過忠杰，張 蓉，趙 玫，張邵華，劉 偉，李穆瓊，姜 茹，王勝正

[1空軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系藥物化學(xué)與藥物分析學(xué)教研室，陜西 西安 710032；2陜西科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院(生物與醫(yī)藥學(xué)院)藥學(xué)系，陜西 西安 710021]

近些年，深部真菌感染已成為艾滋病和腫瘤等重大疾病死亡的主要原因[1-2]。而對(duì)于深部真菌感染，臨床上安全有效的抗真菌藥物數(shù)量有限，主要有多烯類(如兩性霉素B)、氟代嘧啶類(如5-氟胞嘧啶)、唑類[如氟康唑(fluconazole，F(xiàn)LC)和伊曲康唑]、棘白菌素類(如卡泊芬凈和米卡芬凈)等[3-4]。兩性霉素B被譽(yù)為抗真菌治療的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但長期使用易產(chǎn)生嚴(yán)重的腎毒性和溶血反應(yīng)[5]。5-氟胞嘧啶的抗真菌譜較窄，常用于聯(lián)合用藥。FLC對(duì)曲霉菌感染無效，僅具有抑菌作用，長期反復(fù)使用易產(chǎn)生快速耐藥性[6-7]。棘白菌素類對(duì)一些新型的致病真菌(如連孢菌和接合菌)無效，并且只能靜脈給藥[4]。近來亦有對(duì)兩性霉素B和棘白菌素類耐藥菌株的報(bào)道[8]，這進(jìn)一步加劇深部真菌感染的治療難度[9-10]。因此，臨床迫切需要開發(fā)新結(jié)構(gòu)類型、作用于新靶點(diǎn)的抗真菌藥物[11]。

前期課題組對(duì)內(nèi)部化合物庫進(jìn)行了體外抗真菌活性的篩選，發(fā)現(xiàn)具有2-芳基-4-取代喹啉類骨架的化合物J6表現(xiàn)出廣譜抗真菌活性。本研究擬進(jìn)一步評(píng)價(jià)J6對(duì)真菌存活、菌絲形成的影響。通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)J6對(duì)真菌細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成、生物膜通透性和凋亡的影響?；衔颙6具有全新的分子結(jié)構(gòu)，對(duì)其進(jìn)行深入的構(gòu)效關(guān)系和作用機(jī)制研究，有望發(fā)現(xiàn)全新的抗真菌藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

化合物庫包含231個(gè)實(shí)體化合物，包含的分子結(jié)構(gòu)有β-雙咔啉類生物堿、青蒿素衍生物、吲哚酮螺環(huán)和喹啉類衍生物，具有多樣性的分子骨架和取代基團(tuán)，具體的分子結(jié)構(gòu)參照課題組已發(fā)表的文獻(xiàn)[12-16]。其中化合物J6的化學(xué)名為2-(2H-1,3-苯并二惡茂-5-基)-6-甲氧基-N-甲基-N-(丙-2-基)喹啉-4-羧酰胺。由于化合物J6的酰胺氮原子連接了兩個(gè)不同的化學(xué)基團(tuán)，J6的1H NMR譜圖顯示存在兩個(gè)旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體處于動(dòng)態(tài)平衡中，摩爾比例為1.3∶1，這一現(xiàn)象與文獻(xiàn)報(bào)道一致[17-18]。J6結(jié)構(gòu)表征如下，1H NMR (400 MHz，DMSO-d6)：δ 1.08 (dd，J=22.2 Hz，6.5 Hz)，1.23～1.28 (m)，2.63 (s)，3.02 (s)，3.86 (s，3H)，6.12 (s，2H)，6.90 (dd，J=12.1 Hz，2.1 Hz，1H)，7.06 (d，J=8.0 Hz，1H)，7.47 (d，J=9.2 Hz，1H)，7.85 (br，2H)，7.98～8.02 (m，2H)。HRMS (ESI positive)m/z calcd for C22H23N2O4(M+1)：379.165 8，found 379.166 0(圖1)。

圖1 先導(dǎo)物J6的氫譜(A)和高分辨質(zhì)譜(B)

耐藥白念珠菌103、白念珠菌SC5314、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、熱帶念珠菌、新生隱球菌菌株來自于上海市長海醫(yī)院檢驗(yàn)科。FLC(美國Sigma公司)；二甲基亞砜、碳酸氫鈉及氫氧化鈉(天津市天力化學(xué)試劑有限公司)；蛋白胨(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；葡萄糖(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；3-(N-嗎啡啉)丙磺酸/MOPS(上海源葉生物)；RPMI 1640(美國Gibco公司)；流式細(xì)胞儀(美國Beckman公司)。

1.2 方法

1.2.1 微量液基稀釋法 將實(shí)驗(yàn)各菌株培養(yǎng)過夜，RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整菌濃度至(1×103～5×103)/mL，混勻。取無菌96孔板，每排1號(hào)孔加等量RPMI 1640液體培養(yǎng)基作空白對(duì)照，12號(hào)孔不加藥物作陽性對(duì)照。對(duì)2～11號(hào)孔進(jìn)行倍比稀釋，孔中DMSO的含量均低于10 mL/L。35 ℃恒溫培養(yǎng)，于24 h進(jìn)行觀察記錄，得對(duì)應(yīng)最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)。上述實(shí)驗(yàn)均平行操作兩次，當(dāng)觀察所得MIC值能準(zhǔn)確重復(fù)或只差一個(gè)濃度時(shí)視為有效結(jié)果，并取較高濃度為最終確定值，否則重新實(shí)驗(yàn)直到數(shù)據(jù)符合要求。

1.2.2 生長實(shí)驗(yàn) 取各等量稀釋菌懸液裝入玻璃管，每管分別加不同藥物，F(xiàn)LC的最終作用濃度為MIC值，J6最終藥物濃度為1/2 MIC、MIC、2 MIC，空白組加等體積的DMSO，35 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，拍照記錄。

1.2.3 時(shí)間-殺菌曲線實(shí)驗(yàn) 挑取白念珠菌克隆培養(yǎng)過夜。離心收集菌體，PBS洗滌，RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整菌濃度至105/mL。將菌液分裝，加不同濃度的化合物，振搖培養(yǎng)，不同時(shí)間點(diǎn)取出菌液，用PBS稀釋不同的濃度，取稀釋液分別涂鋪于沙氏葡萄糖瓊脂平板，35 ℃，靜置培養(yǎng)48 h后，數(shù)克隆數(shù)并計(jì)算菌落形成數(shù)(colony forming units，CFU)的數(shù)目。

1.2.4 菌絲形成實(shí)驗(yàn) 挑取白念珠菌克隆培養(yǎng)過夜。離心去上清，PBS洗3次。用含100 mL/L FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸，調(diào)整菌終濃度為106/mL，取1 mL于6孔板，加藥混勻，37 ℃靜置培養(yǎng)，于3 h后觀察并拍照。

1.2.5 ROS實(shí)驗(yàn) 采用2’，7’-二氯熒光素二乙酸酯(2’,7’-dichlorofluorescein diacetate，DCFH-DA)測(cè)量真菌細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)。在35 ℃和200 r/min條件下，白念珠菌(106/mL)暴露于化合物J6(18.9 mg/L、37.8 mg/L)中培養(yǎng)3 h。使用PBS洗滌3次，將10 μmol/L DCFH-DA染料加入細(xì)胞懸浮液中避光孵育1 h。采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行ROS檢測(cè)。

1.2.6 細(xì)胞膜通透性實(shí)驗(yàn) 挑選白念珠菌克隆培養(yǎng)過夜。隨后，離心去除上清液，并使用PBS洗滌3次。將菌液的濃度調(diào)整為107/mL，并加入10 μmol/L鈣黃綠素乙酰氧基甲酯孵育2 h。孵育結(jié)束后，再次使用PBS洗滌3次，并將菌液濃度調(diào)整為106/mL。分別加入J6(18.9 mg/L和37.8 mg/L)、FLC(1 mg/L)，空白組不加藥物，并繼續(xù)孵育3 h。離心收集菌株，用PBS洗滌3次，并用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.7 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 挑取白念珠菌克隆培養(yǎng)過夜。將菌按照1∶100的比例轉(zhuǎn)移至新鮮酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基或含有J6(濃度分別為18.9、37.8 mg/L)的培養(yǎng)基中，在35 ℃和200 r/min條件下培養(yǎng)。FLC(1 mg/L)為陽性對(duì)照。離心收集菌株，PBS清洗3次。加入蝸牛酶37 ℃孵育1 h，離心去除上清，繼續(xù)用PBS清洗兩次。用細(xì)胞凋亡試劑盒進(jìn)行處理，細(xì)胞上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.8 CCK-8法檢測(cè)J6對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的毒性 采用CCK-8法測(cè)試化合物J6對(duì)人胚腎細(xì)胞293T的細(xì)胞毒性。96孔板每孔加入濃度為8×104/mL的293T細(xì)胞懸液100 μL，置37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。24 h后，吸棄上層培養(yǎng)液，加入含有不同濃度J6的培養(yǎng)液和對(duì)照品液，100 μL/孔，37 ℃培養(yǎng)72 h。隨后每孔加入CCK-8 10 μL，置培養(yǎng)箱內(nèi)，1 h后用MK-2全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)A450 nm值，計(jì)算半數(shù)抑制濃度IC50。

2 結(jié)果

2.1 初步篩選評(píng)價(jià)化合物J6的抗真菌活性

對(duì)化合物庫中的化合物進(jìn)行初步體外抗真菌活性篩選，篩選藥物濃度為100 μmol/L。以FLC耐藥白念珠菌103和敏感白念珠菌SC5314為受試菌株，F(xiàn)LC(30.6 mg/L)為陽性對(duì)照藥。篩選結(jié)果表明，β-雙咔啉類生物堿、青蒿素衍生物和吲哚酮螺環(huán)類衍生物在100 μmol/L濃度下均未表現(xiàn)出抗真菌活性，僅2-芳基-4-取代喹啉類化合物J6表現(xiàn)出抗真菌活性。且研究標(biāo)目化合物J6對(duì)耐藥白念珠菌103和白念珠菌SC5314都呈陽性，表明37.8 mg/L J6對(duì)這兩種真菌都具有明顯抑制活性。FLC在30.6 mg/L的濃度下僅對(duì)白念珠菌SC5314表現(xiàn)明顯抑制活性。

2.2 喹啉類化合物J6對(duì)7種真菌的作用

由表1可知，化合物J6對(duì)敏感白念珠菌SC5314和熱帶念珠菌的MIC值均為18.9 mg/L，對(duì)克柔念珠菌、新生隱球菌和耐藥白念珠菌103的MIC值均為37.8 mg/L。由結(jié)果可知，化合物J6對(duì)5種真菌(白念珠菌SC5314、克柔念珠菌、新生隱球菌、熱帶念珠菌和耐藥白念珠菌103)具有抑制活性，其MIC≤37.8 mg/L。其中J6對(duì)耐藥白念珠菌103和克柔念珠菌的抑制活性明顯優(yōu)于FLC。

表1 化合物J6對(duì)7種真菌的MIC值 (mg/L)

2.3 喹啉類化合物J6對(duì)真菌生長的影響

以J6為受試藥物，以FLC為陽性對(duì)照藥，以白念珠菌SC5314、熱帶念珠菌、克柔念珠菌、新生隱球菌為受試菌株，進(jìn)行了生長實(shí)驗(yàn)。對(duì)于白念珠菌SC5314，隨著J6濃度增加，J6作用后的菌液澄清度由濁到清，說明隨著J6濃度升高，其抑菌活性越好。對(duì)于熱帶念珠菌、克柔念珠菌以及新生隱球菌，1/2 MIC和MIC的J6作用后的菌液仍然澄清，說明J6對(duì)熱帶念珠菌、克柔念珠菌以及新生隱球菌3種菌的生長均具有抑制作用(圖2)。

FLC：氟康唑；MIC：最小抑菌濃度。圖2 不同濃度的J6對(duì)4種真菌生長的影響

2.4 喹啉類化合物J6對(duì)4種真菌存活的影響

2.4.1 喹啉類化合物J6對(duì)白念珠菌存活的影響 在臨床治療中，F(xiàn)LC通常只具有抑制真菌生長的作用，而缺乏對(duì)真菌的殺菌活性[19]。這種情況導(dǎo)致了患者長期接受FLC治療后出現(xiàn)快速耐藥性的問題，特別是在艾滋病患者等免疫系統(tǒng)受損的人群中更為突出。因此，發(fā)現(xiàn)新型的抗真菌藥物，特別是具有殺真菌活性的藥物，對(duì)于預(yù)防和減少耐藥性真菌的出現(xiàn)具有積極的意義。這將有助于提高真菌感染的治療效果，并為艾滋病患者等免疫受損人群提供更有效的治療選擇。因此，本研究通過時(shí)間-殺菌曲線實(shí)驗(yàn)測(cè)試化合物J6是否具有殺真菌活性。以白念珠菌SC5314為受試菌株，以FLC和空白組為對(duì)照組。為降低活性差異產(chǎn)生的影響，F(xiàn)LC和化合物J6的測(cè)試濃度都以MIC值為標(biāo)準(zhǔn)。FLC測(cè)試濃度為1 mg/L，為4倍MIC值?；衔颙6的測(cè)試濃度選取1/2 MIC(9.5 mg/L)、MIC(18.9 mg/L)和2 MIC(37.8 mg/L)。菌液初始濃度為1.03×105CFU/mL，培養(yǎng)24 h后，空白組中的存活菌落數(shù)為2.7×108CFU/mL；當(dāng)18.9 mg/L的J6作用24 h后，存活菌落數(shù)為4.1×106CFU/mL，比空白組的存活菌落數(shù)減少了65.8倍；當(dāng)37.8 mg/L的J6作用24 h后，存活菌落數(shù)為3.6×106CFU/mL，比空白組存活菌落數(shù)減少了75.0倍(圖3)。這說明J6≥18.9 mg/L濃度時(shí)能抑制白念珠菌的生長。FLC處理組24 h后存活菌落數(shù)與空白對(duì)照組相當(dāng)，表明在1 mg/L濃度下，F(xiàn)LC不能有效抑制真菌的生長。

FLC：氟康唑。圖3 化合物J6作用于白念珠菌SC5314的時(shí)間-殺菌曲線

2.4.2 喹啉類化合物J6對(duì)3種真菌存活的影響 由表2可知，在對(duì)熱帶念珠菌的存活影響實(shí)驗(yàn)中，菌液初始濃度為1.0×105CFU/mL，培養(yǎng)24 h后，空白組菌落數(shù)為1.4×107CFU/mL；9.5 mg/L的J6作用24 h后，存活菌落數(shù)為1.4×105CFU/mL，與空白組相比下降了100倍；18.9 mg/L的J6作用24 h后，存活菌落數(shù)為3.1×105CFU/mL?？芍狫6≥9.5 mg/L濃度時(shí)能抑制熱帶念珠菌的生長。

表2 化合物J6作用3種真菌24 h后的存活菌落數(shù) (CFU/mL)

在對(duì)克柔念珠菌的存活影響實(shí)驗(yàn)中，菌液初始濃度為6.3×104CFU/mL，培養(yǎng)24 h后，空白組菌落數(shù)為9.2×107CFU/mL；18.9mg/L的J6作用24 h后，存活菌落數(shù)為9.0×106CFU/mL；37.8 mg/L的J6作用24 h后，存活菌落數(shù)為2.0×106CFU/mL，與空白組相比下降了約46倍?？芍狫6≥18.9 mg/L濃度時(shí)能抑制克柔念珠菌的生長。

在對(duì)新生隱球菌的存活影響實(shí)驗(yàn)中，菌液初始濃度為9.4×104CFU/mL，培養(yǎng)24 h后，空白組菌落數(shù)為5.0×107CFU/mL；18.9 mg/L的J6作用24 h后，存活菌落數(shù)為2.4×104CFU/mL，37.8 mg/L的J6作用24 h后，存活菌落數(shù)為3.8×104CFU/mL，與空白組相比下降了約1 000倍，并且比起始菌落數(shù)也有所減少?？芍狫6≥18.9 mg/L濃度時(shí)能明顯抑制新生隱球菌的生長，并且還表現(xiàn)殺菌活性。

2.5 喹啉類化合物J6對(duì)白念珠菌菌絲形成的影響

白念珠菌表現(xiàn)多種形態(tài)，如酵母態(tài)、假菌絲態(tài)和菌絲形態(tài)。其中，菌絲形態(tài)在感染的早期真菌細(xì)胞穿透人體上皮和內(nèi)皮細(xì)胞，引起機(jī)體損傷。此外，菌絲還能形成生物被膜，這對(duì)真菌的致病性至關(guān)重要，并使得標(biāo)準(zhǔn)抗真菌治療具有高度的抗藥性。9.5、18.9、37.8 mg/L的J6作用白念珠菌3 h后，雖然有部分菌出現(xiàn)很短的菌絲，但大部分依然保持著酵母態(tài)。FLC在1 mg/L的情況下，不能有效抑制真菌的菌絲形成(圖4)。結(jié)果說明，化合物J6能夠有效抑制白念珠菌菌絲的形成，這提示該化合物可能對(duì)耐藥真菌感染具有良好的治療效果。

A：空白組；B：1 mg/L FLC；C：9.5 mg/L J6；D：18.9 mg/L J6；E：37.8 mg/L J6?！?00。圖4 化合物J6對(duì)白念珠菌SC5314菌絲形成的影響

2.6 喹啉類化合物J6對(duì)白念珠菌ROS水平的影響

細(xì)胞內(nèi)ROS水平在觸發(fā)細(xì)胞凋亡中起重要作用。為探討化合物J6對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響，用不同濃度的J6處理白念珠菌3 h后，加入染料DCFH-DA，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化。DCFH-DA可以被細(xì)胞內(nèi)ROS氧化成熒光產(chǎn)物2’，7’-二氯熒光素，進(jìn)而通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)以定量細(xì)胞內(nèi)ROS水平。白念珠菌經(jīng)18.9、37.8 mg/L J6作用3 h后，其細(xì)胞內(nèi)的ROS水平與空白組相比明顯升高(圖5)，說明化合物J6能增加白念珠菌細(xì)胞內(nèi)ROS水平，從而觸發(fā)細(xì)胞凋亡。

2.7 喹啉類化合物J6對(duì)白念珠菌細(xì)胞膜通透性的影響

白念珠菌經(jīng)18.9、37.8 mg/L J6作用3 h后，其菌細(xì)胞內(nèi)的鈣黃綠素?zé)晒庵蹬c空白組相比，明顯降低(P<0.01)，與FLC組相當(dāng)，說明化合物J6能增加白念珠菌細(xì)胞膜的通透性(圖6)。

bP<0.01 vs 空白組。圖6 化合物J6對(duì)白念珠菌SC5314細(xì)胞膜通透性的影響

2.8 喹啉類化合物J6對(duì)白念珠菌細(xì)胞凋亡的影響

Annexin V是一種鈣離子依賴的磷脂結(jié)合蛋白，它能夠與細(xì)胞凋亡早期發(fā)生的細(xì)胞膜外翻的磷脂酰絲氨酸結(jié)合，從而廣泛用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡。白念珠菌經(jīng)18.9、37.8 mg/L J6作用后，發(fā)生凋亡的細(xì)胞比例分別為18.74%和27.08%，明顯高于空白組(P<0.01)，與FLC組相當(dāng)(凋亡率為22.54%)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，化合物J6可誘導(dǎo)白念珠菌發(fā)生凋亡(圖7)。

2.9 喹啉類化合物J6對(duì)人胚腎細(xì)胞的毒性

為評(píng)價(jià)化合物J6對(duì)真菌的選擇性和對(duì)哺乳動(dòng)物的潛在毒性，采用CCK-8法測(cè)試了J6對(duì)人胚腎細(xì)胞293T的細(xì)胞毒性。化合物J6對(duì)293T細(xì)胞的IC50約為48.15 mg/L，表明該化合物對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表現(xiàn)一定的毒性，需開展后續(xù)的結(jié)構(gòu)優(yōu)化，進(jìn)一步提高抗真菌的選擇性(圖8)。

圖8 化合物J6對(duì)人胚腎細(xì)胞293T的細(xì)胞毒性

3 討論

近年來，由于抗真菌藥物數(shù)量有限和日益嚴(yán)重的真菌耐藥性，深部真菌感染的發(fā)生率和死亡率持續(xù)上升[20-21]。同時(shí)，研究表明深部真菌感染在冠狀病毒患者中普遍存在，并與高死亡率密切相關(guān)[22-24]，引起了全球范圍內(nèi)的廣泛關(guān)注。而多重耐藥超級(jí)真菌耳念珠菌的出現(xiàn)和廣泛傳播進(jìn)一步加劇了對(duì)新型抗真菌藥物研發(fā)的緊迫性[25-26]。目前，臨床上應(yīng)用的抗真菌藥物有已知的作用靶點(diǎn)，如FLC和伊曲康唑作用于真菌CYP-51，卡泊芬凈和米卡芬凈作用于β-1，3-葡聚糖合酶，急需研發(fā)具有新作用機(jī)制的抗真菌藥物[4，27-30]。喹啉類化合物在藥物發(fā)現(xiàn)與研究中占有重要地位，已廣泛用于臨床腫瘤、細(xì)菌及寄生蟲感染的治療。此外，研究發(fā)現(xiàn)喹啉類化合物還表現(xiàn)較好的體外抗真菌活性，但鮮有化合物報(bào)道抗真菌分子機(jī)制和體內(nèi)活性。IRFAN等[31]報(bào)道了一類含有1，2，3-三氮唑側(cè)鏈的喹啉類化合物表現(xiàn)較好的體外抗真菌活性，其中活性最優(yōu)的化合物對(duì)白念珠菌的IC50為0.044 mg/L，并表現(xiàn)殺真菌活性。DELATTIN等[32]報(bào)道了2，6-雙取代喹啉類化合物表現(xiàn)較好的殺真菌活性，最小殺菌濃度為6.25～12.50 μmol/L。已有文獻(xiàn)報(bào)道喹啉類化合物能夠抑制真菌細(xì)胞膜蛋白H+ATP酶[31]、羊毛甾醇14α去甲基化酶[33]的活性，但分子靶點(diǎn)的驗(yàn)證還有待深入。本研究通過對(duì)內(nèi)部化合物庫進(jìn)行體外抗真菌活性篩選，發(fā)現(xiàn)具有2-芳基-4-取代喹啉結(jié)構(gòu)的化合物J6表現(xiàn)廣譜的抗真菌活性，并能明顯抑制真菌的生長和菌絲的形成，甚至對(duì)新生隱球菌表現(xiàn)殺菌活性。初步的機(jī)制研究顯示，J6可增加真菌細(xì)胞膜通透性和細(xì)胞內(nèi)ROS水平，從而誘導(dǎo)真菌細(xì)胞發(fā)生凋亡。但化合物J6對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表現(xiàn)出一定的細(xì)胞毒性，還需開展深入的結(jié)構(gòu)優(yōu)化，進(jìn)一步提高抗真菌活性和選擇性。