李招招，杜海琛，2，謝 飛，史佳欣，孟賽男，石格格，3，邱玥媛，王昭維，李 萌，張英起，何 磊

1空軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系生物制藥學(xué)教研室，陜西 西安 710032；2解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四○醫(yī)院腫瘤科，甘肅 蘭州 730050；3西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710069)

人體經(jīng)過手術(shù)、燙傷等創(chuàng)傷后，皮膚會(huì)受到一定程度的損傷，而傷口愈合是非常復(fù)雜的生理過程[1]。在常見的燙傷和切口傷中，皮膚會(huì)失去完整性，出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，并伴有各種并發(fā)癥，使患者的病情惡化。因此，開發(fā)一種能促進(jìn)傷口愈合、同時(shí)免受并發(fā)癥影響的藥物，對(duì)各種嚴(yán)重傷口的治療具有重要意義。機(jī)體保護(hù)多肽157(body protection compound 157，BPC157)是從人胃液中分離純化的15個(gè)氨基酸(Gly-Glu-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys-Pro-Ala-Asp-Asp-Ala-Gly-Leu-Val)多肽[2]，Mr 1 419。研究表明，BPC157有利于肌腱損傷、骨折和韌帶損傷的恢復(fù)，并對(duì)肝臟[3]、胰腺[3]、肌肉[4]、角膜[5]、心臟[6]和神經(jīng)[7]組織及器官有顯著的保護(hù)作用。此外，BPC157對(duì)胃、十二指腸、食管、結(jié)腸等消化系統(tǒng)黏膜也具有良好的保護(hù)作用[8-9]。

前期，我們建立了BPC157的固相合成工藝，并在大鼠胃潰瘍模型和皮膚堿燒傷模型中驗(yàn)證了其生物活性[10-11]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)BPC157對(duì)動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)功能均未產(chǎn)生明顯不良影響[12]。我們進(jìn)一步完成了BPC157在SD大鼠和比格犬體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)、組織分布、代謝和藥物排泄以及相關(guān)的體外研究[13]。以往的研究奠定了BPC157在皮膚傷口治療領(lǐng)域中的應(yīng)用基礎(chǔ)，為了擴(kuò)大其適應(yīng)證，本研究評(píng)估了BPC157對(duì)較為常見的燙傷和切割傷的治療作用，證明了BPC157能夠顯著促進(jìn)皮膚燙傷和切割傷的創(chuàng)面愈合，并且具有穩(wěn)定的用藥安全性，為BPC157進(jìn)入臨床應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB/c雄性小鼠70只，6～8周齡，體質(zhì)量20～22 g；SPF級(jí)SD雄性大鼠50只，約6周齡，體質(zhì)量180～220 g；所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。在研究過程中，實(shí)驗(yàn)小鼠和大鼠均飼養(yǎng)在溫度為(25±2)℃的SPF動(dòng)物房中，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)動(dòng)物實(shí)施二氧化碳安樂死。本研究通過了空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(許可證號(hào)：20220505)。

1.1.2 藥物與試劑 BPC157由空軍軍醫(yī)大學(xué)生物制藥學(xué)教研室合成，經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)純度大于99%。重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子凝膠(貝復(fù)新)購自珠海億勝生物制藥有限公司。羥脯氨酸檢測(cè)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。所有ELISA檢測(cè)試劑盒(小鼠和大鼠Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白)均購自江蘇雨桐生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組與造模 小鼠燙傷模型和大鼠切口傷模型實(shí)驗(yàn)均設(shè)模型組、陽性對(duì)照組(外用重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子凝膠300 IU/cm2)、BPC157劑量組(10、20、40 μg/kg)，每組10只。小鼠在本實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房中飼養(yǎng)1周后，開始構(gòu)建皮膚燙傷模型。各組小鼠背部脫毛(2 cm×2 cm)，經(jīng)異氟烷吸入麻醉后，在脫毛處用臺(tái)式超級(jí)恒溫燙傷儀接觸8 s，造成面積為2 cm2的Ⅲ度燙傷。大鼠在本實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房中飼養(yǎng)1周后，開始構(gòu)建皮膚切口損傷模型。大鼠背部脫毛，用3 g/L戊巴比妥鈉溶液按1 mL/100 g劑量腹腔麻醉后，用無菌手術(shù)刀平行于脊柱方向劃一個(gè)4 cm長的皮膚切口，構(gòu)建皮膚切口損傷模型。

1.2.2 給藥方式 小鼠燙傷模型在造模后當(dāng)天，BPC157給藥組通過皮下注射不同劑量BPC157，給藥劑量為0.1 mL/20 g體質(zhì)量，1次/d，連續(xù)給藥7 d；陽性對(duì)照組于創(chuàng)面外用重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子凝膠，劑量300 IU/cm2，1次/d，連續(xù)給藥7 d；模型組皮下注射生理鹽水，0.1 mL/20 g體質(zhì)量，1次/d，連續(xù)給藥7 d。

皮膚切口損傷模型建立后，大鼠肌肉注射不同劑量BPC157藥物，給藥劑量為0.5 mL/200 g體質(zhì)量；陽性對(duì)照組大鼠在創(chuàng)傷表面局部使用劑量為300 IU/cm2的重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子凝膠；模型組按照0.5 mL/200 g體質(zhì)量的劑量，肌肉注射甘露醇。各組均每日給藥1次，連續(xù)給藥7 d。

1.2.3 傷口測(cè)量 在小鼠燙傷模型中，觀察小鼠皮膚燙傷后1、3、5、7 d創(chuàng)面面積，在大鼠切口傷模型中，用透明膜標(biāo)記測(cè)量法觀察大鼠皮膚切口損傷后1、3、5、7 d創(chuàng)面面積，計(jì)算受試藥物組的創(chuàng)面愈合速度。愈合率(%)=[(初面積-終面積)/初面積]×100。

1.2.4 ELISA法檢測(cè)膠原蛋白含量 采用ELISA法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肉芽組織中Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白的水平。在皮膚傷口治療實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，處死動(dòng)物。收集各組的肉芽組織，用0.15 mol/L的氯化鈉洗滌去除血液，制備肉芽組織勻漿進(jìn)行膠原分析。從每組動(dòng)物中分離出肉芽組織勻漿，測(cè)量Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的水平。密封膜后，加入樣品并在37 ℃下孵育60 min。用洗滌溶液洗滌5次后，將板與50 μL鏈霉親和素-HRP在室溫下孵育1 h。然后向每個(gè)孔中加入50 μL染色原溶液A和50 μL染色原溶液B。將溶液輕輕混合并在37 ℃遠(yuǎn)離光線的地方孵育10 min。最后向每個(gè)孔中加入50 μL停止溶液以淬滅反應(yīng)，測(cè)定A450 nm值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品濃度。

1.2.5 羥脯氨酸含量檢測(cè) 羥脯氨酸是膠原蛋白的基本成分，其濃度可反映肉芽組織中膠原蛋白的濃度。各組的肉芽組織在60～70 ℃下干燥24 h，測(cè)定干肉芽組織質(zhì)量。干燥的組織片在6 mol/L鹽酸中120 ℃水解18 h。然后用蒸餾水稀釋裂解液，用6 mol/L氫氧化鈉中和后進(jìn)行氯胺-T氧化20 min。終止反應(yīng)，用分光光度計(jì)測(cè)定A557 nm值。對(duì)所有樣品進(jìn)行3次重復(fù)的實(shí)驗(yàn)，并根據(jù)羥脯氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定羥脯氨酸的含量。

1.2.6 HE染色 對(duì)新形成的皮膚進(jìn)行全深度切除，收集后立即將皮膚組織用100 mL/L中性福爾馬林固定。將組織依次在750、850、950、1 000 mL/L乙醇和二甲苯中脫水，接著將處理后的組織用石蠟包埋，最后將石蠟包埋的組織切成4 μm厚的切片，進(jìn)行常規(guī)HE染色后用顯微鏡觀察。

1.2.7 Masson染色 將各組傷口標(biāo)本石蠟切片脫蠟后用梯度乙醇脫水，將脫水后的玻片依次經(jīng)蘇木精、酸性麗春紅、0.04 mol/L磷鉬酸、苯胺藍(lán)染色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封存。光學(xué)顯微鏡下觀察各組膠原纖維沉積并采集圖像。

1.2.9 體內(nèi)安全性評(píng)價(jià) 將20只小鼠隨機(jī)分為兩組(正常對(duì)照組和BCP157組)。BCP157組皮下注射500 μg/kg的BPC157，1次/d，連續(xù)給藥14 d；正常對(duì)照組注射相同體積生理鹽水，1次/d，連續(xù)給予14 d。在最后一次給藥24 h后收集血液樣本和主要器官組織，以進(jìn)行血液學(xué)和組織化學(xué)分析。血液樣本由日立7080化學(xué)分析儀分析堿性磷酸酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、血尿素氮和肌酐等水平。使用多聚甲醛對(duì)心、肺、肝、脾和腎等主要器官固定48 h，石蠟包埋后做切片染色。

表1 BPC157對(duì)小鼠燙傷模型創(chuàng)面直徑及面積變化的影響

2 結(jié)果

2.1 BPC157加速小鼠皮膚燙傷傷口的愈合

在小鼠燙傷模型中，皮下注射BPC157后，結(jié)果顯示BPC157各劑量組及陽性對(duì)照組在給藥后第3日即可顯著促進(jìn)燙傷創(chuàng)面愈合，給藥7 d后BPC157各劑量組及陽性對(duì)照組皮膚創(chuàng)面面積較模型組明顯縮小(表1，P<0.01)。給藥7 d后BPC157劑量組(10、20、40 μg/kg)及陽性對(duì)照組的創(chuàng)面愈合率分別為41.179%、47.943%、42.867%和38.373%，模型組創(chuàng)面愈合率僅為12.761%，與模型組比較具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。研究提示BPC157各劑量組明顯促進(jìn)傷口愈合。在小鼠燙傷模型中，與模型組相比，BPC157各劑量組膠原蛋白含量、羥脯氨酸含量均顯著增高(P<0.01)，表明BPC157各劑量組的傷口愈合情況明顯好于模型組(圖1)。

A：小鼠皮膚燙傷圖；B：小鼠創(chuàng)面面積；C：小鼠創(chuàng)面愈合率；D：小鼠創(chuàng)面膠原蛋白、羥脯氨酸水平。BPC157：機(jī)體保護(hù)多肽157。aP<0.05，bP<0.01。圖1 BPC157加速小鼠皮膚燙傷傷口的愈合

2.2 小鼠燙傷皮膚組織HE和Masson染色結(jié)果

小鼠皮膚組織的HE和Masson染色結(jié)果顯示，模型組小鼠皮膚表皮及皮膚附屬器壞死，損傷表面被大量急性炎細(xì)胞及壞死物覆蓋，皮下膠原壞死崩解，可見大量炎癥細(xì)胞浸潤，肌層變性壞死，肌層下見急性炎細(xì)胞浸潤，為深Ⅲ度燙傷。與模型組相比，BPC157給藥組表皮及皮膚附屬器不同程度修復(fù)，BPC157給藥組壞死組織邊緣見表皮修復(fù)，肉芽組織增生，皮下纖維組織增生，表皮及皮膚附屬器部分或完全修復(fù)，炎癥消退。與模型組相比，20、40 μg/kg BPC157組和陽性對(duì)照組病變減輕明顯，其次為10 μg/kg BPC157組(圖2)。

A：HE染色和Masson染色觀察小鼠組織病理改變(標(biāo)尺為100 μm)；B：HE染色修復(fù)分?jǐn)?shù)；C：Masson染色修復(fù)分?jǐn)?shù)。BPC157：機(jī)體保護(hù)多肽157。bP<0.01。圖2 小鼠燙傷皮膚組織HE和Masson染色結(jié)果

2.3 BPC157促進(jìn)大鼠切口傷的愈合

BPC157各劑量組及陽性對(duì)照組在給藥后第3日即顯示出顯著促進(jìn)傷口愈合作用，縮短大鼠皮膚切割傷愈合時(shí)間。給藥7 d后，10 μg/kg BPC157組、20 μg/kg BPC157組、40 μg/kg BPC157組及陽性對(duì)照組皮膚創(chuàng)面面積較模型組明顯縮小，并具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。給藥7 d后，10、20、40 μg/kg BPC157組及陽性對(duì)照組的創(chuàng)面愈合率分別為53.9%(P<0.05)，64.3%(P<0.01)，67.9%(P<0.01)和46.0%(P<0.01)，模型組創(chuàng)面愈合率僅為26.3%，各組與模型組比較具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。研究提示BPC157各劑量均明顯促進(jìn)傷口愈合。同時(shí)與模型組相比，BPC157各劑量組Ⅰ型膠原蛋白含量、Ⅲ型膠原蛋白含量、羥脯氨酸含量均顯著增高(P<0.01，圖3)。

A：大鼠創(chuàng)面面積；B：大鼠創(chuàng)面愈合率；C：大鼠創(chuàng)面膠原蛋白、羥脯氨酸水平。BPC157：機(jī)體保護(hù)多肽157。aP<0.05，bP<0.01。圖3 BPC157促進(jìn)大鼠切口傷的愈合

2.4 大鼠切口傷模型HE和Masson染色結(jié)果

分析各組的HE和Masson照片發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠皮膚表皮變性壞死，破損處皮膚皮脂腺、毛囊等皮膚附屬器壞死，缺失，血管擴(kuò)張、充血，炎細(xì)胞浸潤、表皮輕微或輕度變性(空泡變)；真皮有輕微、輕度或中度炎細(xì)胞浸潤，炎細(xì)胞類型主要以單個(gè)核細(xì)胞為主。BPC157給藥組大鼠皮膚病理改變較模型組明顯減輕，表皮不同程度修復(fù)，破損皮膚周圍表皮輕微、輕度或重度增厚，壞死組織邊緣見表皮修復(fù)，皮下見成纖維細(xì)胞增生，肉芽組織輕度或中度增生，創(chuàng)面修復(fù)，炎癥消退。與模型組比較，BPC157各劑量組的病變明顯減輕，其次為陽性對(duì)照組(圖4)。

2.5 體內(nèi)安全性評(píng)價(jià)

注射500 μg/kg BPC157的小鼠的主要組織器官未出現(xiàn)明顯的組織病理學(xué)變化，同時(shí)各器官的質(zhì)量也無明顯改變。通過檢測(cè)重要肝腎損傷指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)所有數(shù)值均與正常對(duì)照組無差異，表明BPC157不會(huì)引起明顯的肝腎毒性。血清中炎性細(xì)胞因子(如IFN-γ、TNF-α和IL-1β)的檢測(cè)顯示，注射BPC157組的小鼠與正常對(duì)照組的水平相似，表明BPC157沒有誘發(fā)小鼠的炎癥反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)組小鼠在實(shí)驗(yàn)期間沒有死亡或體質(zhì)量嚴(yán)重下降的現(xiàn)象發(fā)生。上述結(jié)果表明，BPC157不會(huì)對(duì)小鼠的血液系統(tǒng)和主要器官臟器造成急性毒性(圖5)。

3 討論

燙傷和切口傷是臨床上最常見的皮膚損傷，通常由于并發(fā)癥的存在，損傷的修復(fù)和愈合過程變得更加困難，對(duì)臨床的挑戰(zhàn)性更大。BPC157作為細(xì)胞和器官的保護(hù)劑，對(duì)各種器官的損傷具有明顯的保護(hù)作用。在之前的研究中，我們化學(xué)合成的BPC157顯示出顯著的保護(hù)作用，在極低劑量(200 ng/kg)下促進(jìn)急性和慢性胃潰瘍的愈合。本研究旨在進(jìn)一步探究其在皮膚燙傷和切口傷愈合中的作用。

皮膚傷口愈合是指皮膚和其他軟組織受到損傷后進(jìn)行修復(fù)的過程，這是一個(gè)復(fù)雜而動(dòng)態(tài)的過程，涉及受損組織的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和組織層的修復(fù)，主要分為以下幾個(gè)方面：炎癥、增殖和重塑。增殖階段是至關(guān)重要的，以血管生成、膠原沉積、上皮化和傷口收縮為特征[14]。在皮膚燙傷和切口傷模型的治療中，創(chuàng)面測(cè)量數(shù)據(jù)顯示，在BPC157連續(xù)給藥后3 d，明顯促進(jìn)了創(chuàng)面收縮和閉合，提高了創(chuàng)面愈合率，促進(jìn)了傷口的恢復(fù)。

膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，在促進(jìn)傷口愈合方面具有重要的生理功能。傷口愈合過程在很大程度上取決于新膠原蛋白的生物合成和沉積的調(diào)節(jié)及其隨后的成熟。在增殖階段，傷口內(nèi)及周圍遷移、增殖的成纖維細(xì)胞會(huì)分泌Ⅲ型膠原，這種膠原對(duì)于在這一階段形成臨時(shí)基質(zhì)是必不可少的。此外，Ⅲ型膠原蛋白促進(jìn)肉芽組織彈性，減少瘢痕形成。Ⅰ型膠原蛋白在成熟期促進(jìn)傷口愈合和活力方面也起著重要作用，是未損傷皮膚中最普遍的膠原蛋白[15-16]，通過評(píng)估模型組和BPC157給藥組的肉芽組織中膠原含量，發(fā)現(xiàn)BPC157增強(qiáng)了膠原的合成和沉積，進(jìn)而促進(jìn)傷口愈合。膠原蛋白的主要成分是羥脯氨酸，它已被用作組織膠原的生化標(biāo)志物[17-18]。因此，我們進(jìn)一步檢測(cè)傷口部位羥脯氨酸的含量，以確認(rèn)BPC157對(duì)膠原蛋白的上調(diào)。我們的實(shí)驗(yàn)表明，在應(yīng)用BPC157治療7 d后，肉芽組織中的羥脯氨酸含量顯著增加，表明膠原蛋白周轉(zhuǎn)率增加。進(jìn)一步觀察HE染色與Masson染色的結(jié)果。傷后7 d皮膚HE染色結(jié)果顯示，模型組的皮膚真皮出現(xiàn)嚴(yán)重壞死、充血，大量炎癥細(xì)胞浸潤。BPC157給藥7 d，可顯著減輕表皮壞死，減少炎癥細(xì)胞浸潤，增加膠原纖維數(shù)量，促進(jìn)表皮和皮膚輔助修復(fù)。同時(shí)Masson染色也表明，BPC157使再生皮膚中染色的膠原蛋白和皮膚蛋白的綜合光密度增加。

最后，我們使用正常治療劑量12.5倍劑量(500 μg/kg)的BPC157進(jìn)行用藥安全性評(píng)價(jià)，連續(xù)注射12 d，通過對(duì)各器官進(jìn)行HE染色和器官質(zhì)量檢測(cè)，表明超高劑量的BPC157用藥不會(huì)對(duì)小鼠各主要器官產(chǎn)生毒性。通過血液生物化學(xué)指標(biāo)、血清炎性細(xì)胞因子和小鼠體質(zhì)量分析，BPC157不會(huì)對(duì)小鼠的肝腎功能造成損傷，不會(huì)造成小鼠的炎癥反應(yīng)，并且不影響其體質(zhì)量變化，充分表明在正常用藥劑量內(nèi)，BPC157用藥安全性良好。

綜上所述，本研究結(jié)果揭示了BPC157對(duì)皮膚燙傷和切口傷的療效。BPC157通過增加羥脯氨酸、膠原纖維的產(chǎn)生和沉積來加速皮膚傷口的愈合。這些結(jié)果為其在廣泛皮膚損傷的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)BPC157具有良好的穩(wěn)定性和耐受性，目前已被廣泛報(bào)道，是治療所有類型嚴(yán)重皮膚損傷的理想候選藥物。