李旭波，靳雨晨，王欣賞，姜永莉，顏雨暄，宋大可，劉水冰

空軍軍醫(yī)大學藥學系藥理學教研室，陜西 西安 710032)

創(chuàng)傷后應激障礙(posttraumatic stress disorder，PTSD)是患者在親身經歷或目擊重大創(chuàng)傷性事件后如戰(zhàn)爭、地震等延遲出現(xiàn)的一種精神心理障礙[1-3]。肩負著依法維護國土和國家安全的軍隊作戰(zhàn)人員，長期暴露于高強度的心理生理應激條件下，PTSD亦成為他們最常見的精神疾病[4]。

PTSD主要臨床癥狀包括：重復性出現(xiàn)以往的創(chuàng)傷性體驗、持續(xù)性地逃避引起創(chuàng)傷性事件的相關刺激、保持高度易激惹警覺狀態(tài)，與創(chuàng)傷性事件相關的認知和情緒方面的負性改變，創(chuàng)傷性記憶增強的同時伴有正常學習記憶功能的下降[5]。PTSD的發(fā)病機制尚未闡明，缺乏有效治療藥物，目前臨床上采用選擇性血清素再攝取抑制劑舍曲林和帕羅西汀治療PTSD[6]。然而，其起效緩慢，長期服用會出現(xiàn)認知功能障礙、性功能障礙、睡眠障礙、依賴和戒斷綜合征等不良反應，限制了它們在臨床上的廣泛應用[6-7]。因此，尋找抗PTSD的潛在藥物靶點并開發(fā)新藥具有重要的研究意義。

轉位蛋白18 kDa(translocator protein 18 kDa，TSPO)是一種主要表達于類固醇合成組織線粒體外膜的蛋白，廣泛分布于中樞神經系統(tǒng)和外周組織，參與介導膽固醇進入線粒體內，是腦內合成神經類固醇并發(fā)揮神經保護作用的關鍵蛋白[8]。已有研究報道，TSPO與許多神經精神疾病、神經退行性疾病和多種應激相關障礙的發(fā)病機制和進展有關，包括阿爾茨海默病、肌萎縮側索硬化癥、帕金森病、多發(fā)性硬化癥、重度抑郁障礙、強迫癥、PTSD和焦慮癥等[9-10]。TSPO配體XBD173在動物模型和臨床治療上具有抗焦慮、抗抑郁作用[10]，沒有肌松、鎮(zhèn)靜、戒斷、耐受、損傷認知等苯二氮樣副反應。其作用機制是TSPO與配體結合可促進膽固醇跨膜并轉運進入磷脂膜，增加孕烯醇酮及下游神經類固醇的合成[10-11]。ZBD-2是本實驗室自主研發(fā)合成的2-芳基咪唑并[1，2-α]吡啶-3-乙酰胺衍生物(圖1)，是一種新型TSPO配體(中國專利號：201210047188.6)。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)ZBD-2對NMDA引起的神經元興奮性毒性損傷具有保護作用，具有改善腦缺血再灌注的作用[12]，可以顯著緩解神經病理性疼痛引起的動物焦慮樣行為[13]，改善PPD小鼠抑郁樣行為[14]。但是，ZBD-2是否能夠改善PTSD的癥狀尚不清楚。

圖1 ZBD-2化學結構式

前期研究中，條件性恐懼(conditioned fear，CF)和單一的長期壓力被廣泛用于建立PTSD的動物模型研究[15]。為了最大限度模擬PTSD患者的病理生理學改變，本研究采用CF聯(lián)合單一連續(xù)應激(single-prolonged stress，SPS)的雙重應激(CF+SPS)建立小鼠PTSD模型[16]，誘導小鼠情緒障礙和過度恐懼反應，旨在探討自主研發(fā)的新型TSPO配體ZBD-2對小鼠PTSD行為的影響，為發(fā)現(xiàn)抗PTSD潛在新靶標和新藥物提供前期研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

48只成年(6～7周齡)C57BL/6健康雄性小鼠，體質量(20.0±2.0)g，由空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心提供。實驗前在實驗室進行1周適應性飼養(yǎng)，室溫22～25 ℃，濕度55%～60%，12 h∶12 h光照黑暗循環(huán)飼養(yǎng)，并給予足量的水與食物。所有動物實驗均經空軍軍醫(yī)大學實驗動物福利與倫理委員會批準(許可證號：IACUC-20230064)。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 將48只小鼠隨機分為正常對照(Control)組、PTSD模型(Model)組、PTSD模型+ZBD-2組[ZBD-2低劑量(Model+L-ZBD)組、ZBD-2中劑量(Model+M-ZBD)組、ZBD-2高劑量(Model+H-ZBD)組]、PTSD模型+帕羅西汀陽性對照(Model+Paro)組，每組8只。

1.2.2 PTSD模型的建立 在制備模型前，連續(xù)1周每日撫摸小鼠2次以減少應激反應。采用CF+SPS雙重應激方法建立小鼠PTSD模型[16]。實驗前1 d，將小鼠放置在行為學室適應環(huán)境?？謶钟洃浵浞胖迷谂鋫溆姓彰鳠?、小風扇、聲音發(fā)生器以及與聲音發(fā)生器相聯(lián)的擴音器和攝像頭的隔音箱中，風扇用于通風和產生背景噪音，這對于以聲音作為條件刺激尤其重要。小鼠所有運動軌跡由視頻跟蹤和自動分析系統(tǒng)記錄(DigBehv-LR4，吉良軟件科技有限公司，中國上海)。CF實驗開始，將小鼠放進恐懼記憶箱(30 cm×30 cm×60 cm)中自由探索180 s，然后給予蜂鳴(15 s，1 kHz，75 dB)，蜂鳴的最后5 s同時給予足部電擊(電流強度2 mA)。間隔60 s后再開始第二輪蜂鳴和電擊。小鼠在被電擊時發(fā)生驚叫、驚跳、逃避等，聽到聲音提示時出現(xiàn)慌張、逃避或者僵立行為(除呼吸外無其他運動行為)。重復5個循環(huán)，持續(xù)5 d，每日在同一個時間段進行上述操作。第6日進行單一連續(xù)應激實驗：先將小鼠束縛固定2 h(8∶00～10∶00)，接著立即將小鼠放入裝滿20～24 ℃水的玻璃圓柱形水箱(直徑24 cm，高度50 cm)強迫游泳20 min，待小鼠恢復15 min后，用乙醚麻醉至意識模糊(夾腳趾和夾尾巴沒有反應)，每只小鼠麻醉2次，結束后將小鼠放回籠中(圖2)。

CF：條件性恐懼；SPS：單一連續(xù)應激。圖2 實驗方案時間軸

1.2.3 藥物干預 PTSD模型+ZBD-2(低、中、高劑量)組小鼠分別給予ZBD-2灌胃(0.3、1.0、3.0 mg/kg)。Model+Paro組小鼠給予帕羅西汀灌胃(10 mg/kg)[17]，Control組和Model組小鼠灌胃注射生理鹽水，各組連續(xù)給藥7 d。

1.2.4 曠場實驗 曠場實驗是檢測動物焦慮水平的經典行為學方法，用來評價動物的警覺反應、焦慮狀態(tài)和環(huán)境適應能力[18]。參照前期研究[19]，實驗裝置為單獨配有弱光和換氣系統(tǒng)的隔音箱，內裝有玻璃樹脂做成的30 cm×30 cm×30 cm的盒子。盒子底面被分割為16個等大的方格。實驗第13日，灌胃給藥后2 h開始實驗，將小鼠頭朝開場箱的某個固定角落放入，自由活動15 min，應用JLCY-3小鼠自發(fā)活動視頻跟蹤分析系統(tǒng)記錄實驗小鼠15 min內的自發(fā)活動。記錄各組小鼠之間的中央區(qū)域運動時間、中央區(qū)域運動路程與運動總路程，中央區(qū)域是盒子底面積中心9個方格區(qū)域。中央區(qū)域運動時間百分比=中央區(qū)域運動時間/自由活動總時間，中央區(qū)域運動路程百分比=中央區(qū)域運動路程/總活動路程。表現(xiàn)焦慮樣行為的小鼠喜歡靠近墻壁并更多地在四周活動，焦慮程度較低的老鼠在盒子的中央開放區(qū)域會活動更多的時間[18]。每只小鼠完成實驗后均用乙醇棉球擦拭敞箱，以除去前一只小鼠余留的氣味，避免影響下次測試結果。

1.2.5 高架十字迷宮實驗 曠場實驗結束后4 h，進行高架十字迷宮實驗，用來檢測動物焦慮和恐懼水平。裝置包括兩個25 cm×8 cm×0.5 cm相對開臂和兩個25 cm×8 cm×12 cm相對閉臂，距離地面50 cm高，迷宮中央交叉區(qū)域8 cm×8 cm，上方安裝錄像監(jiān)控器，以錄制動物在迷宮中的活動情況。實驗開始，將小鼠頭朝開臂放入迷宮中央區(qū)，攝像監(jiān)控記錄5 min內實驗小鼠進入開臂和閉臂的次數(shù)和時間。開臂進入次數(shù)百分比=開臂進入次數(shù)/(開臂進入次數(shù)+閉臂進入次數(shù))，開臂進入時間百分比=開臂進入時間/(開臂進入時間+閉臂進入時間)。記錄結束后將小鼠放回飼養(yǎng)籠，用乙醇擦拭迷宮，消除氣味對后繼實驗小鼠的影響。

1.2.6 懸尾實驗 懸尾實驗利用小鼠懸尾后企圖逃脫但又無法逃脫，從而放棄掙扎，進入特有不動狀態(tài)來評價小鼠的抑郁行為。實驗第14日，將實驗小鼠尾部遠端1.5 cm處固定懸掛于40 cm×40 cm的白色樹脂玻璃盒內，小鼠頭部距地面15 cm。攝像記錄6 min，統(tǒng)計后5 min小鼠不動時間總和。

1.2.7 僵住時間測定 實驗第15日進行情境和線索CF測試[20]。在情境條件性恐懼測試中，將小鼠置于相同的恐懼記憶箱(30 cm×30 cm×60 cm)中不給予蜂鳴和電擊自發(fā)活動5 min，記錄小鼠的僵住時間。僵住行為是小鼠表達恐懼的方式，行為學表現(xiàn)為除呼吸運動外全身其余的肌肉運動均消失。小鼠的僵住時間百分比=僵住時間/總時間。每只小鼠實驗間隔需用乙醇擦拭箱體以消除氣味的影響。4 h后進行線索CF測試。首先改變測試箱體，將導電格柵地板替換為網格薄板，黑白格圖案貼到測試箱的內壁上，用10 mL/L的醋酸溶液來遮掩之前的清潔溶液，為線索CF測試提供新環(huán)境。讓小鼠在這樣一個新的測試箱內自發(fā)活動3 min，然后連續(xù)3次循環(huán)蜂鳴刺激(在每分鐘的前15 s蜂鳴，180 s，2 kHz，75 dB)，沒有電擊刺激。記錄3 min內小鼠的僵住時間，計算小鼠的僵住時間百分比，以反映小鼠的恐懼行為。

2 結果

2.1 ZBD-2能夠改善PTSD模型小鼠焦慮樣行為

采用曠場實驗和高架十字迷宮實驗檢測小鼠焦慮樣行為。與Control組相比，Model組小鼠曠場總路程縮短(P<0.05)，反映遭受刺激后小鼠對新環(huán)境的好奇感減弱、探索興趣下降；中央區(qū)域運動路程百分比和中央區(qū)域運動時間百分比顯著降低(P<0.01，圖3A～D)，反映小鼠的焦慮狀態(tài)和對曠場環(huán)境保持警覺。Model組小鼠相較與Control組小鼠，進入高架十字迷宮開臂滯留時間百分比、開臂進入次數(shù)百分比和總進臂次數(shù)顯著減少(P<0.01，圖3E～H)，小鼠傾向進入閉臂內，停留在閉臂角落處，回避進入開臂(開臂代表危險)，提示模型小鼠恐懼水平較高，有明顯的焦慮樣行為，與PTSD患者警覺性增高和易激惹癥狀相符。ZBD-2治療后，小鼠曠場總路程無明顯差異(P>0.05)；Model+L-ZBD組小鼠的中央區(qū)域運動路程百分比和中央區(qū)域運動時間百分比明顯升高(P<0.01，圖3A～D)。同時，PTSD模型+ZBD-2各組小鼠進入高架十字迷宮開臂的滯留時間百分比、開臂進入次數(shù)百分比和總進臂次數(shù)與Model組相比均有增加，其中Model+L-ZBD組和Model+M-ZBD組具有顯著性差異(P<0.05，P<0.01，圖3E～H)，表明灌胃給藥7 d后ZBD-2能夠有效改善PTSD模型小鼠的焦慮樣行為。

A：曠場試驗中小鼠的運動軌跡；B：運動總路程比較；C：各組小鼠在中央區(qū)域運動路程百分比；D：各組小鼠在中央區(qū)域運動時間百分比；E：高架十字迷宮實驗中小鼠的運動軌跡；F：各組小鼠開臂滯留時間百分比；G：開臂進入次數(shù)百分比；H：總進臂次數(shù)。Control：正常對照；Model：PTSD模型；Model+L-ZBD：ZBD-2低劑量；Model+M-ZBD：ZBD-2中劑量；Model+H-ZBD：ZBD-2高劑量；Model+Paro：PTSD模型+帕羅西汀陽性對照。n=8，aP<0.05，bP<0.01。圖3 曠場和高架十字迷宮實驗評估小鼠焦慮樣行為

2.2 ZBD-2能夠減輕PTSD模型小鼠抑郁樣行為

在懸尾實驗中，Model組小鼠不動時間比Control組顯著延長，反映小鼠出現(xiàn)明顯的抑郁樣行為。PTSD模型+ZBD-2的各組小鼠不動時間均比Model組減少，其中Model+M-ZBD和Model+H-ZBD組具有顯著性差異(P<0.01)，效果與Model+Paro組相似(圖4)。結果表明ZBD-2能夠有效減輕PTSD模型小鼠的抑郁樣行為。

A：懸尾試驗中小鼠的運動軌跡；B：各組小鼠不動時間百分比。Control：正常對照；Model：PTSD模型；Model+L-ZBD：ZBD-2低劑量；Model+M-ZBD：ZBD-2中劑量；Model+H-ZBD：ZBD-2高劑量；Model+Paro：PTSD模型+帕羅西汀陽性對照。n=8，aP<0.05，bP<0.01。圖4 懸尾實驗評估小鼠抑郁樣行為

2.3 ZBD-2能夠緩解PTSD模型小鼠恐懼樣行為

重新回到情景和線索CF環(huán)境中，模型小鼠呈現(xiàn)PTSD的核心行為表型，即再次暴露于創(chuàng)傷環(huán)境時呈現(xiàn)以僵住時間延長為指征的恐懼行為。在情景CF和線索CF測試中，Model組小鼠與Control組小鼠相比，在試驗箱中的僵住時間顯著延長(P<0.01，圖5A～C)，提示PTSD模型小鼠恐懼水平增加。與Model組小鼠相比，PTSD模型+ZBD-2各組小鼠的僵住時間顯著縮短，其中Model+H-ZBD組和Model+Paro組小鼠的僵住時間顯著降低(P<0.05，P<0.01，圖5B～C)，提示ZBD-2能夠緩解PTSD模型小鼠的恐懼樣行為，其中以中劑量的ZBD-2治療效果為最佳。

A：情景和線索CF實驗中小鼠的運動軌跡；B：各組小鼠情景CF僵住時間百分比；C：各組小鼠線索CF僵住時間百分比。Control：正常對照；Model：PTSD模型；Model+L-ZBD：ZBD-2低劑量；Model+M-ZBD：ZBD-2中劑量；Model+H-ZBD：ZBD-2高劑量；Model+Paro：PTSD模型+帕羅西汀陽性對照；CF：條件性恐懼。n=8，aP<0.05，bP<0.01。圖5 情景和線索CF實驗評估小鼠恐懼樣行為

3 討論

50%以上的PTSD患者共病有抑郁癥、酒精濫用或成癮、焦慮性障礙等[21-22]。選擇性5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)再攝取抑制劑是美國FDA批準的PTSD一線治療藥物。然而，有數(shù)據表明40%～60%的患者對此類藥物沒有反應[23]。因此，亟需新的藥物用于PTST治療。ZBD-2是一種新型的小分子TSPO配體，在多種動物模型中具有顯著的抗焦慮和抑郁作用[13-14]。然而，ZBD-2是否對PTSD引起的恐懼焦慮和抑郁樣行為有作用尚不清楚。在本研究中，我們從行為學上首次驗證了ZBD-2改善PTSD模型小鼠恐懼焦慮和抑郁樣行為。我們首先建立CF+SPS模型模擬PTSD患者的病理生理學改變，進而觀察到ZBD-2治療7 d就可以發(fā)揮快速起效的抗PTSD樣作用，且有效用藥劑量低于帕羅西汀。但其作用機制及副作用評價將是我們下一步的重點研發(fā)的方向，這將對自主產權的新藥研發(fā)產生積極的借鑒意義。

我們在本次實驗中僅選擇了成年雄性小鼠，是為了避免雌性動情周期引起的情緒變化。有研究報道5-HT再攝取抑制劑舍曲林抗PTSD作用在TSPO敲除小鼠中被消除，提示TSPO可能介導了5-HT再攝取抑制劑發(fā)揮抗PTSD作用[24]。此外，5-HT再攝取抑制劑可顯著升高PTSD模型大鼠腦內四氫孕酮含量，這類藥物亦被稱為選擇性促腦類固醇生成劑，而激活TSPO同樣可產生類似改變[24]，提示TSPO激活與5-HT再攝取抑制劑抗PTSD作用機制可能具有密切關系。本實驗室前期經評篩發(fā)現(xiàn)化合物ZBD-2與TSPO的高親和力結合，基于前期的研究基礎，提示TSPO介導了ZBD-2的抗PTSD作用，可能是抗PTSD的潛在治療藥物。

大量研究表明，海馬體和杏仁核這兩個區(qū)域都參與了PTSD的發(fā)生發(fā)展[25]。海馬體調控了情境性恐懼，杏仁核調控了CF[26]，本實驗發(fā)現(xiàn)模型小鼠在情景和線索條件恐懼環(huán)境中都出現(xiàn)僵住時間延長現(xiàn)象。給予ZBD-2治療后，在情景和線索CF中小鼠僵住時間均縮短，提示激活TSPO與海馬體和杏仁核腦區(qū)均相關。前期文獻報道，在海馬齒狀回激活TSPO具有抗焦慮和抑郁的作用[27]；在海馬齒狀回過表達TSPO可以減輕PTSD模型小鼠的焦慮樣反應[28]；在杏仁核中檢測TSPO與配體結合后可以減輕產后抑郁模型小鼠的抑郁樣行為[14]，這些報道與我們的研究結果一致，已有研究者提出海馬體和杏仁核作為治療PTSD的共同靶向[25]，但是我們也不能完全排除其他腦區(qū)可能的作用。不同腦區(qū)TSPO扮演的作用有待我們進一步的深入研究。

本研究中，0.3 mg/kg的ZBD-2能有效地緩解PTSD模型小鼠的焦慮樣行為，同時，1.0 mg/kg的ZBD-2能有效地緩解PTSD模型小鼠的抑郁樣行為，效果與帕羅西汀效果接近，證實小鼠灌胃ZBD-2具有顯著的抗抑郁、抗焦慮作用，但藥效并非隨劑量增大而增加，表明ZBD-2存在劑量效應曲線變化，一開始劑量低時，藥物效應小；隨著劑量的增加，藥物效應也隨之增加，到達最大效應；此時ZBD-2效應不再隨劑量的增加而增強。本實驗中低劑量ZBD-2具有抗焦慮作用，中劑量ZBD-2具有抗抑郁作用，提示抗焦慮和抑郁的有效治療劑量會有差別，符合藥物劑量效應關系。

綜上所述，TSPO選擇性配體ZBD-2能有效改善PTSD小鼠焦慮和抑郁樣行為，發(fā)揮抗PTSD作用，提示ZBD-2有可能成為預防PTSD的潛在藥物，但調節(jié)機制尚有待進一步深入研究，我們的研究為篩選抗PTSD候選新藥提供了重要的實驗依據。