田秦秦，盧先林，陳佳鑫，王海波，何 煒

(空軍軍醫(yī)大學(xué)：1藥學(xué)系化學(xué)制藥學(xué)教研室，2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院學(xué)員五大隊(duì)二十隊(duì)，陜西 西安 710032)

活性氧(reactive oxygen species，ROS)是生物體內(nèi)調(diào)節(jié)生理和病理過程不可或缺的活性分子，起到重要的信使傳遞功能，能夠?yàn)樯顒?dòng)提供良好的氧化還原平衡環(huán)境[1-4]。作為細(xì)胞中第二信使的過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)為維持生理過程中的氧化還原平衡扮演著極其重要的角色，參與多種調(diào)控機(jī)體的生理過程[5]。研究表明，H2O2的異常表達(dá)會(huì)破壞生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)、DNA和RNA，進(jìn)而導(dǎo)致癌癥、糖尿病、神經(jīng)退行性疾病及心血管疾病的產(chǎn)生[6-9]。因此，開發(fā)高效的H2O2檢測方法對(duì)于疾病的早期診斷與防治具有重要意義。相較于傳統(tǒng)H2O2的檢測方法[10-13]，熒光光譜法以其靈敏度高、特異性強(qiáng)、生物相容性優(yōu)異、可實(shí)時(shí)監(jiān)測和無創(chuàng)等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于H2O2等ROS活性分子的檢測應(yīng)用，解決了操作復(fù)雜、儀器設(shè)備昂貴、干擾因素多等缺點(diǎn)[14-15]?；贖2O2的親核性質(zhì)，含有7-羥基香豆素、熒光素等結(jié)構(gòu)的探針分子被應(yīng)用于H2O2的特異性熒光檢測。但這些熒光團(tuán)存在激發(fā)波長和發(fā)射波長在可見光區(qū)等不足，不利于細(xì)胞或活體成像[16-17]。

二氫氧雜蒽(dihydroxanthene，DHX)類化合物自身具有長共軛結(jié)構(gòu)且含多個(gè)可修飾位點(diǎn)，使得分子電子效應(yīng)及水溶性易調(diào)控，長共軛體系易構(gòu)建經(jīng)典“D-π-A”結(jié)構(gòu)分子，實(shí)現(xiàn)分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(internal charge transfer，ICT)調(diào)控。為此，一系列基于DHX結(jié)構(gòu)的熒光探針實(shí)現(xiàn)了對(duì)H2O2長波長發(fā)射的熒光響應(yīng)[18-23]。雖然，基于DHX結(jié)構(gòu)的探針分子可以實(shí)現(xiàn)對(duì)H2O2的高效靈敏檢測，但其仍然存在一定的局限性，比如檢測限較高、缺乏細(xì)胞器靶向性、受生物分布及局部微環(huán)境干擾大等。因此，開發(fā)新型結(jié)構(gòu)的探針分子以解決上述局限性問題實(shí)現(xiàn)對(duì)H2O2的高效靈敏檢測，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)相關(guān)疾病的監(jiān)測及治療評(píng)估至關(guān)重要。本研究基于前期對(duì)DHX型熒光探針的構(gòu)建及生物學(xué)應(yīng)用研究[24-25]，通過延長共軛的方式將具有功能化的吡啶鹽引入DHX結(jié)構(gòu)中構(gòu)建“on-off”型線粒體靶向探針分子DHX-H2O2，具有選擇性好、靈敏度高、細(xì)胞毒性低等優(yōu)點(diǎn)，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞以及斑馬魚中內(nèi)源性和外源性H2O2的成像檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所涉及的化學(xué)和生物試劑均為市售化學(xué)純或分析純產(chǎn)品，除特殊說明外，均不需要進(jìn)一步處理。人宮頸癌細(xì)胞系HeLa購自湖南豐暉生物科技有限公司。斑馬魚購自上海費(fèi)曦生物科技有限公司。采用APEX Ⅱ FT-ICR高分辨質(zhì)譜分析儀進(jìn)行高分辨質(zhì)譜(high-resolution mass spectrometry，HRMS)分析。在MERCURY-PLUS 400 MHz核磁共振波譜儀(Bruker公司)上進(jìn)行1H NMR 和13C NMR分析。在UV-2700紫外分光光度計(jì)(日本島津)上進(jìn)行吸收光譜分析。在OmniFluo 900熒光光譜儀(卓立漢光)上進(jìn)行發(fā)射光譜分析。在多功能酶標(biāo)儀(Multiskan GO，賽默飛)上進(jìn)行細(xì)胞活力測定。在IX81-FV1000 激光共聚焦顯微鏡(Olympus，日本)上進(jìn)行細(xì)胞熒光圖像。

1.2 方法

1.2.1 DHX-H2O2合成路線 化合物DHX-H2O2及其中間體化合物的合成路線如圖1所示。

DMF：二甲基甲酰胺。DHX：二氫氧雜蒽。圖1 DHX-H2O2的合成路線

1.2.1.1 化合物1的合成 將5.6 mL二甲基甲酰胺(dimethylformamide，DMF)和25 mL氯仿于0 ℃下攪拌，并緩慢加入PBr3(5.3 mL，65.0 mmol)，反應(yīng)45 min后，加入環(huán)己酮(2.5 mL，24.2 mmol)，升至室溫繼續(xù)反應(yīng)16 h后，將反應(yīng)液倒入大量的冰水中，并用飽和NaHCO3調(diào)節(jié)溶液pH值至中性，二氯甲烷(dichloromethane，DCM)萃取，有機(jī)相無水Na2SO4干燥，除去溶劑，得棕黃色油狀物化合物1[22]。

1.2.1.2 化合物2的合成 將2-羥基-4-甲氧基苯甲醛(3.6 g，26.6 mmol)溶于10 mL DMF中，逐滴加入化合物1的DMF稀釋液(6.0 g，32.0 mmol)，再加入CsCO3(17.4 g，57.2 mmol)，抽真空氬氣保護(hù)，室溫下反應(yīng)16 h后，加水淬滅，DCM萃取，有機(jī)相無水Na2SO4干燥，柱層析得亮黃色固體化合物2 5.8 g，產(chǎn)率50%[22]。1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ 10.30 (s，1H)，7.08 (d，J=9.0 Hz，1H)，6.65 (t，J=2.5 Hz，3H)，3.84 (s，3H)，2.55 (d，J=5.8 Hz，2H)，2.44 (t，J=6.2 Hz，2H)，1.71 (p，J=6.2 Hz，2H)。

1.2.1.3 化合物3的合成 4-乙腈吡啶(240.0 mg，2.0 mmol)、化合物2(242.0 mg，1.0 mmol)，溶于20 mL乙醇中，氬氣保護(hù)下，加入0.1 mL哌啶，回流反應(yīng)24 h后，除去溶劑柱層析分離得到棕色固體化合物3 187.0 mg，產(chǎn)率55%。1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ 8.60 (d，J=8.0 Hz，2H)，8.16 (s，1H)，7.54～7.47 (m，2H)，7.06 (d，J=8.0 Hz，1H)，6.65 (d，J=8.0 Hz，2H)，6.58 (s，1H)，3.85 (s，3H)，3.01 (t，J=6.0 Hz，2H)，2.61～2.52 (t，2H)，1.84 (m，2H)。13C NMR (100 MHz，CDCl3)δ 161.3，155.0，153.9，149.9(2)，144.3，138.7(2)，127.3，127.1，126.0，119.4，119.0，115.1，110.8，109.9，100.6，100.5，55.7，29.6，26.0，21.0。HRMS (ESI-MS)m/z：C22H19N2O2+[M+H]+理論計(jì)算值343.144 1，實(shí)際值343.144 0(圖2)。

A：1H NMR；B：13C NMR；C：HRMS。圖2 化合物3結(jié)構(gòu)表征

1.2.1.4 化合物DHX-H2O2的合成 化合物3(100.0 mg，0.3 mmol)、4-(溴甲基)苯硼酸酯(177.0 mg，0.6 mmol)，溶于20 mL乙腈中，氬氣保護(hù)，回流攪拌24 h后，除去溶劑柱層析分離得到DHX-H2O268.0 mg，產(chǎn)率37%。1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ 8.83～8.77 (m，2H)，8.59 (s，1H)，8.17 (d，J=4.0 Hz，2H)，7.81 (d，J=8.0 Hz，2H)，7.57 (s，1H)，7.43 (d，J=8.0 Hz，2H)，7.23 (d，J=8.0 Hz，1H)，7.10 (s，1H)，6.82 (d，J=8.0 Hz，1H)，5.77 (s，2H)，4.06 (s，3H)，3.04 (t，J=6.1 Hz，2H)，2.66 (t，J=5.9 Hz，2H)，1.86 (m，2H)，1.31 (s，12H)。13C NMR (100 MHz，CDCl3)δ 163.6 ，162.1，155.2，153.0，142.7(2)，142.5，136.0(2)，135.6，133.7，128.2(2)，127.9，126.4，121.2(2)，118.4，115.3(2)， 115.0，111.9，101.1，93.0，84.1(2)，62.8，57.6，29.1，25.5，24.9(4)，20.7。HRMS (ESI-MS)m/z：C35H36BN2O4+[M]+理論計(jì)算值559.276 3，實(shí)際值559.278 2(圖3)。

A：1H NMR；B：13C NMR；C：HRMS。DHX：二氫氧雜蒽。圖3 化合物DHX-H2O2結(jié)構(gòu)表征

1.2.2 DHX-H2O2的光譜測試 在DMSO-PBS(體積比為1∶1，10 mmol/L，pH=7.4)中，DHX-H2O2(10 μmol/L)和H2O2(200 μmol/L)混合液于室溫下放置180 min后進(jìn)行紫外吸收光譜、熒光光譜的測試研究；DHX-H2O2(10 μmol/L)和不同濃度的H2O2(0～500 μmol/L)混合液于室溫下放置180 min后進(jìn)行不同濃度的熒光滴定實(shí)驗(yàn)；DHX-H2O2(10 μmol/L)和H2O2(200 μmol/L)混合液在不同pH(pH值=2～13)條件下放置180 min后進(jìn)行探針對(duì)pH的響應(yīng)研究；DHX-H2O2(10 μmol/L)和H2O2(200 μmol/L)混合液直接進(jìn)行熒光動(dòng)力學(xué)測試，探究探針對(duì)H2O2的時(shí)間響應(yīng)研究；在探針DHX-H2O2對(duì)H2O2的選擇性研究中，其他ROS參照文獻(xiàn)[20]方法制得母液。將DHX-H2O2(10 μmol/L)與H2O2(200 μmol/L)其余分析物(500 μmol/L)混合液于室溫下放置180 min后進(jìn)行選擇性研究。所有熒光光譜除pH響應(yīng)外均在DMSO-PBS(體積比為1∶1，10 mmol/L，pH=7.4)中進(jìn)行，測試條件為λex=590 nm，λem=675 nm，slitband：3 nm/5 nm。DHX-H2O2在DMSO中制的1 mmol/L母液再稀釋使用。

1.2.3 探針檢測限的計(jì)算方法 根據(jù)熒光滴定所得到的探針在I675處的熒光強(qiáng)度變化，做出探針熒光強(qiáng)度對(duì)H2O2濃度變化的線性關(guān)系曲線，計(jì)算該曲線的斜率。利用公式LOD=3σ/k計(jì)算出探針對(duì)H2O2檢測的檢測限，其中σ為10次測量探針DHX-H2O2的I675熒光強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)偏差，k為線性關(guān)系曲線的斜率。

1.2.4 細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 將HeLa細(xì)胞置于含有100 mL/L胎牛血清和10 mL/L青鏈霉素合劑的DMEM完全培養(yǎng)液中，在50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h。采用經(jīng)典的MTT法研究探針DHX-H2O2對(duì)HeLa細(xì)胞的毒性大小。將HeLa細(xì)胞按每孔8×104/mL的細(xì)胞濃度，每孔200 μL細(xì)胞液加至96孔板中。然后在37 ℃、50 mL/L CO2的培養(yǎng)箱中孵育24 h，再分別加入0、10、20、30、40、50 μmol/L的探針溶液，將培養(yǎng)板繼續(xù)培養(yǎng)24 h。孵育結(jié)束后，在每個(gè)孔板中分別加入20 μL(5 mg/mL)的MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h。將細(xì)胞上清液吸棄，然后每孔中加入150 μL DMSO溶液，將96孔板于搖床上低速震蕩10 min，用酶標(biāo)儀測A492 nm值，并計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.4.2 細(xì)胞共定位實(shí)驗(yàn) 將適量細(xì)胞液移至激光共聚焦培養(yǎng)皿中，孵育24 h。隨后，向培養(yǎng)皿中加入濃度為10 μmol/L Rh123染料培養(yǎng)液，培養(yǎng)30 min后，加入濃度為10 μmol/L的探針培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)30 min。然后通過激光共聚焦顯微鏡對(duì)不同通道下的細(xì)胞進(jìn)行成像掃描。

1.2.4.3 探針DHX-H2O2對(duì)細(xì)胞中H2O2的成像實(shí)驗(yàn)研究 實(shí)驗(yàn)分為5組。DHX-H2O2組細(xì)胞只用含5 μmol/L DHX-H2O2的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)30 min；DHX-H2O2+50 μmol/L H2O2組和DHX-H2O2+100 μmol/L H2O2組細(xì)胞先用相同的探針濃度培養(yǎng)30 min，然后分別加入50 μmol/L和100 μmol/L的H2O2溶液，共孵育30 min；DHX-H2O2+0.1 μmol/L魚藤酮組細(xì)胞先用0.1 μmol/L的魚藤酮培養(yǎng)液孵育30 min，后加入5 μmol/L DHX-H2O2的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)30 min；DHX-H2O2+0.1 μmol/L魚藤酮+20 μmol/LN-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)為DHX-H2O2+0.1 μmol/L魚藤酮組的對(duì)照組，將細(xì)胞先用0.1 μmol/L的魚藤酮培養(yǎng)液孵育30 min，之后加入20 mmol/L NAC作抗氧化劑，用于清除ROS，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，清除細(xì)胞內(nèi)ROS，后加入相同濃度的DHX-H2O2培養(yǎng)液，培養(yǎng)30 min。在激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞成像研究。

1.2.5 斑馬魚成像實(shí)驗(yàn) 將購置的斑馬魚卵放置于28 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，之后取5 d大的斑馬魚進(jìn)行成像實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為3組：DHX-H2O2組用含10 μmol/L DHX-H2O2的培養(yǎng)液培養(yǎng)斑馬魚30 min；DHX-H2O2+100 μmol/L H2O2組用含10 μmol/L DHX-H2O2的培養(yǎng)液培養(yǎng)斑馬魚30 min，再加入含100 μmol/L H2O2的培養(yǎng)液培養(yǎng)30 min；DHX-H2O2+0.1 μmol/L魚藤酮組用0.1 μmol/L魚藤酮培養(yǎng)液培養(yǎng)斑馬魚30 min后，用含10 μmol/L DHX-H2O2的培養(yǎng)液培養(yǎng)30 min。在激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞成像研究。

2 結(jié)果

2.1 探針DHX-H2O2的光譜性質(zhì)

首先測試了探針DHX-H2O2(DMSO和PBS體積比為1∶1，10 mmol/L，pH值=7.4)與200 μmol/L H2O2反應(yīng)前后的紫外與熒光光譜。通過吸收光譜發(fā)現(xiàn)，探針分子在596 nm和643 nm表現(xiàn)出兩組最大吸收峰。與H2O2作用后，導(dǎo)致最大吸收峰發(fā)生了明顯的藍(lán)移，且在496 nm處產(chǎn)生了新的吸收峰，并且體系的顏色從藍(lán)色變?yōu)榉凵砻魈结樉哂新阊蹤z測H2O2的特性(圖4A)。探針在590 nm光源的激發(fā)下，在675 nm處存在強(qiáng)的近紅外熒光信號(hào)(圖4B)。與H2O2作用后，在675 nm處熒光強(qiáng)度發(fā)生了顯著的減弱。隨著H2O2濃度的增加(0～500 μmol/L)，675 nm處熒光逐漸減弱(圖4C)，并在H2O2濃度范圍為140～180 μmol/L時(shí)存在優(yōu)異的線性關(guān)系，由此可實(shí)現(xiàn)對(duì)H2O2的熒光定量測定。根據(jù)探針在675 nm的熒光信號(hào)與H2O2濃度的線性關(guān)系，得到線性方程：Y=-99.27X+27 355.2(R2=0.995)，并且由公式LOD=3σ/k計(jì)算出該探針對(duì)H2O2的檢測限為4.21 μmol/L(圖4D)。

A：探針DHX-H2O2與H2O2響應(yīng)前后的吸收光譜；B：探針DHX-H2O2與H2O2響應(yīng)前后的熒光光譜；C：探針DHX-H2O2對(duì)不同濃度H2O2響應(yīng)的濃度滴定曲線；D：探針DHX-H2O2在675 nm處熒光強(qiáng)度比值與H2O2濃度的線性關(guān)系。λex=590 nm，λem=675 nm，slitband：3 nm/5 nm。DHX：二氫氧雜蒽。圖4 探針DHX-H2O2的光譜性質(zhì)

從以上結(jié)果可以說明，探針本身具有近紅外熒光發(fā)射性能，還可以實(shí)現(xiàn)對(duì)H2O2的近紅外熒光響應(yīng)及裸眼觀測，具有優(yōu)異的靈敏度，可以用于H2O2的定量檢測。

2.2 探針DHX-H2O2對(duì)pH響應(yīng)測試研究和對(duì)H2O2的動(dòng)力學(xué)研究

為了驗(yàn)證生理?xiàng)l件下探針DHX-H2O2是否可以實(shí)現(xiàn)對(duì)H2OH2O2的靈敏響應(yīng)，我們測試了探針在不同pH環(huán)境下對(duì)H2O2的熒光響應(yīng)。探針在酸性條件下于675 nm處的熒光信號(hào)穩(wěn)定，當(dāng)pH值>10時(shí)，675 nm處的熒光強(qiáng)度發(fā)生明顯減弱，說明了強(qiáng)堿環(huán)境會(huì)破壞探針分子的結(jié)構(gòu)，使其熒光信號(hào)不穩(wěn)定(圖5A)。此外，探針在生理?xiàng)l件下(pH值=6～8)的熒光信號(hào)并沒有發(fā)生顯著的減弱，表明探針可以實(shí)現(xiàn)生理?xiàng)l件下對(duì)分析物的熒光檢測。與H2O2作用后，探針在生理?xiàng)l件下的熒光強(qiáng)度產(chǎn)生了顯著的變化。因此DHX-H2O2可以實(shí)現(xiàn)生理?xiàng)l件下H2O2的檢測。

A：不同pH條件下探針DHX-H2O2(10 μmol/L)與H2O2(200 μmol/L)響應(yīng)變化；B：探針DHX-H2O2(10 μmol/L)及與H2O2(200 μmol/L)響應(yīng)的動(dòng)力學(xué)測試。λex=590 nm，λem=675 nm，slitband：3 nm/5 nm。DHX：二氫氧雜蒽。圖5 探針DHX-H2O2的pH響應(yīng)及動(dòng)力學(xué)研究

接下來，在590 nm激發(fā)光照射下，研究探針在675 nm處熒光信號(hào)隨時(shí)間變化的動(dòng)力學(xué)曲線(紅色)以及加入200 μmol/L H2O2時(shí)熒光信號(hào)隨時(shí)間變化的動(dòng)力學(xué)曲線(黑色，圖5B)。結(jié)果表明，純探針溶液在675 nm處熒光強(qiáng)度基本上不會(huì)隨著時(shí)間的延長而發(fā)生明顯的變化，說明了探針具有穩(wěn)定的熒光信號(hào)輸出。而且加入H2O2會(huì)使探針的熒光信號(hào)隨著時(shí)間的延長發(fā)生明顯的減弱，并在反應(yīng)3 h左右達(dá)到最低且平衡。

2.3 探針DHX-H2O2的選擇性研究

由于生命系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境復(fù)雜且活性物質(zhì)較多，熒光探針在實(shí)際應(yīng)用過程中應(yīng)具備高選擇性。因此，我們研究了探針DHX-H2O2對(duì)各種分析物的熒光響應(yīng)變化，以此評(píng)價(jià)探針的檢測特異性，主要包括各種不同的氨基酸(Cys、Hcy、GSH、Leu、Phe、Thr、Lys、Ala、Gly、Tyr、DTT)，ROS(ClO-、H2O2、ClO4-、TBHP、·OH、1O2、ONOO-、NO)以及其他常見的陰離子(F-、Br-、Cl-、S2O52-、CO32-、NO2-、S2O42-、PO43-、HPO42-、HS-、SCN-、HSO3-、S2O32-)。其中，H2O2濃度為200 μmol/L，其他物質(zhì)的濃度為500 μmol/L。S2O82-、HS-、HSO3-、DTT、S2O52-這五類物質(zhì)也會(huì)導(dǎo)致探針在675 nm處的熒光信號(hào)發(fā)生顯著的減弱，而對(duì)于其他分析物，未觀察到明顯的熒光強(qiáng)度變化(圖6)。

探針DHX-1與不同物質(zhì)在675 nm處熒光強(qiáng)度數(shù)值變化柱狀圖。1：Thr；2：Lys；3：Ala；4：HPO42-；5：CO32-；6：Phe；7：GSH；8：Br-；9：Gly；10：HPO42-；11：SCN-；12：Leu；13：Cys；14：Cl-；15：ClO-；16：S2O32-；17：F-；18：ClO4-；19：Tyr；20：NO2-；21：TBHP；22：·OH；23：1O2；24：ONOO-；25：NO；26：DTT；27：HS-；28：S2O52-；29：S2O42-；30：H2O2；31：HSO3-。λex=590 nm，λem=675 nm，slitband：3 nm/5 nm。DHX：二氫氧雜蒽。圖6 探針DHX-H2O2的選擇性研究

但裸眼觀測顯示，這五類物質(zhì)與探針作用后，體系顏色由藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色，與H2O2和探針作用后所產(chǎn)生的體系顏色變化有明顯不同，推測其可能的反應(yīng)位點(diǎn)為吡啶環(huán)和DHX之間的共軛雙鍵進(jìn)行親核加成反應(yīng)，導(dǎo)致探針結(jié)構(gòu)中的供體和受體之間的共軛被打破，致使探針在675 nm處的熒光強(qiáng)度發(fā)生了顯著的變化。以上結(jié)果表明，雖然其他檢測物質(zhì)在675 nm處存在熒光強(qiáng)度減弱現(xiàn)象，但其作用機(jī)制不同，并且反應(yīng)前后體系顏色變化亦與H2O2響應(yīng)存在明顯差異，所以表明探針DHX-H2O2對(duì)H2O2存在特異性響應(yīng)。

2.4 探針DHX-H2O2對(duì)H2O2的識(shí)別機(jī)制研究

探針DHX-H2O2具有典型的D-π-A結(jié)構(gòu)，其中，甲氧基部分為電子供體部分(D)，吡啶鹽部分為受體部分(A)，通過分子內(nèi)的共軛體系形成了具有強(qiáng)的ICT效應(yīng)。結(jié)構(gòu)中苯硼酸酯基團(tuán)既作為H2O2識(shí)別基團(tuán)，又與吡啶鹽部位作為調(diào)控探針熒光性能的受體基團(tuán)。吸收光譜表明探針與H2O2反應(yīng)后的最大吸收波長與化合物3的最大吸收波長吻合。因此，推斷探針與H2O2的反應(yīng)產(chǎn)生的物質(zhì)可能為化合物3，其反應(yīng)機(jī)制主要分為兩部分：①H2O2將硼酸酯鍵氧化脫除，形成酚氧負(fù)離子中間體；②酚氧負(fù)離子中間體不穩(wěn)定，通過水解和1，6-消除反應(yīng)脫除。此外，芳基苯硼酸酯基團(tuán)被脫除后，會(huì)導(dǎo)致ICT效應(yīng)變?nèi)?，進(jìn)而熒光強(qiáng)度發(fā)生顯著減弱(圖7A)。

A：探針DHX-H2O2對(duì)H2O2可能的響應(yīng)機(jī)制；B：探針DHX-H2O2與H2O2響應(yīng)前后分子軌道能量及電子云密度分布。DHX：二氫氧雜蒽；DFT：密度泛函理論。圖7 探針DHX-H2O2對(duì)H2O2的響應(yīng)機(jī)制以及DFT計(jì)算

基于此，我們通過Gaussian 16軟件對(duì)探針DHX-H2O2和化合物3進(jìn)行了密度泛函理論(density functional theory，DFT)計(jì)算，通過探針反應(yīng)前后軌道能量及電子云密度的變化進(jìn)一步考察反應(yīng)前后ICT效應(yīng)的變化。探針DHX-H2O2軌道能隙差(2.38 eV)小于化合物3軌道能隙差(2.97 eV)，說明探針DHX-H2O2反應(yīng)前后的ICT效應(yīng)減弱，導(dǎo)致了探針在675 nm處的熒光強(qiáng)度發(fā)生減弱，與實(shí)驗(yàn)測試結(jié)果一致(圖7B)。

2.5 探針DHX-H2O2對(duì)H2O2檢測的細(xì)胞成像研究

2.5.1 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) MTT實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)探針DHX-H2O2的細(xì)胞毒性。結(jié)果表明，隨著細(xì)胞培養(yǎng)液中濃度的增加，細(xì)胞的存活率呈現(xiàn)減小的趨勢，但是即使探針濃度達(dá)到50 μmol/L時(shí)，HeLa細(xì)胞培養(yǎng)24 h后的存活率依然能夠達(dá)到80%以上(圖8)。說明探針DHX-H2O2具有較低的細(xì)胞毒性，為后續(xù)DHX-H2O2對(duì)活細(xì)胞中H2O2的成像檢測提供有力支持。

DHX：二氫氧雜蒽。圖8 探針DHX-H2O2對(duì)HeLa細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)

2.5.2 探針DHX-H2O2的共定位實(shí)驗(yàn) 由于生物體內(nèi)ROS多發(fā)于細(xì)胞線粒體中，另外線粒體膜電位具有負(fù)電性，能夠與帶有正電的物質(zhì)產(chǎn)生靜電引力作用。因此，考察探針DHX-H2O2是否具有定位線粒體的靶向功能，我們進(jìn)行了探針的線粒體共定位實(shí)驗(yàn)。如圖9所示，細(xì)胞經(jīng)探針DHX-H2O2和市售的線粒體染料Rh123共孵育后，探針與Rh123分別在不同通道實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞的染色，且互不干擾。通過對(duì)紅色通道和綠色通道圖像疊加，我們發(fā)現(xiàn)重合得到的圖片表現(xiàn)出清晰明亮的黃光。這表明探針DHX-H2O2和線粒體染料Rh123在細(xì)胞內(nèi)的分布區(qū)域相一致，通過計(jì)算得出皮爾森系數(shù)Rr=0.97(圖9)。研究結(jié)果表明，探針DHX-H2O2可以定位于細(xì)胞中的線粒體亞細(xì)胞器，并可以用于后續(xù)實(shí)現(xiàn)對(duì)線粒體中H2O2的成像檢測。

A：線粒體綠色熒光探針Rh123(10 μmol/L)對(duì)細(xì)胞孵育30 min后在綠色通道下的細(xì)胞成像[λex=488 nm，λem=(500±45)nm]；B：探針DHX-H2O2(10 μmol/L)對(duì)細(xì)胞孵育30 min后在紅色通道下的細(xì)胞成像(λex=559 nm，λem=575～675 nm)；C：Rh123與探針DHX-H2O2細(xì)胞成像圖疊加；D：Rh123與DHX-H2O2強(qiáng)度的相關(guān)圖。標(biāo)尺為50 μm。DHX：二氫氧雜蒽。圖9 探針DHX-H2O2的共定位實(shí)驗(yàn)

2.5.3 探針DHX-H2O2對(duì)細(xì)胞中H2O2成像實(shí)驗(yàn) 隨后，我們探究了探針DHX-H2O2對(duì)HeLa細(xì)胞中H2O2的成像功能。首先，我們將5 μmol/L的探針培養(yǎng)液與HeLa細(xì)胞共孵育30 min，發(fā)現(xiàn)紅色通道產(chǎn)生了明亮的紅色熒光，說明該探針具有對(duì)細(xì)胞成像的性能。而且，當(dāng)在細(xì)胞中加入50 μmol/L和100 μmol/L的外源性H2O2刺激時(shí)，紅色通道的熒光信號(hào)發(fā)生淬滅，并且隨著外源性H2O2濃度的增加，紅色通道的熒光逐漸減弱。此外，當(dāng)細(xì)胞中加入探針及魚藤酮(可刺激細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)源性ROS)時(shí)，在紅色通道具有較弱的熒光信號(hào)。在此實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，加入NAC(ROS清除劑)的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在紅色通道中可顯示紅色熒光(圖10)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明了，探針DHX-H2O2可以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的近紅外熒光成像，并且對(duì)活細(xì)胞中內(nèi)源性和外源性H2O2成像檢測效果顯著。

DHX：二氫氧雜蒽；NAC：N-乙酰-L-半胱氨酸。λex=559 nm，λem=650～752 nm，標(biāo)尺為50 μm。圖10 探針DHX-H2O2在HeLa細(xì)胞中的成像實(shí)驗(yàn)

2.5.4 探針DHX-H2O2對(duì)斑馬魚中H2O2成像實(shí)驗(yàn) 為進(jìn)一步驗(yàn)證探針DHX-H2O2的生物應(yīng)用性，我們考察了探針在斑馬魚模型中對(duì)H2O2的檢測與成像能力。DHX-H2O2組是經(jīng)探針DHX-H2O2(10 μmol/L)的DMEM培養(yǎng)液處理的斑馬魚的共聚焦成像圖，在紅色通道表現(xiàn)出了顯著的近紅外熒光信號(hào)，說明探針可用于對(duì)活體動(dòng)物的成像標(biāo)記。DHX-H2O2+100 μmol/L H2O2組是斑馬魚經(jīng)探針培養(yǎng)30 min后，再加入H2O2培養(yǎng)液(100 μmol/L)培養(yǎng)30 min，此時(shí)，紅色通道出現(xiàn)明顯的熒光信號(hào)減弱；DHX-H2O2+ 0.1 μmol/L魚藤酮組是斑馬魚先經(jīng)魚藤酮培養(yǎng)液培養(yǎng)30 min后，加入同濃度探針培養(yǎng)液培養(yǎng)30 min，在紅色通道觀察到明顯的熒光信號(hào)減弱現(xiàn)象(圖11)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該探針能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)活體動(dòng)物斑馬魚中外源性和內(nèi)源性H2O2的成像檢測能力，表現(xiàn)出了良好的活體生物成像應(yīng)用能力。

DHX：二氫氧雜蒽。λex=590 nm，λem=650～752 nm，標(biāo)尺為100 μm。圖11 探針DHX-H2O2在斑馬魚中的成像實(shí)驗(yàn)

3 討論

綜上所述，基于DHX結(jié)構(gòu)，本研究引入了具有功能化的吡啶鹽基團(tuán)，設(shè)計(jì)合成了一類新型近紅外熒光探針DHX-H2O2，并用于H2O2的檢測及應(yīng)用研究。該探針以芳基苯硼酸酯基為H2O2的識(shí)別基團(tuán)，能夠以良好的選擇性與優(yōu)異的靈敏度(4.21 μmol/L)實(shí)現(xiàn)對(duì)H2O2的近紅外“on-off”響應(yīng)，并伴有肉眼可見的藍(lán)色到粉色的顏色變化。通過對(duì)探針反應(yīng)前后的DFT計(jì)算，進(jìn)一步闡明了探針與H2O2反應(yīng)過程的熒光信號(hào)變化是由于探針反應(yīng)前后ICT效應(yīng)減弱導(dǎo)致的。生物成像研究表明，探針DHX-H2O2具有定位細(xì)胞線粒體的性能，皮爾森相關(guān)系數(shù)為0.97。探針DHX-H2O2成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞以及斑馬魚中內(nèi)源性和外源性H2O2的低毒性成像檢測，為后續(xù)進(jìn)一步研究H2O2在相關(guān)疾病中的機(jī)制及藥理作用提供潛在的應(yīng)用技術(shù)支持。