，分析果實在各個發(fā)育階段果長和果徑的變化動態(tài)，通過WGCNA方法聯(lián)合分析轉(zhuǎn)錄組與果長和果徑數(shù)據(jù)劃分基因共表達模塊，挖掘與果長和果徑相關(guān)聯(lián)的關(guān)鍵模塊及調(diào)控基因，并構(gòu)建這些基因的互作調(diào)控網(wǎng)絡，為后續(xù)絲瓜果形控制的遺傳轉(zhuǎn)化研究提供潛在候選基因。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2022年在福建省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所福清東張基地和福州科研綜合研究中心進行，選擇絲瓜雜交種‘福研3號’為試驗材料。

1.2 方法

1.2.1 果實果長、果徑測定 采集開花前2 d（記為花后-2 d）以及花后0、2、4、6、8、10、15和20 d長勢均勻的果實各3個，共計27個樣品，用游標卡尺測量其果長和果徑。

1.2.2 絲瓜果肉RNA的提取、純化、質(zhì)檢和文庫構(gòu)建及其數(shù)據(jù)分析 選取花后-2 d至15 d共24個樣品進行轉(zhuǎn)錄組測序。切下樣品中部約5 cm的果肉，液氮中速凍30 min，80℃保存，利用Plant RNA Purification Reagent（Invitrogen）提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳分析RNA的完整性及是否存在DNA污染，采用NanoDropOne（Thermo Fisher Scientific，USA）對RNA質(zhì)量進行初步檢測（RIN≥6.5，OD260/280=1.8—2.2，OD260/230≥2.0）。按照Illumina TruSeqTMRNA sample preparation Kit方法構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組文庫，庫檢合格后采用Illumina MiSeq PE300（Illumina，USA）進行測序，由北京奧維森基因科技有限公司完成。高通量測序儀得到的圖像數(shù)據(jù)經(jīng)CASAVA堿基識別轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)（raw read）。對原始數(shù)據(jù)進行去除帶接頭、poly-N及低質(zhì)量read后獲得高質(zhì)量clean read。并對Q20、Q30、GC含量及重復序列水平進行統(tǒng)計；將clean read用HISAT2軟件與絲瓜參考基因組（https://peanutbase. org/data/public/Arachis_hypogaea/Tifrunner.gnm1.KYV3/）進行基因比對。

1.2.3 加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡分析 利用RESM軟件對基因表達數(shù)據(jù)進行背景校正和標準化，過濾表達量過低和變異系數(shù)較小的基因[18]。利用R軟件WGCNA包構(gòu)建基因共表達網(wǎng)絡分析（https://horvath.genetics. ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA/index.html）[19]。為了確保符合無尺度網(wǎng)絡分布，利用WGCNA包中的pickSoftThreshold函數(shù)計算合適的加權(quán)系數(shù)，的選取標準即滿足相關(guān)系數(shù)的平方接近0.8，同時還需要保證一定的基因連接度[20]。采用動態(tài)切割法識別共表達模塊[21]。利用自動網(wǎng)絡構(gòu)建函數(shù)blockwiseModules構(gòu)建網(wǎng)絡，其中最小模塊大小為50，合并相似性為0.75的模塊[20]。

1.2.4 特異性共表達模塊的鑒定、KEGG分析和基因表達趨勢分析 定義相關(guān)系數(shù)絕對值在0.5以上且顯著性值達到0.05水平的模塊為顯著模塊[22]。利用R語言的clusterProfiler包對顯著模塊內(nèi)基因進行功能富集（KEGG）分析，列出顯著性前20個代謝通路做氣泡圖[23]。利用STEM軟件對特異性共表達模塊基因進行趨勢分析，設定模塊數(shù)量為20，為0.05，以獲得顯著性和非顯著性基因表達模型[24]。

1.2.5 特異性模塊核心基因的篩選及互作網(wǎng)絡的構(gòu)建 利用softConnectivity函數(shù)計算基因的連接度，篩選出模塊內(nèi)連接度前10的基因，結(jié)合已報道的與葫蘆科果長和果徑相關(guān)的基因（基因的連通性在模塊排名的前10%），定義這些基因為模塊的調(diào)控基因[25]。計算調(diào)控基因與模塊內(nèi)全部基因的皮爾遜相關(guān)性系數(shù)，分別挑選與調(diào)控基因正負相關(guān)性前10的基因繪制網(wǎng)絡圖，利用Cytoscape v3.6.1進行可視化展示[23]。

1.2.6 RT-qPCR分析 采用通用植物總RNA提取試劑盒（北京百泰克生物技術(shù)有限公司）提取絲瓜花后-2 d至15 d共8個發(fā)育階段果實總RNA，利用HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）反轉(zhuǎn)錄試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）合成cDNA。利用Primer Premier 5軟件設計定量引物，具體引物序列見表1，以絲瓜為內(nèi)參基因[26]。按照SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ熒光定量試劑盒（寶生物工程大連有限公司）說明書在ABI7500熒光定量PCR儀（Applied Biosystems，USA）上進行分析。擴增程序為95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，40個循環(huán)。每個處理3個重復，并使用2-ΔΔCT方法計算基因的相對表達量[27]，采用Excel軟件作圖。

表1 本研究所用實時熒光定量PCR引物

2 結(jié)果

2.1 絲瓜果實發(fā)育過程中果長和果徑的生長動態(tài)分析

由圖1、2可知，絲瓜果實發(fā)育過程可以大致分為3個時期。花后-2 d至2 d為果實發(fā)育前期，這期間絲瓜果長和果徑生長緩慢；花后2—15 d為果實發(fā)育中期，這期間果長和果徑明顯增長、增大，其中花后8—15 d為果實的快速生長期和成熟期，果實膨大和伸長極顯著（<0.001）；花后15—20 d果實進入發(fā)育后期，這期間絲瓜果長和果徑基本不發(fā)生變化。

2.2 加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡的構(gòu)建

對絲瓜8個發(fā)育階段（花后-2 d至15 d）的24個絲瓜果實樣品進行RNA-seq數(shù)據(jù)分析，對表達矩陣中變異度較低的基因進行過濾后，選取26 620個基因進行WGCNA分析。當最優(yōu)軟閾值=6時，2＞0.8，平均連通性趨于0（附圖1），表明該軟閾值適合用來構(gòu)建無尺度網(wǎng)絡。根據(jù)基因的表達量進行聚類分析，聚類程度高的基因?qū)⒈环值揭粋€模塊（附圖2）。本研究共獲得14個基因共表達模塊，各模塊中所包含的基因數(shù)量差異明顯，其中Turquoise模塊中的基因數(shù)量最多（6 128個），Honeydew1模塊中的基因數(shù)量最少（86個）（圖3）。

2.3 特異性共表達模塊的鑒定

將14個基因共表達模塊分別與果長和果徑進行相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與絲瓜果長和果徑發(fā)育顯著相關(guān)的共表達基因模塊基本一致。其中，Turquoise模塊（=0.9，=3×10-9和=0.9，=1×10-9）和Brown4模塊（=0.64，=7×10-4和=0.65，=5×10-4）與果長和果徑顯著正相關(guān)，Lightpink4模塊（=-0.9，=2×10-9和=-0.9，=2×10-9）和Ivory模塊（=-0.67，=4×10-4和=-0.65，=6×10-4）與果長和果徑顯著負相關(guān)（圖4）。

圖3 各模塊的基因數(shù)量

2.4 基因共表達模塊的KEGG分析及表達趨勢分析

選取相關(guān)性最高的Lightpink4和Turquoise基因共表達模塊進行KEGG分析。結(jié)果顯示，Lightpink4模塊的基因主要顯著富集在氨基酸合成通路、剪接體通路、C5-二元酸代謝通路和丁酸代謝通路（圖5-A）。在生物體中，氨基酸合成通路、C5-二元酸代謝通路和丁酸代謝通路是產(chǎn)生能量、脂肪酸、氨基酸的重要途徑。剪接體負責pre-mRNA剪接，是基因表達與調(diào)控的重要環(huán)節(jié)之一[28]。2016年，哈佛公衛(wèi)學院Heintz等[29]研究團隊首次將剪接體與生物體的壽命相關(guān)聯(lián)，并提出在未來剪接體可能作為衰老的一種生物標志物或是早期標記。本研究中Lightpink4模塊的基因與絲瓜果長和果徑顯著負相關(guān)（=-0.9，=2×10-9和=-0.9，=2×10-9），表明這些基因可能更多地參與到絲瓜果實發(fā)育后期至衰老過程。Turquoise模塊的基因主要顯著富集在內(nèi)吞作用通路、氨基糖和核苷酸糖代謝通路、植物-病原相互作用通路和苯丙烷生物合成通路（圖5-B）。其中內(nèi)吞作用和苯丙烷生物合成通路內(nèi)顯著富集的基因數(shù)量最大（分別為52和41個）。內(nèi)吞作用是植物細胞吸收水分、礦物質(zhì)等的常見方式之一。德國弗萊堡大學DüNSER等[30]課題組發(fā)現(xiàn)內(nèi)吞運輸能夠同步細胞和液泡表面的增大，推測這可能是植物細胞在細胞擴張速度方面表現(xiàn)出色的原因。苯丙烷生物合成的重要代謝物木質(zhì)素能夠為植物提供機械支撐，同時參與導管的形成以及水分和礦質(zhì)元素的運輸[31]?？梢?，這兩個通路均與果實膨大、伸長過程緊密相關(guān)。本研究中Turquoise模塊的基因與絲瓜果長和果徑顯著正相關(guān)（=0.9，=3×10-9和=0.9，=1×10-9），表明該模塊可作為研究絲瓜果長和果徑調(diào)控相關(guān)基因的重要模塊。因此，本研究重點關(guān)注Turquoise模塊。對Turquoise模塊中6 128個基因進行表達趨勢分析（圖6），Turquoise模塊中的基因可以歸納為20種表達趨勢模型，其中Profile 0、1、16、19為4個顯著基因表達模型（<0.05），Profile 0為顯著下調(diào)表達模型，包含349個基因；Profile 19為顯著上調(diào)表達模型，包含2 607個基因。

橫坐標代表不同表型，縱坐標代表不同模塊。圖中每組數(shù)據(jù)表示模塊與表型的相關(guān)性系數(shù)R值及顯著性P值（括號內(nèi)）。紅色代表模塊與表型具有正相關(guān)，藍色代表模塊與表型具有負相關(guān)

圖5 Lightpink4（A）和Turquoise（B）基因共表達模塊的KEGG富集分析

2.5 絲瓜果長和果徑發(fā)育調(diào)控相關(guān)基因篩選

選取Turquoise模塊內(nèi)連接度最高的前10個基因作為該模塊的核心基因，并通過與葫蘆科同源基因的比對和注釋來預測核心基因的功能。結(jié)果表明，Turquoise模塊內(nèi)連接度最高的前10個基因中有6個基因有注釋信息，分別編碼木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)葡糖基酶/水解酶蛋白（xyloglucan endotransglucosylase/ hydrolase protein 23，XTH23）（Maker00007620）、肌動蛋白解聚因子（actin-depolymerizing factor 2，ADF2）（Maker00033581）、伴侶蛋白DnaJ10（chaperone protein dnaJ 10，DnaJ10）（Maker00000726）、磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）（Maker00012467）、同型半胱氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶（homocysteine S- methyltransferase 1，HMT1）（Maker00010036）和鈣依賴性蛋白激酶（calcium-dependent protein kinase 1，CDPK1）（Maker00009822）。PI、HMTI和CPK1在植物體中主要參與激活信號傳遞[32]、甲基傳遞[33]和鈣信號轉(zhuǎn)導[34]等過程。而XTH23、ADF2和DnaJ10在植物細胞壁重組[35]、細胞生長[36]和葉綠體的形成及分化[37]等生命過程起重要作用，與果長和果徑發(fā)育密切相關(guān)，因此，認為這3個基因可作為絲瓜果長和果徑發(fā)育候選基因。繼續(xù)在Turquoise模塊中篩選葫蘆科中已報道與果長和果徑發(fā)育相關(guān)的基因，結(jié)果在該模塊中共發(fā)現(xiàn)7個已報道過的基因，且基因的連通性均在模塊排名的前10%，包括4個擴展蛋白基因（Maker00000768、Maker00039481、Maker00026031、Maker00009740）、1個驅(qū)動蛋白基因（Maker00024997）以及2個生長素反應蛋白基因（Maker00001372）和（Maker00038241）（表2）。因此，本研究將以上10個基因作為絲瓜果長和果徑發(fā)育的候選基因。

方框內(nèi)數(shù)字為P值 The number in the box denoting the P-value

表2 絲瓜果長和果徑發(fā)育調(diào)控的候選基因

2.6 調(diào)控基因的表達模式分析

進一步利用RT-qPCR方法對10個調(diào)控基因的表達情況進行驗證，其結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)基本一致（圖7），說明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果的可信度較高。RT-qPCR結(jié)果顯示，10個候選基因大致包括3種表達模式，Maker00000726、Maker00038241、Maker00001372和Maker00024997這4個基因隨著果實的生長發(fā)育，表達量逐漸升高，其中花后10—15 d后升高明顯，表達量增加約2—6倍。Maker00007260和Maker00033581的表達量在發(fā)育前期（花后-2 d至2 d）基本不變，進入發(fā)育中期后共有2次表達量的顯著升高，花后4—8 d表達量增加約2—6倍，花后10—15 d表達量增加顯著，約10—50倍。Maker00026031、Maker00000768、Maker00039481和Maker00009740的表達量在花后8 d前基本不變，花后10—15 d表達量顯著升高，增加約10—40倍。

2.7 調(diào)控基因互作網(wǎng)絡的構(gòu)建

挑選與10個調(diào)控基因正負相關(guān)性前10的基因繪制網(wǎng)絡圖（附表1），利用Cytoscape v3.6.1進行可視化展示（圖8）。結(jié)果顯示與（Maker00007620）負相關(guān)性最高的基因編碼UV-B誘導蛋白（Maker00013740）（相關(guān)系數(shù)=0.980），正相關(guān)性最高的基因編碼富亮氨酸重復受體蛋白激酶（Maker00026072）（=0.985）；與2（Maker00033581）負相關(guān)性最高的基因編碼谷氨酰-tRNA還原酶1（Maker00033993）（=0.930），正相關(guān)性最高的基因編碼DA1相關(guān)蛋白2（Maker00009584）（=0.970）；與（Maker00000726）負相關(guān)性最高的基因編碼3-脫氫奎尼酸脫水酶/莽草酸脫氫酶（Maker00027020）（=0.943），正相關(guān)性最高的基因編碼真核生物翻譯起始因子3亞基J（Maker00008454）（=0.986）；與（Maker00000768）負相關(guān)性最高的基因編碼羥?；入赘孰乃饷福∕aker00028749）（= 0.926），正相關(guān)性最高的基因編碼受體激酶At5g67200（Maker00012477）（=0.965）；與（Maker00039481）負相關(guān)性最高的基因編碼葡萄糖-6-磷酸1-脫氫酶（Maker00001558）（=0.921），正相關(guān)性最高的基因編碼生長素外排載體（Maker00029480）（=0.939）；與（Maker00026031）負相關(guān)性最高的基因編碼受體蛋白激酶At5g15080（Maker00025844）（=0.934），正相關(guān)性最高的基因編碼生長素誘導蛋白22d（Maker00039055）（=0.988）；與（Maker00024997）負相關(guān)性最高的基因編碼轉(zhuǎn)運抑制反應蛋白1（Maker00016411）（=0.907），正相關(guān)性最高的基因編碼TIFY 9蛋白（Maker000）（=0.924）；與（Maker00009740）負相關(guān)性最高的基因編碼E3泛素蛋白連接酶RING1（Maker00022044）（=0.893），正相關(guān)性最高的基因編碼轉(zhuǎn)錄因子bHLH149（Maker00003629）（= 0.912）；與（Maker00001372）負相關(guān)性最高的基因編碼Csa_5G517870蛋白（Maker00029937）（=0.817），正相關(guān)性最高的基因編碼LOC101210747亞型X1蛋白（Maker00004186）（=0.858）；與（Maker00038241）負相關(guān)性最高的基因編碼非典型聚（A）聚合酶PAPD5（Maker00016990）（=0.968），正相關(guān)性最高的基因編碼胚芽水解酶7亞型X1（Maker00006161）（=0.977）。此外，在網(wǎng)絡圖中注釋到3類轉(zhuǎn)錄因子，分別編碼（Maker00039492）、9（Maker00036518）、（Maker0002332）、（Maker00003629）和（Maker00028475）。、、、分別與、、、存在互作關(guān)系。前人已在擬南芥[38]、苜蓿[39]、楊樹[40]中證實WRKY和bHLH類轉(zhuǎn)錄因子參與木質(zhì)素生物合成的調(diào)控。木質(zhì)素是植物細胞壁的主要成分，、、、均與植物細胞壁合成相關(guān)。由此推測這2類轉(zhuǎn)錄因子可能也參與到絲瓜果實生長膨大過程中細胞壁的合成、松弛和伸展。調(diào)控植物生長發(fā)育，在西瓜果實發(fā)育[41]和番茄植株矮化[42]過程中均發(fā)揮著重要作用。與存在互作關(guān)系，推測二者共同參與絲瓜果實細胞的生長、分化。

圖7 10個調(diào)控基因的RT-qPCR和RNA-seq結(jié)果

圖中連線顏色代表調(diào)控基因與關(guān)聯(lián)基因的相關(guān)性類型，紅色代表正相關(guān)，藍色代表負相關(guān)；線條粗細代表相關(guān)性數(shù)值大小。調(diào)控基因及其關(guān)聯(lián)的轉(zhuǎn)錄因子用黃色標注

3 討論

2008年，Langfelder和Horvath[19]提出了加權(quán)共表達網(wǎng)絡分析（WGCNA）方法[19]，國內(nèi)外學者通過該方法尋找到了許多與植物器官形態(tài)建成和發(fā)育調(diào)控的關(guān)鍵基因[43-45]。因此，本研究將WGCNA方法引入絲瓜果長和果徑發(fā)育調(diào)控基因的篩選。

3.1 絲瓜果長和果徑基因共表達重要模塊的鑒定

在共表達網(wǎng)絡分析中共獲得14個基因共表達模塊，并發(fā)現(xiàn)與絲瓜果長和果徑發(fā)育顯著相關(guān)的模塊基本一致，推測絲瓜果長和果徑發(fā)育可能由許多相同的基因調(diào)控。通過共表達模塊與表型的相關(guān)性分析以及模塊內(nèi)基因的KEGG分析，關(guān)注到Turquoise模塊。該模塊中有41個共表達基因顯著富集在苯丙烷生物合成途徑。苯丙烷類生物合成途徑是植物3條主要次生代謝途徑之一，該途徑中的一個重要產(chǎn)物木質(zhì)素與植物細胞的分化及器官生長過程密切相關(guān)。晏巢等[46]研究顯示油茶果皮中木質(zhì)素積累過程影響了果實發(fā)育，木質(zhì)素積累越早，果實越小，并且種子的形態(tài)也與木質(zhì)素具有直接的關(guān)系。朱海英等[47]研究表明，絲瓜果實的發(fā)育過程伴隨著大量木質(zhì)素的累積。課題組前期也發(fā)現(xiàn)5種木質(zhì)素合成蛋白（PAL、4-CL、CAD、POD和CCoAOMT）的表達水平在絲瓜果實發(fā)育過程顯著升高，說明絲瓜果實發(fā)育過程中苯丙烷生物合成活躍，木質(zhì)素大量合成[48]。由此表明，Turquoise模塊可作為研究絲瓜果長和果徑基因的重要模塊。未來可以結(jié)合細胞生物學和代謝組學手段研究絲瓜果實內(nèi)木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)類型、積累規(guī)律以及活躍區(qū)域等，進一步探究木質(zhì)素與絲瓜果長和果徑發(fā)育調(diào)控的關(guān)系。

3.2 絲瓜果形控制潛在的候選基因及功能預測

共表達模塊內(nèi)具有高連通性的基因被視為核心基因，這些基因通常起重要調(diào)控作用[23,49]。本研究對Turquoise模塊內(nèi)連通度前10的基因進行功能注釋，篩選出3個與果長和果徑發(fā)育相關(guān)的調(diào)控基因，分別編碼木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)葡糖基酶/水解酶XTH23、肌動蛋白解聚因子ADF2和伴侶蛋白DnaJ10。XTH是植物細胞壁重構(gòu)過程中的關(guān)鍵酶，不僅能夠松弛、降解細胞壁，而且能參與細胞壁的強化和合成[50]。有研究表明，XTH在調(diào)控黃瓜[51]、番茄[52]、柿子[53]、甜櫻桃[54]等果實伸長膨大、成熟及軟化過程中發(fā)揮著重要作用。本研究中，（Maker00007620）是Turquoise模塊內(nèi)連通性最高的基因。RT-qPCR顯示絲瓜果實進入快速生長期（花后8 d）后，的表達量顯著升高，花后10—15 d基因表達量較發(fā)育前期（花后-2 d至2 d）增加約33—48倍。可見，在調(diào)控絲瓜果長和果徑發(fā)育過程中起著重要調(diào)控作用。ADF是植物細胞的結(jié)構(gòu)、生長、發(fā)育和分化中必不可少的因素。水稻的和擬南芥的與花粉的形成和花粉管的伸長有關(guān)[55-56]。楊梅的ADF蛋白對果實的質(zhì)地變化起重要作用[57]。Qiao等[58]發(fā)現(xiàn)玉米的異源過表達提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥種子的大小，推測該基因可能在玉米籽粒發(fā)育中發(fā)揮重要作用。本研究中，（Maker00033581）同樣在絲瓜果實的快速生長期大量表達，花后10—15 d基因表達量較發(fā)育前期增加約7—11倍，提示該基因可能也與絲瓜果實的伸長及膨大相關(guān)。DnaJ是多種作物葉綠體的形成和分化過程中必不可少的重要因子[36]。果實葉綠體的豐度和功能直接影響著果實發(fā)育和品質(zhì)。本研究中，（Maker00000726）的表達量在絲瓜果實的發(fā)育中期顯著升高，推測該基因可能在該過程中調(diào)控果實葉綠素形成，而葉綠素作為同化器官合成大量同化物用于絲瓜果實發(fā)育。

此外，本研究還在Turquoise模塊中篩選到7個已在葫蘆科中報道過與果長和果徑發(fā)育相關(guān)的基因，它們分別編碼4個擴展蛋白Expansin、1個驅(qū)動蛋白Kinesin以及2個生長素反應蛋白SAUR和Aux/IAA。Expansin與XTH的功能相似，也在植物細胞壁的松弛與重構(gòu)中發(fā)揮重要作用[35]。郝西等[59]鑒定了黃瓜擴展蛋白基因家族，發(fā)現(xiàn)該家族基因在黃瓜果實發(fā)育過程中表達豐度較高。劉昌[60]在甜瓜中克隆到，發(fā)現(xiàn)敲除該基因的T1代果實與野生型相比出現(xiàn)果實變小的表型，表明能促進甜瓜果實成長期的膨大生長。本研究篩選到4個（Maker00026031、Maker00000768、Maker00039481和Maker00009740），發(fā)現(xiàn)這4個基因的表達量在果實進入快速生長期（花后8 d）前基本不變，隨后表達量均顯著升高，表明它們在果實果長、果徑的發(fā)育過程發(fā)揮重要作用。其中Maker00039481和Maker00009740編碼的和在果實成熟期（花后10—15 d）出現(xiàn)第二次的高表達，推測它們在果實成熟過程也起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)植物具有明顯的時空效應，有些的表達與果實發(fā)育、膨大相關(guān)，而有些是果實成熟軟化的特異基因[61]。Kinesin參與細胞分裂、生長和形態(tài)發(fā)生等植物生長發(fā)育過程。有研究報道，在黃瓜[62]、西瓜[63]等果實發(fā)育早期的細胞分裂和細胞膨大過程中起重要作用。本研究中，（Maker00024997）的表達量隨著絲瓜果實發(fā)育逐漸升高，并且在果實快速生長期顯著升高，可見很可能參與絲瓜果實整個生長發(fā)育期的細胞快速分裂過程。生長素是植物最重要的激素之一。/和作為兩類主要的生長素早期誘導基因在葫蘆科果實發(fā)育調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用[64]。袁靜賢[65]從西瓜中鑒定到4個/與果實發(fā)育早期細胞分裂呈正相關(guān)，7個/與果實膨大呈正相關(guān)。于越等[66]前期通過EMS誘變方法獲得黃瓜短果突變體，對其進行轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)一個關(guān)鍵的上調(diào)表達差異基因，該基因?qū)儆贏ux/IAA家族。LUO等[67]在冬瓜果實中發(fā)現(xiàn)一個特異性高表達的，發(fā)現(xiàn)在擬南芥中過表達該基因會導致角果變長，由此推測該基因在冬瓜果長調(diào)控中起重要作用。本研究中，（Maker00038241）和（Maker00001372）的表達量均隨著果實發(fā)育逐漸升高，并在果實快速生長期顯著高表達，可見生長素及其響應基因?qū)z瓜果實發(fā)育過程具有十分重要的調(diào)節(jié)作用。通過對以上10個調(diào)控基因的功能分析，發(fā)現(xiàn)絲瓜果長和果徑的發(fā)育調(diào)控主要涉及細胞壁的重構(gòu)、細胞的發(fā)育與分化、生長素的調(diào)控等過程，同時可能也與葉綠素的形成和分化相關(guān)。與此同時，研究還發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)的調(diào)控基因與多種作物果實的成熟軟化存在著密不可分的關(guān)系，因此，推測這些基因可能也參與絲瓜果實的成熟軟化過程，但其具體調(diào)控方式還需要進一步深入研究。

4 結(jié)論

本研究基于轉(zhuǎn)錄組和WGCNA構(gòu)建了絲瓜果長和果徑發(fā)育相關(guān)基因共表達網(wǎng)絡，共鑒定出14個共表達模塊，獲得了關(guān)鍵基因調(diào)控模塊Turquoise模塊，篩選到、、、、、、、和等10個調(diào)控基因可作為絲瓜果形控制潛在的候選基因。

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Screening Regulatory Genes Related to Luffa Fruit Length and Diameter Development Based on Transcriptome and WGCNA

CHEN MinDong, WANG Bin, LIU JianTing, LI YongPing, BAI ChangHui, YE XinRu, QIU BoYin, WEN QingFang, ZHU HaiSheng

Fujian Key Laboratory of Vegetable Genetics and Breeding/Fujian Engineering Research Center for Vegetables/Crops Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350013

【Objective】 The aim of this study was to identify the co expression modules of luffa fruit length and diameter development and to screen key regulatory genes, so as to provide the theoretical basis for subsequent research on the molecular mechanism of fruit shape control in luffa. 【Method】 The luffa fruits in 9 fruit development stages (2 days before anthesis, and 0, 2, 4, 6, 8, 10, 15, and 20 days after anthesis) were applied as research materials. The fruit length and diameter of each stage were measured. The WGCNA method was used to jointly analyze transcriptome and fruit length and diameter data, to identify co-expressed gene modules of fruit length and diameter development, and to screen out key regulatory genes.【Result】A total of 14 co expression modules were identified by WGCNA, among which two modules (Turquoise and Lightpink4) were significantly correlated with fruit length and diameter (absolute value of correlation coefficient=0.9); Turquoise module was significantly positively correlated, while Lightpink4 module was significantly negatively correlated. KEGG enrichment analysis found that the Turquoise module was significantly enriched in endocytosis and phenylpropanoid biosynthesis pathways, which were closely related to fruit enlargement and growth regulation, and could be used as a key gene module for studying fruit length and diameter in luffa. According to the connectivity and functional annotation of genes in Turquoise module, ten key regulatory genes were screened, including xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase gene, actin-depolymerizing factor gene, chaperone protein gene, expansin gene (,and), kinesin gene, auxin response genes, and. The RT-qPCR results showed that the expression levels of ten regulatory genes significantly increased after the fruit entered the rapid growth period (8 day after anthesis), with an increase of 2-50 times approximately. Through constructing a gene interaction network, it was found that some candidate genes interacted with the,, andtranscription factor families.【Conclusion】The Turquoise module, an important co expression module of luffa fruit length and diameter was obtained, and ten potential candidate genes for luffa fruit shape control were screened. It was found that luffa fruit length and diameter development regulation mainly involved the processes of cell wall reconstruction, cell development and differentiation, and auxin regulation.

transcriptome; WGCNA;L.; fruit length; fruit diameter; regulatory genes

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.22.012

2023-04-10；

2023-09-05

福建省自然科學基金（2021J01494）、福建省農(nóng)業(yè)科學院英才項目（YC2021004）、福建省農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新團隊項目（CXTD2021003-1）、國家大宗蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系福州綜合試驗站項目（CARS-23-G51）、福建省種業(yè)創(chuàng)新與產(chǎn)業(yè)化工程項目（zycxny2021009）、福建省農(nóng)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展超越“5511”協(xié)同創(chuàng)新工程項目（XTCXGC2021003）

陳敏氡，E-mail：1053870789@qq.com。通信作者朱海生，E-mail：zhs0246@163.com。通信作者溫慶放，E-mail：fjvrc@163.com

（責任編輯 趙伶俐）