魏 朝，姜 茹，王平安，張東旭，鄭志兵，劉雪英

1空軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系藥物化學(xué)與藥物分析學(xué)教研室，陜西 西安 710032；2軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，北京 100850)

神經(jīng)性毒劑(如沙林、塔崩等)和有機(jī)磷農(nóng)藥(如對氧磷、敵敵畏等)同屬有機(jī)磷類毒劑(organophosphate agents，OP；圖1A)，嚴(yán)重威脅人類生命健康[1-3]。OP能和乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AChE)活性位點(diǎn)關(guān)鍵的絲氨酸羥基反應(yīng)形成穩(wěn)定的磷酯鍵，使AChE長時(shí)間失活，無法正常水解乙酰膽堿，進(jìn)而引發(fā)肌肉痙攣、呼吸抑制、癲癇以至死亡等中毒癥狀[4]。重活化劑能斷裂中毒酶的磷脂鍵，重新恢復(fù)AChE活性，可從根本上發(fā)揮解毒作用[5-6](圖1B)。但是目前臨床使用的重活化劑均為季銨鹽肟類化合物，它們可在外周發(fā)揮良好的解毒能力，但因其脂溶性差，難以透過血腦屏障發(fā)揮中樞解毒能力，嚴(yán)重影響救治效率[7]。非季銨鹽類重活化劑因脂溶性提高，有望通過血腦屏障發(fā)揮中樞解毒作用[8-9]。目前國內(nèi)外已經(jīng)報(bào)道了一系列非季銨鹽肟類重活化劑[10-16]，并基于AChE結(jié)構(gòu)開發(fā)了多種具有雙位點(diǎn)結(jié)合特征的重活化劑[17-25]，但均未突破現(xiàn)有季銨鹽肟類重活化劑存在的瓶頸。

A：幾類常見有機(jī)磷毒劑及常用重活化劑的結(jié)構(gòu)；B：肟類重活化劑的重活化劑機(jī)制。OP：有機(jī)磷類毒劑；AChE：乙酰膽堿酯酶。圖1 常見有機(jī)磷毒劑、常用重活化劑的結(jié)構(gòu)及肟類重活化劑的重活化劑機(jī)制

近年國外課題組報(bào)道了一類以ADOC為代表的非肟類重活化劑[26-27]，發(fā)現(xiàn)ADOC能一定程度保護(hù)對氧磷染毒小鼠[28-29]，但其對神經(jīng)性毒劑如沙林、維?？怂沟慕舛灸芰σ话?。前期本課題組同樣發(fā)現(xiàn)了一類具有曼尼希堿結(jié)構(gòu)的非肟類重活化劑(L6R1和L10R1，圖2A)對沙林和維?？怂怪卸続ChE表現(xiàn)出較好重活化能力，L10R1在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中對沙林中毒小鼠表現(xiàn)出和HI-6相當(dāng)?shù)慕舛拘?，且小鼠存活質(zhì)量甚至優(yōu)于HI-6[30]。通過分子對接，發(fā)現(xiàn)這類非肟類重活化劑通過一種雙位點(diǎn)結(jié)合的方式與AChE相互作用，而曼尼希堿結(jié)構(gòu)在接近活性中心位置發(fā)揮作用(圖2B～C)，其很可能是構(gòu)建有效重活化劑的關(guān)鍵基團(tuán)。

A：L6R1與L10R1結(jié)構(gòu)式；B：L6R1與AChE的分子對接模擬圖；C：L10R1與AChE的分子對接模擬圖。AChE：乙酰膽堿酯酶。圖2 非肟類重活化劑及其與中毒AChE的分子對接模擬圖

本研究擬通過基于片段的藥物分子設(shè)計(jì)策略，根據(jù)L6R1和L10R1結(jié)構(gòu)特征，選取系列可能與AChE外周位點(diǎn)結(jié)合的活性芳香片段，如磺胺、噻唑類衍生物等，并進(jìn)一步通過生物電子等排原理進(jìn)行結(jié)構(gòu)衍生化[如將曼尼希堿中N，N-二甲基替換為四氫吡咯(R2部分)、將芳香仲胺甲基化(R3部分)，圖3]，構(gòu)建系列含有曼尼希堿結(jié)構(gòu)的非肟類重活化劑。經(jīng)活性篩選發(fā)現(xiàn)，引入噻唑結(jié)構(gòu)的L49R1表現(xiàn)出廣譜且高效解毒能力，其重活化效能和前期發(fā)現(xiàn)的L10R1相當(dāng)，為開發(fā)更高效全新一代重活化劑奠定了基礎(chǔ)。

圖3 基于片段藥物設(shè)計(jì)策略設(shè)計(jì)的非肟類重活化劑及其代表L49R1

1 材料與方法

1.1 材料

所有合成所用試劑為化學(xué)純或分析純，購自安耐吉化學(xué)或泰坦科技股份有限公司；核磁共振采用Bruker ARX-400核磁共振儀測定，質(zhì)譜采用Agilent 1100四級桿液質(zhì)聯(lián)用儀測定。AChE和活性測試所需的碘代硫代乙酰膽堿(S-acetylthiocholine iodide，ATCh)及5，5’-二硫雙(2-硝基苯甲酸)[5，5’-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)，DTNB]購自Sigma-Aldrich公司，所用有機(jī)磷毒劑來自于軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，吸光度采用SYNERGY酶標(biāo)儀測定。

1.2 方法

1.2.1 目標(biāo)化合物的合成 通用合成路線見圖4。

條件和試劑：(a)異丙醇，多聚甲醛，二乙胺，濃鹽酸，回流，10 h，65%；(b)碘，5 A分子篩，四氫呋喃/甲醇，50 ℃，36%～98%；(c)甲醛，氰基硼氫化鈉，2 mol/L鹽酸二氯甲烷/甲醇，45%～69%。圖4 非肟類目標(biāo)化合物的通用合成路線

以對羥基苯甲醛1為起始原料，與多聚甲醛和二乙胺在濃鹽酸中發(fā)生曼尼希反應(yīng)得到中間體R1，R1再與不同類型的芳香伯胺(如L31)在碘作催化劑、二氫吡啶作還原劑條件下發(fā)生還原胺化反應(yīng)得到系列相應(yīng)目標(biāo)產(chǎn)物(如L31R1)。依照相同方法，將第一步反應(yīng)中二乙胺替換為四氫吡咯，則可得到R2系列化合物(如L32R2)。以上所得芳香仲胺類目標(biāo)化合物(如L32R2)和甲醛水溶液，在酸性條件下，以氰基硼氫化鈉為還原劑，發(fā)生還原胺化反應(yīng)，可得到甲基化芳香伯胺類目標(biāo)化合物(如L32R2-2)。

以下為中間體R1和目標(biāo)化合物L(fēng)31R1、L32R2及L32R2-2的具體合成方法及結(jié)構(gòu)確證數(shù)據(jù)。其余化合物參照R1、L31R1及L32R2-2合成方法進(jìn)行合成。

3-(二乙基氨基)甲基-4-羥基苯甲醛 (R1)：在1 L圓底瓶中加入對羥基苯甲醛(化合物1，3.6 g，29.5 mmol)，多聚甲醛(1.28 g，42.6 mmol)，二乙胺 (3.3 g，45.1 mmol)和25 mL異丙醇，再加入催化量的濃鹽酸 (0.3 mL)，回流2 h。降至室溫，所得反應(yīng)液直接柱層析 (DCM/MeOH = 20∶1)，得產(chǎn)品 R1 (4.1 g，65%)，淺黃色油狀物。1H NMR (CDCl3，400 MHz)δ (ppm)12.22～11.55 (m，1H)，9.78 (s，1H)，7.67 (dd，J=8.3，1.9 Hz，1H)，7.53 (d，J=1.9 Hz，1H)，6.86 (d，J=8.3 Hz，1H)，3.84 (s，2H)，2.64 (q，J=7.2 Hz，4H)，1.12 (t，J=7.2 Hz，6H)。

4-((3-((二乙基氨基)甲基)-4-羥基芐基)氨基)苯磺酰胺(L31R1)：50 mL圓底瓶中，加入L31 (0.35 g，2.0 mmol)，R1 (0.45 g，2.2 mmol)和甲醇8 mL，四氫呋喃8 mL，再加入0.80 g5A 分子篩，常溫?cái)嚢?5 min后，依次加入二氫吡啶 (1.06 g，4.2 mmol)和單質(zhì)碘 (0.50 g，1.97 mmol)。 升溫至 50 ℃ 攪拌 6 h，抽濾，所得濾液直接拌樣，柱層析(DCM/MeOH = 15∶1)得產(chǎn)品L31R1 (0.70 g，96%)，淺棕色固體。1H NMR (400 MHz，DMSO)δ 10.25～9.61 (s，1H)，8.48 (s，1H)，7.86 (s，1H)，7.61 (d，J= 7.8 Hz，1H)，7.22 (dd，J= 14.5，7.4 Hz，4H)，6.83 (d，J= 8.1 Hz，1H)，6.63 (d，J= 8.4 Hz，1H)，6.53 (t，J= 7.4 Hz，1H)，4.25 (d，J= 5.0 Hz，2H)，4.03 (s，2H)，3.02～2.65 (m，4H)，1.15 (t，J= 6.9 Hz，6H)。HRMS (ESI+)m/zcalcd for C18H26N3O3S+364.169 5 found 364.169 0 Da.

N-((4-((4-羥基-3-(吡咯烷-1-基甲基)芐基)氨基)苯基)磺?；?乙酰胺(L32R2)：采用和制備L31R1相似方法，以L32 和 R2為原料，得目標(biāo)產(chǎn)品(0.87 g，79%)，白色固體。1H NMR (400 MHz，DMSO)δ 11.58 (s，1H)，8.32 (s，1H)，8.18 (d，J= 4.5 Hz，2H)，7.47 (s，1H)，7.28 (s，1H)，6.85 (d，J= 4.5 Hz，2H)，3.70 (s，2H)，3.46～3.21 (m，4H)，2.70～2.51 (m，4H)。HRMS (ESI+)m/zcalcd for C20H26N3O4S+404.164 4 found 404.163 9 Da.

N-((4-((4-羥基-3-(吡咯烷-1-基甲基)芐基)(甲基)氨基)苯基)磺?；?乙酰胺(L32R2-2)：50 mL圓底瓶中，加入L32R2 (0.20 g，0.5 mmol)和 20 mL CH2Cl2，常溫?cái)嚢?，再加?370 mL/L 甲醛水溶液 (0.40 g，4.9 mmol)，1 mL 2 mol/L鹽酸溶液和 0.10 g NaBH3CN (0.10 g，1.5 mmol)，常溫繼續(xù)攪拌2 h。加入15 mL水，分液，取有機(jī)相，有機(jī)相再用10 mL飽和食鹽水洗，然后柱層析 (DCM/MeOH = 20∶1，1 mL/L氨水)得目標(biāo)產(chǎn)品 L32R2-2 (0.12 g，57%)，白色固體。1H NMR (400 MHz，DMSO)δ 11.58 (s，1H)，8.32 (s，1H)，8.18 (d，J=4.5 Hz，2H)，7.47 (s，1H)，7.28 (s，1H)，6.85 (d，J=4.5 Hz，2H)，3.70 (s，2H)，3.46～3.21 (m，4H)，2.70～2.51 (m，4H). HRMS (ESI+)m/zcalcd for C21H28N3O4S+418.180 1 found 418.179 6 Da.

1.2.2 目標(biāo)化合物對AChE抑酶率測試 在測試目標(biāo)化合物重活化能力之前，首先測試該系列化合物對AChE的抑酶率，以分析該系列化合物和酶的結(jié)合能力及其對重活化能力的影響，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道及前期研究通用方法，本實(shí)驗(yàn)采用DTNB法在96孔板中測試已合成目標(biāo)化合物對AChE的抑酶率[31]；所制備化合物首先用100 mL/L乙酸水溶液配置成濃度為10 mmol/L的原液，再用PBS (0.1 mol/L，pH值=7.4)稀釋至所需要的濃度(通過對照試驗(yàn)證明乙酸對活性測試不產(chǎn)生影響)。

抑酶實(shí)驗(yàn)具體操作方法如下：①將AChE原液(溶于20 mmol/L HEPES，pH值=8.0，contain 1 mL/L RITON X-100)用PBS(0.1 mol/L，pH值=7.4，1 g/L BSA)稀釋2 000倍，取20 μL加入96孔板，再加入20 μL所制備化合物溶液(最終濃度為1、4、20、100、200、400 μmol/L，每個(gè)濃度設(shè)置兩個(gè)平行組)，在25 ℃抑酶20 min，同時(shí)設(shè)置正常酶對照組(不加入藥物，替換為20 μL PBS)和空白對照組(不加入稀釋酶，替換為20 μL PBS)；②加入30 μL ATCh (3.0 mmol/L，pH值=7.4 PBS)，25 ℃反應(yīng)30 min；③向上面96孔板中再加入150 μL DTNB (0.75 mmol/L，pH值=7.0 PBS)，用吹風(fēng)機(jī)除去氣泡，立即測A412 nm值。

酶活性率計(jì)算公式：酶活性率(%)=100×(S-B)/(P-B)。S為測試組A值，B為空白組A值，P為正常酶組A值。

在得到不同化合物不同濃度條件下酶活性率之后，IC50值可通過GraphPad Prism 5 軟件并依據(jù)以下公式進(jìn)行非線性擬合得到：酶活性率(%)=100×IC50/(IC50+c)，c為化合物濃度。

1.2.3 目標(biāo)化合物對OP中毒AChE重活化率測試 同樣采用DTNB法測試已合成目標(biāo)化合物對OP中毒AChE的重活化率，陽性對照為HI-6和雙復(fù)磷。首先測試所有化合物在1×10-4mol/L時(shí)對維埃克斯、沙林和塔崩抑制AChE的重活化率，然后挑選重活化能力好的化合物再測試對梭曼、對氧磷、對硫磷和敵敵畏中毒酶的重活化率。

用1.2.2中抑酶測試類似方法摸索OP用量，確保使所用OP濃度抑酶率在90%～97%之間，最終確定不同OP濃度(維埃克斯：1×10-8mol/L，沙林：2×10-7mol/L，塔崩：2×10-8mol/L，梭曼：1×10-8mol/L，對氧磷：2×10-6mol/L，對硫磷：5×10-6mol/L，敵敵畏：1×10-5mol/L)。毒劑用量確定后，開展重活化率測試：①使用1.2.2中抑酶測試類似方法將AChE原液稀釋，取20 μL于96孔板中，加入相應(yīng)OP 20 μL，于25 ℃抑酶5～15 min (維埃克斯、沙林、塔崩、梭曼抑酶5 min，對氧磷、對硫磷、敵敵畏抑酶15 min)；②將提前配制好的不同化合物20 μL加入上述中毒酶中(藥物終濃度為100 μmol/L)，25 ℃重活化30 min；③加入30 μL ATCh (3.0 mmol/L，pH值=7.4 PBS)，25 ℃反應(yīng)30 min；④ 向上面96孔板中再加入150 μL DTNB (0.75 mmol/L，pH值=7.0 PBS)，用吹風(fēng)機(jī)除去氣泡，立即測A412 nm值。

以上實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置以下對照組：不加入OP和藥物，替換為PBS，為正常對照組；將藥物替換為PBS，為中毒對照組(N)。重活化率(%)=100×(S-N)/(P-N)，S為不同藥物組測試的A值，P和N分別為正常酶和中毒酶對照組測試的A值。

1.2.4 優(yōu)選化合物對OP中毒AChE重活化速率的測定 在確定了已合成目標(biāo)化合物單一濃度下對OP中毒AChE的重活化率后，進(jìn)一步挑選重活化能力突出的化合物，測試在多個(gè)濃度下和多個(gè)重活化時(shí)間點(diǎn)重活化率，首先計(jì)算出各濃度下表觀反應(yīng)速率常數(shù)kobs，進(jìn)而計(jì)算出其二級重活化速率常數(shù)kr2(kr2是衡量重活化效率的常數(shù)，不受藥物濃度影響，是重活化速率常數(shù)kr和離解常數(shù)KD的比值，KD代表藥物分子和中毒酶的結(jié)合能力，KD越大，表明結(jié)合能力越弱)[32]。

%Reactivation=100×(1-e-kobs×t)

(2)

kobs=kr[R]/(KD+[R])

(3)

kr2=kr/KD

(4)

具體測試方法如下：①使用1.2.2中抑酶測試類似方法將AChE原液稀釋，取20 μL于96孔板中，加入相應(yīng)OP 20 μL，于25 ℃抑酶5～15 min (維?？怂?、沙林、塔崩抑酶5 min，對氧磷、對硫磷、敵敵畏抑酶15 min)；②將提前配制好的不同濃度的優(yōu)選化合物20 μL加入上述中毒酶中，立即加入30 μL ATCh(3.00 mmol/L，pH值=7.4 PBS)和150 μL DTNB (0.75 mmol/L，pH值=7.0 PBS)，用吹風(fēng)機(jī)除去氣泡，立即測A412 nm值，每間隔5 min或10 min測一次，持續(xù)測試120 min。設(shè)置和重活化率實(shí)驗(yàn)相同的正常對照組和中毒對照組，依據(jù)相同方法計(jì)算每個(gè)濃度不同重活化時(shí)間點(diǎn)的重活化率，用GraphPad Prism 5軟件非線性擬合得到不同濃度下表觀反應(yīng)速率常數(shù)kobs，通過不同濃度下kobs非線性擬合得到kr和KD，最終計(jì)算得到kr2。

2 結(jié)果

2.1 已合成的目標(biāo)化合物對AChE抑酶能力

參照1.2.1中通用合成方法，選取相應(yīng)的苯胺類合成原料，共成功構(gòu)建了全新結(jié)構(gòu)的非肟類重活化劑21個(gè)，所有化合物都經(jīng)1H NMR和高分辨質(zhì)譜完成了結(jié)構(gòu)確證。然后通過1.2.2方法測試了所有已合成目標(biāo)化合物對AChE的抑酶率并計(jì)算出相應(yīng)的IC50(表1)。

表1 目標(biāo)化合物對AChE的IC50及其對維?？怂?、沙林和塔崩中毒AChE的重活化率(重活化時(shí)間30 min)

抑酶結(jié)果顯示，幾乎所有引入磺胺片段(L31～L36)的曼尼希堿類IC50都大于100 μmol/L，未對AChE表現(xiàn)出明顯的抑酶能力；這類化合物中抑酶能力相對較強(qiáng)的是磺胺噻唑類L33R2及L33R2-2，IC50都接近于100 μmol/L。對于鏈接磺胺片段的曼尼希堿類，若將曼尼希堿部分R2的N，N-二乙基替換為四氫吡咯，其抑酶能力有所提升，若進(jìn)一步將芳香仲胺甲基化為芳香叔胺(即R3=Me)，其抑酶能力會進(jìn)一步提升，如L32R2-2、L33R1-2和L33R2-2。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)引入噻唑集團(tuán)的化合物抑酶率一般大于引入噻吩、吡唑等雜環(huán)集團(tuán)的化合物，其中抑酶能力相對較強(qiáng)的是噻唑并哌啶衍生物L(fēng)47R1和硝基噻唑衍生物L(fēng)49R1，其抑酶能力和課題組前期發(fā)現(xiàn)的曼尼希堿類L10R1相當(dāng)。

2.2 已合成目標(biāo)化合物對OP中毒AChE的重活化率

經(jīng)1.2.3方法首先測試了所有化合物在10-4mol/L濃度下對維?？怂?、沙林和塔崩中毒AChE的重活化率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。針對維埃克斯和沙林中毒AChE，硝基噻唑類衍生物L(fēng)49R1和三氮唑類衍生物L(fēng)51R1表現(xiàn)出最好的重活化能力，磺胺類衍生物L(fēng)31R1和噻唑類衍生物L(fēng)46R1次之，其余新構(gòu)建的非肟類化合物重活化能力均較弱(低于30%)。L49R1和L51R1對維?？怂怪卸続ChE重活化率高于我們先前發(fā)現(xiàn)的L10R1，但稍弱于HI-6和雙復(fù)磷；但它們對沙林中毒AChE的重活化率和HI-6相當(dāng)，明顯高于雙復(fù)磷。除了陽性藥雙復(fù)磷，所有化合物對塔崩中毒AChE均未表現(xiàn)出較好重活化能力，但L10R1、L49R1及L51R1表現(xiàn)出相對較高的重活化率，優(yōu)于HI-6。

基于以上重活化率測試結(jié)果，優(yōu)選重活化能力較好的L31R1、L46R1、L49R1和L51R1，進(jìn)一步測試了它們在10-4mol/L濃度時(shí)對梭曼、對氧磷、對硫磷及敵敵畏的重活化率，除了HI-6和雙復(fù)磷，本研究還增加了文獻(xiàn)報(bào)道的對有機(jī)磷農(nóng)藥效果較好的MMB-4為陽性對照，測試結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，除HI-6外，所有化合物對梭曼中毒AChE均未表現(xiàn)出明顯重活化能力，但HI-6對有機(jī)磷農(nóng)藥對氧磷、對硫磷和敵敵畏中毒AChE重活化能力又明顯不足，雙復(fù)磷則表現(xiàn)最佳。在新構(gòu)建的化合物中，L49R1和L51R1是對氧磷和對硫磷中毒AChE的優(yōu)良重活化劑，明顯優(yōu)于L31R1和L46R1，但L51R1重活化能力不及L10R1、L49R1和MMB-4，L49R1則表現(xiàn)最佳，優(yōu)于課題組前期發(fā)現(xiàn)的L10R1，也優(yōu)于MMB-4，但仍不及雙復(fù)磷。對于敵敵畏中毒AChE，所有新合成目標(biāo)化合物重活化能力均表現(xiàn)不佳，最好的L51R1重活化率也低于20%。可見這類含有曼尼希堿結(jié)構(gòu)的非肟類重活化劑并非敵敵畏和梭曼中毒AChE的良好重活化劑，但有可能開發(fā)出對對氧磷和對硫磷中毒優(yōu)于L10R1和MMB-4的新型解毒劑。

表2 優(yōu)選化合物對梭曼、對氧磷、對硫磷和敵敵畏中毒AChE的重活化率(重活化時(shí)間30 min)

2.3 已合成的目標(biāo)化合物對OP中毒AChE的重活化速率

根據(jù)重活化率實(shí)驗(yàn)測試結(jié)果發(fā)現(xiàn)，新構(gòu)建的L49R1和L51R1是維?？怂?、沙林、對氧磷和對硫磷中毒AChE較好的重活化劑，為了進(jìn)一步分析它們的重活化效能，經(jīng)1.2.4方法進(jìn)一步測試了不同濃度L49R1和L51R1對OP中毒酶在不同時(shí)間點(diǎn)的重活化率，進(jìn)而計(jì)算出了其重活化速率常數(shù)(詳見1.2.4)，結(jié)果見表3。

表3 優(yōu)選化合物對維?？怂埂⑸沉?、對氧磷和對硫磷的重活化速率常數(shù)

針對維埃克斯和沙林中毒，選取HI-6和雙復(fù)磷為陽性對照。通過表3可以看到硝基噻唑類衍生物L(fēng)49R1對所測試四種OP中毒酶重活化效率(kr2)明顯優(yōu)于三氮唑類雜環(huán)衍生物L(fēng)51R1。對于維?？怂怪卸久?，L49R1重活化能力不及HI-6和雙復(fù)磷，也只有L10R1的40%左右。對于沙林中毒酶，L49R1重活化能力雖不及HI-6和雙復(fù)磷，但和L10R1相當(dāng)。

因HI-6對有機(jī)磷農(nóng)藥對氧磷和對硫磷在前面測試效果不佳，有機(jī)磷農(nóng)藥中毒選取雙復(fù)磷和MMB-4作為相應(yīng)的陽性對照，通過表3可以看到，雙復(fù)磷對這兩種有機(jī)磷農(nóng)藥中毒AChE重活化效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于其他化合物。值得注意的是，雖然L49R1對對氧磷和對硫磷中毒酶重活化效率(kr2)不及雙復(fù)磷，但明顯優(yōu)于MMB-4和前面研究發(fā)現(xiàn)的曼尼希堿類L10R1，特別是對氧磷中毒情況下，L49R1重活化效率是MMB-4和L10R1的3倍左右，通過表3可以看到，L49R1對對氧磷和對硫磷中毒酶重活化效率(kr2)提升，主要是因?yàn)槠銴D相比L10R1和MMB-4有明顯降低，說明L49R1和OP中毒酶的結(jié)合能力強(qiáng)于后兩者，進(jìn)而提升了其重活化效率(kr2)。

3 討論

AChE重活化劑是針對OP中毒的關(guān)鍵急救藥物[5]，目前已裝備或臨床可用的重活化劑全都是經(jīng)典的季銨鹽肟類，在外周表現(xiàn)出良好的重活化效能，但因其季銨鹽結(jié)構(gòu)特征，難以通過血腦屏障發(fā)揮中樞毒作用[33]，嚴(yán)重影響救治能力，因此開發(fā)非季銨鹽結(jié)構(gòu)的重活化劑是目前的發(fā)展趨勢。人們早期的研究重點(diǎn)是非季銨鹽結(jié)構(gòu)的肟類重活化劑，雖發(fā)現(xiàn)了部分體外重活化能力突出的苗頭化合物，但目前尚未報(bào)道具有高效體內(nèi)解毒能力的該類化合物[18-25]。本課題組前期研究嘗試突破傳統(tǒng)肟類重活化劑的研究范疇，成功發(fā)現(xiàn)了一類具有曼尼希堿結(jié)構(gòu)的化合物，并表現(xiàn)出一定重活化能力，特別是L10R1對沙林中毒小鼠表現(xiàn)出與HI-6相當(dāng)?shù)木戎涡蔥26]，為開發(fā)全新結(jié)構(gòu)類型的非季銨鹽類重活化劑指明了方向。

本研究以前期研究發(fā)現(xiàn)的非肟類重活化劑L10R1為先導(dǎo)，通過分子對接方式分析L10R1與中毒AChE的相互作用關(guān)系，發(fā)現(xiàn)曼尼希堿結(jié)構(gòu)為發(fā)揮活性關(guān)鍵基團(tuán)，與曼尼希堿相連的芳香雜環(huán)則作用于AChE的外周結(jié)合位點(diǎn)，能有效提升重活化能力(圖2)。因此，本研究利用基于片段藥物分子設(shè)計(jì)策略，保留活性的曼尼希堿結(jié)構(gòu)，并引入系列活性芳香片段進(jìn)行篩選，期望其能作用于外周位點(diǎn)，構(gòu)建高活性的新型非肟類重活化劑(圖3)。在此基礎(chǔ)上，我們還通過生物電子等排原理，對曼尼希堿部分和芳香仲胺部分進(jìn)行了初步衍生化，最終成功構(gòu)建了全新含有曼尼希堿結(jié)構(gòu)的非肟類化合物21個(gè)，全部化合物都完成了結(jié)構(gòu)確認(rèn)。

經(jīng)抑酶率實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)新構(gòu)建的目標(biāo)化合物對AChE抑酶能力較弱，只有噻唑并哌啶類L47R1和硝基噻唑類L49R1表現(xiàn)出和L10R1近似的弱抑酶能力(30 μmol/L

重活化率測試實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)曼尼希堿的硝基噻唑和三氮唑并嘧啶酮衍生物(L49R1和L51R1)對維埃克斯、沙林、對氧磷和對硫磷中毒AChE表現(xiàn)出較好重活化率，L49R1活性最佳，但對塔崩、梭曼和敵敵畏等OP中毒酶重活化能力明顯不足。構(gòu)效關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，為曼尼希堿引入活性的磺胺類結(jié)構(gòu)并不能得到高效的重活化劑，硝基噻唑結(jié)構(gòu)或許是構(gòu)建高效重活化劑的更好選擇。

為了進(jìn)一步探究該非肟類化合物的重活化效率，本研究通過動態(tài)監(jiān)測重活化率的方法測試了不同濃度條件下優(yōu)選化合物的重活化速率，進(jìn)一步確認(rèn)L49R1重活化能力強(qiáng)于L51R1，雖然L49R1對維?？怂怪卸久钢鼗罨芰Σ患瓣栃詫φ誏10R1，但對沙林中毒酶重活化能力和L10R1相當(dāng)。令人高興的是，對于有機(jī)磷農(nóng)藥對氧磷和對硫磷中毒AChE，L49R1重活化效率(kr2)明顯優(yōu)于L10R1，這主要得益于其與中毒酶結(jié)合能力的提升(表現(xiàn)為KD降低)。進(jìn)一步分析表3數(shù)據(jù)可發(fā)現(xiàn)，L10R1和L49R1的KD在對氧磷和對硫磷中毒酶重活化實(shí)驗(yàn)中均較低，說明其與中毒酶結(jié)合能力較強(qiáng)。有趣的是，它們抑酶率(IC50)在所有測試化合物中也是最強(qiáng)的，或許抑酶率一定程度上能反映藥物分子和中毒酶的結(jié)合能力。但以上結(jié)論也只能作為參考，因?yàn)長49R1對維埃克斯和沙林中毒酶結(jié)合能力(KD)并不突出，這或許是因?yàn)橹卸久副旧順?gòu)象發(fā)生了變化，從而使藥物分子和AChE的結(jié)合方式也發(fā)生了變化，進(jìn)而影響了藥物與酶的結(jié)合能力。

4 結(jié)束語

綜上所述，本研究通過對前期發(fā)現(xiàn)的非肟類先導(dǎo)L10R1進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，構(gòu)建系列結(jié)構(gòu)多樣的曼尼希堿類化合物，發(fā)現(xiàn)了全新的硝基噻唑衍生物L(fēng)49R1對沙林、維?？怂埂ρ趿?、對硫磷等OP中毒AChE表現(xiàn)出較好的體外重活化能力，進(jìn)一步豐富了高活性非肟類重活化劑的結(jié)構(gòu)類型。鑒于該類化合物為非季銨鹽結(jié)構(gòu)，相比季銨鹽肟類脂溶性更好，其有望表現(xiàn)出更好的體內(nèi)解毒效能，因此，對該類化合物進(jìn)一步優(yōu)化有望開發(fā)出更高效的全新一代重活化劑。