郭 慧,李樹杏,甘 雨,張宏偉,郝留根,楊占烈,向關倫,王珍珍,易崇粉

(貴州省水稻研究所,貴陽 550006)

【研究意義】水稻(OryzasativaL.)是起源于熱帶、亞熱帶的喜溫性作物,低溫冷害嚴重影響水稻的地理分布、生長發(fā)育和產(chǎn)量形成。低溫對水稻的影響主要發(fā)生在苗期和生殖生長期。水稻苗期遭遇低溫容易造成葉片光合作用減弱、電解質(zhì)滲漏增加、鮮重和干物質(zhì)重顯著下降,物質(zhì)積累虧缺。低溫冷害在生產(chǎn)上常導致播種后不出芽或出芽后爛秧等現(xiàn)象,不利于早稻高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)[1]。水稻低溫逆境下的生理及代謝變化、耐逆相關功能基因研究一直是水稻研究的核心內(nèi)容,開展低溫脅迫下相關生理變化及基因動態(tài)研究,有助于了解水稻應對低溫脅迫的生理基礎與分子機制,進而為耐低溫水稻品種與資源的篩選、耐冷新基因的挖掘與利用以及耐冷性狀的遺傳改良奠定基礎,在農(nóng)業(yè)和社會經(jīng)濟發(fā)展方面均具有深遠意義。【前人研究進展】低溫冷害不僅會對水稻造成明顯的外部傷害,還會引起一系列生理變化。葉綠素含量通常被作為判斷植物逆境脅迫耐受性的重要指標[2]。水稻細胞膜是最先感知溫度變化的部位,在低溫脅迫下其結構容易發(fā)生變化,導致胞內(nèi)電解質(zhì)滲漏,因此電介質(zhì)滲漏率常作為植物耐受低溫的重要指標[3]。水稻耐冷性是由多基因控制的復雜數(shù)量性狀,近年來隨著生物技術的快速發(fā)展,特別是二代測序技術的廣泛應用,已經(jīng)定位250余個與低溫有關的數(shù)量性狀基因座(QTL),但其中大部分僅為初步定位,精細定位的約有12個,而被克隆的僅有7個,與苗期耐冷性相關的僅有3個:COLD1、GSTZ2和qCTS-9[4]。COLD1編碼1個G蛋白信號調(diào)節(jié)因子,過表達COLD1能顯著提高水稻的耐冷性[5]。蛋白OsGSTZ2中從Ile99到Val99的單個氨基酸替換會導致其與已知底物的催化活性顯著降低,相應的SNP與水稻亞種內(nèi)和亞種間的幼苗對寒冷的敏感性高度相關[6]。水稻苗期耐低溫QTLqCTS-9是通過耐寒品種麗江新團黑谷和冷敏品種三黃占2號構建的重組自交系群體獲得,過表達qCTS-9水稻在苗期表現(xiàn)耐寒性增強[7]。Wan等[8]研究發(fā)現(xiàn),OsCNGC9作為1個鈣離子通道蛋白,積極調(diào)控低溫脅迫相關的基因表達,其與水稻低溫信號轉(zhuǎn)導關鍵蛋白激酶OsSAPK8互作,將OsCNGC9或OsSAPK8基因過表達均可顯著提高水稻對低溫的耐受性。朱琳等[9]對水稻品種中花11苗期進行低溫處理,經(jīng)過高通量測序分析光合作用通路和苯丙氨酸代謝通路中的差異表達基因發(fā)現(xiàn),低溫脅迫對水稻的影響主要表現(xiàn)在光合作用、次生代謝的生物合成和苯丙氨酸代謝等方面。【本研究切入點】目前,關于水稻耐低溫研究主要集中在低溫表型鑒定與評價方面。近年來,在耐冷相關基因挖掘方面雖已開展了大量研究,且已獲得很多基因(或QTL),但能夠用于鑒定耐冷資源材料或改良水稻品種,輔助育種實踐的功能基因尚不多見?！緮M解決的關鍵問題】本試驗以P427(強耐冷型)、日本晴(耐冷型)和9311(冷敏感型)3個耐冷性不同的水稻品種為材料,通過測定生理、生化指標,以及轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-Seq)分析,研究幼苗期水稻響應低溫脅迫的生理生化及低溫誘導下不同耐冷性水稻品種的基因表達變化規(guī)律,挖掘水稻耐冷相關新基因,并進一步解析水稻應對低溫脅迫的生理基礎與分子機制,以期為水稻耐冷性遺傳改良奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 水稻品種 P427(強耐冷型)、日本晴(Nip,耐冷型)和9311(冷敏感型)由貴州省水稻研究所提供。

1.1.2 主要儀器設備 E.N.2Z.A Plant Total RNA KitI(R6834)RNA提取試劑盒由OMEGA公司生產(chǎn);721型分光光度計(AC0911035)由上海第三分析儀器廠生產(chǎn);振蕩式搖床器(Vibramax 100)產(chǎn)自德國;恒溫水浴鍋(SYG-1230)由美國精騏生產(chǎn);超低溫冰箱SANYO產(chǎn)自日本。

1.2 方法

1.2.1 材料預處理 (1)幼苗培養(yǎng)。選取P427、日本晴和9311各200粒飽滿種子進行發(fā)芽,分別選取50粒發(fā)芽一致的芽谷,播于塑料缽中,置于光照培養(yǎng)箱中,經(jīng)過21 d、28 ℃/14 h 和25 ℃/10 h光暗交替培養(yǎng),生長至三葉期(苗齡21 d)時備用。CP:低溫處理前(0 h)的P427;CR:低溫處理前的日本晴(Nip);CJ:低溫處理前的9311;TMP:低溫處理1 d的P427;TMR:低溫處理1 d的日本晴;TMJ:低溫處理1 d 的9311;TEP:低溫處理3 d 的P427;TER:低溫處理3 d的日本晴;TEJ:低溫處理3 d 的9311,各3次重復。

(2)RNA提取。分別選取P427、日本晴和9311各50株備用幼苗,從中分別選取5株生長一致的幼苗,剪取其基部、莖中部和葉片的少許組織用錫箔紙包裹,于液氮中速凍,置于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。將剩余秧?45株)轉(zhuǎn)移至3～4 ℃低溫光照培養(yǎng)室內(nèi)低溫處理,分別在處理1和3 d時采用上述方法進行取樣,每次5株,然后采用RNA提取試劑盒參照使用說明書提取低溫處理前(0 h)、低溫處理1 d及低溫處理3 d樣品的RNA,3次重復。

1.2.2 試驗設計 (1)水稻幼苗期耐冷性鑒定。將生長21 d的P427、日本晴和9311備用幼苗各20株轉(zhuǎn)移至3～4 ℃低溫光照培養(yǎng)室內(nèi)冷處理3 d,再移至常溫條件(28 ℃/14 h 和25 ℃/10 h光暗環(huán)境)下進行恢復生長2周。調(diào)查葉片卷曲度、葉片赤枯程度(葉片褪綠程度)和死亡率等指標,將不同基因型的水稻材料按耐冷性好、耐冷性中和耐冷性差進行耐冷性初步鑒定分級。

(2)葉綠素含量測定。植物在低溫脅迫下葉綠素合成會受到抑制。將生長21 d的P427、日本晴和9311幼苗各30株暗適應1 h后,在低溫處理前測定第1次葉綠素含量,然后分別在低溫脅迫3 d和常溫恢復生長3 d后測定葉綠素含量。每個品種每次各測定10株幼苗的測定值,3次重復。

(3)電導率測定。細胞膜是植物最先感知低溫的部位,遭遇低溫脅迫后,其理化性質(zhì)發(fā)生變化,細胞膜結構受到破壞,導致細胞內(nèi)電解質(zhì)滲漏,因此電解質(zhì)滲漏率可作為鑒定植物耐低溫性的指標之一[3]。電解質(zhì)滲漏程度一般用相對電導率來表征。選取培養(yǎng)21 d生長一致的P427、日本晴和9311幼苗各5株,分別在低溫處理前、低溫脅迫3 d和低溫脅迫5 d后測定電導率。參照略有改動的趙世杰等[10]的方法測定相對電導率。用去離子水沖洗葉片2次,用濾紙吸干表面水分,用直徑6～8 mm的打孔器,打取稻葉圓片10片,放入潔凈試管中,加15 mL去離子水,真空泵抽氣10 min,振蕩1 h,室溫平衡2 h,搖勻后用電導儀測定初電導;置沸水浴中10 min,冷卻至室溫后測定終電導,3次重復。

相對電導率=(初電導-空白)/(終電導-空白)×100%

(4)差異表達基因分析。聚類分析可用于研究差異基因在不同試驗條件下的表達模式,而表達模式類似的基因可能具有相同的功能,共同參與同一代謝過程或細胞通路。將表達模式相同或相近的基因聚類,可用于推測未知基因的功能或已知基因的新功能。采用readcount數(shù)據(jù)通過DESeq(1.12.0)標準化后進行基因差異表達分析(P<0.05),用火山圖推斷差異基因的整體分布情況,根據(jù)低溫處理前后差異基因的FPKM(Fragments Per Kilobase Million)值為表達水平,做層次聚類圖分析。

(5)差異表達基因的GO和KEGG富集分析。為進一步分析低溫脅迫下不同品種基因的表達水平及調(diào)控網(wǎng)絡,采用GOSeq進行GO富集分析(P<0.05),差異表達基因的篩選條件標定為log2FC≥1或log2FC≤0.25,P-value≤0.01;為進一步分析低溫脅迫過程中低溫脅迫響應基因參與的代謝過程,基于KEGG數(shù)據(jù)庫,采用KOBAS(V2.0)進行KEGG分析,檢測特異KEGG通路中差異表達基因的富集情況,找出差異表達基因顯著富集的Pathway。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2016進行數(shù)據(jù)整理,應用DPS 2.0進行數(shù)據(jù)分析。

2 結果與分析

2.1 水稻幼苗期耐冷性鑒定

從圖1看出,品種P427表現(xiàn)較強的耐冷性,經(jīng)低溫處理后,葉色無明顯變化,沒出現(xiàn)失水萎蔫等癥狀,只是在恢復生長期間葉尖出現(xiàn)葉片枯黃或幼苗死亡等癥狀;日本晴和9311在低溫脅迫后葉片便出現(xiàn)不同程度的卷曲、萎蔫以及幼苗死亡等癥狀。2周后統(tǒng)計其存活率(圖2),P427的存活率達49.3%,極顯著高于日本晴(23.3%)和9311(9.3%);日本晴與9311也呈極顯著差異。該結果證實P427苗期具有較強的耐冷性,且耐冷性明顯優(yōu)于日本晴和9311。

圖1 P427、日本晴和9311苗期低溫脅迫前、后及恢復生長后的表型Fig.1 Phenotypes before low-temperature stress, after low temperature stress and recovery growth of P427,Nipponbare and 9311

*和**分別表示P<0.05和P<0.01水平差異顯著和極顯著(t-test)。下同。* and ** indicate significant difference and extremely significant difference at P<0.05 and P<0.01 level (t-test),respectively. The same as below. 圖2 P427、日本晴和9311苗期低溫脅迫處理恢復生長后的存活率Fig.2 The survival rate of P427, Nipponbare and 9311 after low temperature stress at seedling stage

2.2 水稻幼苗期低溫脅迫后的葉綠素含量

從圖3看出,低溫脅迫3 d后,P427的葉綠素含量由29.64 μg/g降至29.30 μg/g,僅下降1.15%;而日本晴的葉綠素含量由26.10 μg/g降至23.26 μg/g,下降10.88%;9311的葉綠素含量由26.8 μg/g降至22.84 μg/g,下降14.77%。恢復生長3 d后,P427和9311的葉綠素含量均明顯下降,P427和9311分別降至27.96和21.24 μg/g,而日本晴沒有太大變化。說明,品種P427對低溫不敏感,耐冷性明顯優(yōu)于日本晴和9311。

新安北堤、障水埝及四門堤的復堤土料場勘探點間距較大，一般2～4km，取土深度（按2.0m考慮）氛圍內(nèi)未見地下水，土料開采不受地下水影響。

同一品種低溫處理前與低溫處理后、恢復生長后分別相互比較。The same varieties are compared before low temperature treatment,after low temperature treatment and after recovery.圖3 P427、日本晴、9311苗期低溫脅迫處理前、后及恢復生長后的葉綠素含量Fig.3 Chlorophyll content of P427, Nipponbare and 9311 before low temperature stress,after low temperature treatment and after recovery at seedling stage

2.3 水稻幼苗期低溫脅迫后相對電導率變化

從圖4看出,P427、日本晴和9311經(jīng)過3～4 ℃低溫處理3 d后,3個品種的相對電導率均較自身處理前顯著或極顯著增大,其中,9311的變幅最大,極顯著增長10.79%;P427和日本晴的變幅相對較小,分別顯著增長2.69%和1.41%。表明,低溫對9311的膜系統(tǒng)造成的損傷最大,即3個材料中9311的耐低溫性最差。低溫處理持續(xù)至5 d時,3個品種的相對電導率均再次升高,說明持續(xù)低溫再次加重對膜系統(tǒng)的傷害程度。其中,此階段日本晴的變幅最大,較處理前極顯著增長5.97%,表明持續(xù)低溫對日本晴的膜系統(tǒng)也造成了較嚴重的傷害。說明,低溫處理對9311的膜系統(tǒng)傷害最嚴重,對P427的膜系統(tǒng)傷害最輕,3個品種中P427對低溫的耐受性最強。

同一品種低溫處理前與低溫處理3 d、低溫處理5 d分別相互比較。The same varieties are compared before low temperature treatment, low temperature treatment for 3 days and low temperature treatment for 5 days.圖4 不同水稻品種低溫處理前后相對電導率的變化Fig.4 Changes of relative electri-conductivity of different rice varieties before and after low temperature treatment

2.4 低溫脅迫下差異表達基因的鑒定

從圖5可知,在低溫處理前(0 h)P427(CP)和日本晴(CR)呈相似的聚類結果,差異基因表達模式相近,但隨著低溫處理時間延長,逐漸表現(xiàn)不同聚類形式;而9311(CJ)則表現(xiàn)出不同于P427和日本晴的聚類結果,9311差異基因的表達模式與P427和日本晴相差較大。

紅色表示高表達基因,藍色表示低表達基因,顏色從紅到藍,表示log10(FPKM+1)從大到小。CP、CR和CJ分別表示低溫處理前的P427、日本晴和9311;TMP、TMR和 TMJ分別表示低溫處理1 d的P427、日本晴和9311;TEP、TER和 TEJ分別表示低溫處理3 d的P427、日本晴和9311,下同。Red indicates high-expressed gene, and blue indicates low-expressed gene. The color from red to blue means that log10(FPKM+1) is big to small. CP,CR and CJ represent P427,Nipponbare and 9311 before low temperature treatment;TMP,TMR and TMJ represent P427,Nipponbare and 9311 after 1 days of low temperature treatment;TEP,TER and TEJ respectively represent P427,Nipponbare and 9311 after 3 days of low temperature treatment. The same as below. 圖5 基于FPKM值的基因表達聚類圖譜Fig.5 Gene expression clustering diagram based on FPKM value

從圖6看出,基于RNA-Seq進行差異基因分析,低溫處理1 d后,P427獲得9190個差異表達基因(DEGs),日本晴獲得8476個DEGs,9311獲得6138個DEGs;低溫處理3 d后,P427獲得15 040個DEGs,日本晴獲得16 253個DEGs,9311獲得14 863個DEGs。隨著低溫處理時間的延長,3個品種啟動的耐冷相關基因均明顯增加,其中,共有DEGs由3196個增至9352個,增加6156個;特有DEGs在日本晴和9311中也不同程度地增加,分別增加911和940個,而P427的特有DEGs則下降691個。此外,P427從低溫處理1～3 d只有576個特有基因一直在差異表達。

Ⅰ.低溫處理1 d后,P427、日本晴和9311差異變化基因韋恩圖;Ⅱ.低溫處理3 d后,P427、日本晴和9311差異變化基因韋恩圖;Ⅲ.低溫處理1和3 d后,P427和日本晴差異變化基因的韋恩圖(P<0.05)。 Ⅰ.Venn diagram of differentially expressed genes in P427,Nipponbare and 9311 after 1 days of low temperature treatment; Ⅱ.Venn diagram of differentially expressed genes in P427,Nipponbare and 9311 after 3 days of low temperature treatment; Ⅲ.Venn diagram of differential changes in P427 and Nipponbare after 1 days and 3 days of low temperature treatment (P<0.05).圖6 低溫處理P427、日本晴和9311差異變化基因的韋恩圖Fig.6 Venn diagram of differentially expressed genes P427,Nipponbare and 9311

2.5 低溫脅迫下差異表達基因的GO富集

從圖7可知,在低溫處理3 d時,P427單獨擁有1654個DEGs,將其進行GO富集分析的結果顯示,1654個DEGs被富集在3326個GO功能條目中,圖中展示出富集的前30個功能條目。其中,生物學過程(BP)占62.39%,細胞組分(CC)占 12.99%,分子功能(MF)占24.62%,多數(shù)差異基因與生物學功能顯著相關。細胞成分的組織或生物發(fā)生、細胞內(nèi)組分、大分子復合物結合等分別是生物學過程、細胞組分、分子功能富集最多的功能類別。

*表示顯著富集的GO term。* indicates significantly enriched GO term.圖7 低溫處理3 d后P427特有DEGs的GO富集Fig.7 GO enrichment of specific DEGs in P427 after 3 days of low temperature treatment

2.6 低溫脅迫下差異表達基因的KEGG富集

將P427特有的1654個DEGs進行KGEE富集分析結果顯示,1654個DEGs富集在98條代謝通路上,顯著富集的有20條Pathway,主要集中在次生代謝產(chǎn)物的生物合成(PATH:01110)、植物激素信號轉(zhuǎn)導(PATH:04075)、泛素介導的蛋白水解(PATH:04120)、嘌呤代謝(PATH:00230)、苯丙烷生物合成(PATH:00940)和苯丙氨酸代謝(PATH:00360)等通路(圖8)。KEGG注釋通路圖顯示,植物激素信號轉(zhuǎn)導和苯丙氨酸代謝對苗期水稻低溫脅迫影響較大。

圖8 低溫處理3 d后P427特有DEGs的KEGG富集Fig.8 KEGG enrichment of specific DEGs in P427 after 3 days of low temperature treatment

通過KGEE富集分析,在植物激素信號轉(zhuǎn)導途徑富集到18個差異表達基因,其中10個基因上調(diào)表達,8個基因下調(diào)表達。生長素介導的通路富集到4個基因,其中OsARF7和OsARF11是生長素響應因子;富集到2個尚未見報道的生長素響應SAUR家族基因,細胞分裂素途徑富集到OsRR4[11]、OsRR9和OsRR10[12]共3個水稻細胞分裂素響應的A型響應調(diào)節(jié)子基因,ABA信號途徑富集到OsSAPK1、OsSAPK3和OsSAPK4共3個基因;此外,在油菜素內(nèi)酯途徑富集到OsGSK3和OsBRI1共2個基因,水楊酸途徑富集到OsNPR5和OsbZIP41共2個基因(圖9)。苯丙氨酸代謝途徑是植物最重要的次生代謝之一。從圖10可知,差異表達基因在苯丙氨酸代謝途徑中共富集11個基因,其中上調(diào)表達基因4個,下調(diào)表達基因7個,其中已有報道的OsPAL4和OsPAL6是控制抗性的關鍵基因,也是提高水稻廣譜抗性的潛在育種靶標基因[13]。

圖9 差異表達基因參與的植物激素信號轉(zhuǎn)導途徑Fig.9 Plant hormone signal transduction pathways involved in differentially expressed genes

圖10 差異表達基因參與苯丙氨酸代謝通路Fig.10 Differentially expressed genes involved in phenylalanine metabolism pathway

3 討 論

3.1 水稻幼苗期低溫脅迫的生理反應

水稻受逆境脅迫的影響程度與逆境種類、逆境強度和持續(xù)時間等多種因素緊密相關[14]。低溫脅迫對水稻的形態(tài)特征和生理指標均會產(chǎn)生影響[15],低溫脅迫后表型變化可直接反映出水稻的損傷程度[16-17]。相對于形態(tài)學指標而言,生理學指標可進一步反映植物在逆境條件下體內(nèi)各代謝過程的變化[18-19]。有研究者根據(jù)苗期耐冷形態(tài)指標建立了苗期耐冷性鑒定評價標準,戴陸園等[20]根據(jù)水稻苗期耐冷形態(tài)變化將苗期耐冷性分為1～9級。韓龍植等[21]將3～4葉齡幼苗置于冷水中處理后,對幼苗葉片的赤枯程度進行調(diào)查,并將其作為幼苗期水稻耐冷性的鑒定指標。本研究選用葉片卷曲度、葉枯度及死亡率等形態(tài)學指標結合葉綠素含量和電導率等生理指標作為水稻苗期耐寒性的評價指標判斷苗期水稻耐低溫能力。低溫脅迫容易使水稻功能葉受到傷害,葉綠素的正常代謝出現(xiàn)紊亂,葉綠素合成下降。劉次桃等[4]研究認為,水稻在低溫下會減少葉綠素合成及葉綠體形成。本試驗結果顯示,低溫脅迫后P427、日本晴和9311的葉綠素含量均不同程度下降,但強耐冷品種P427的葉綠素含量下降較少,而冷敏感品種9311的葉綠素含量下降最多;耐冷水稻品種對低溫脅迫表現(xiàn)較強的適應能力,葉片受傷害程度小,能保持較高的葉綠素含量;可能是低溫脅迫使不同水稻幼苗的細胞結構發(fā)生了變化,不同品種生理功能恢復能力不同,因而植株葉綠素合成受到不同程度的抑制。Bertin等[22]研究發(fā)現(xiàn),低溫處理后的秧苗存活率與其電解質(zhì)滲漏關系密切。陳善娜等[23]研究認為,電解質(zhì)滲漏可用于評價水稻耐冷性。本試驗結果顯示,低溫脅迫后P427、日本晴和9311的相對電導率均不同程度增大,其中9311的增幅最大,P427和日本晴的變幅相對較小,低溫脅迫對P427的膜系統(tǒng)傷害最輕,對9311的膜系統(tǒng)傷害最嚴重。品種耐冷性是一個復雜的綜合性狀,不同品種可能具有不同的耐冷機制,即使同一品種在不同的生長發(fā)育時期耐冷機制也可能存在差異。

3.2 水稻苗期低溫誘導差異表達基因分析

基于RNA-Seq技術對植物低溫脅迫應答及網(wǎng)絡調(diào)控研究,已經(jīng)獲得大量候選基因、新轉(zhuǎn)錄本及SNPs等。本研究通過對3個不同耐冷性的水稻品種進行轉(zhuǎn)錄組測序分析,獲得大量差異表達基因,包括已經(jīng)被報道的耐冷相關基因COLD1和bZIP73;同時也發(fā)現(xiàn)大量參與激素代謝通路、淀粉糖類合成代謝的差異表達基因及水通道蛋白基因,如OsARF11、OsPYL/RCAR1、OsPAL6、OsAPL4、OsRR4、SUS6及OsPIP13等。

生長素響應因子(Auxin response factor,ARF)是一類特異性結合到TGTCTC序列上的一類轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)節(jié)生長素表達的響應基因。ARF基因在植物中大多數(shù)由多基因家族組成。Wang等[24]研究顯示,水稻中25個ARFs成員中除OsARF20外的其他24個OsARFs基因均具有表達活性,其中一些表達量受生長素處理或者光暗培養(yǎng)的影響。本研究結果表明,生長素響應因子OsARF11在耐冷品種P427中上調(diào)表達,暗示OsARF11基因可能通過生長素信號途徑響應水稻低溫誘導。

水稻細胞分裂素響應的A型響應調(diào)節(jié)子基因(A-type response regulator gene,OsRR)受細胞分裂素的誘導。OsRR6響應不同的環(huán)境刺激而誘導表達,水稻處于高鹽、脫水或低溫脅迫下OsRR6表達量會增強,顯示其在非生物脅迫和細胞分裂素信號之間的交互中發(fā)揮作用[11]。本研究結果表明,細胞分裂素響應的A型響應調(diào)節(jié)子基因為OsRR4、OsRR9和OsRR10,其在耐冷品種P427低溫處理前后均發(fā)生差異表達,與Yukihiro等[11]的研究結果一致。

蔗糖非發(fā)酵相關蛋白激酶2(Sucrose non-fermenting 1-related protein kinase 2,SnRK2)激酶家族,是眾多應答滲透壓脅迫的蛋白激酶家族之一,SnRK蛋白家族成員參與ABA誘導的信號轉(zhuǎn)導途徑、耐鹽、營養(yǎng)脅迫應答、病害及碳代謝調(diào)控等[25]。水稻SnRK2基因家族的OsSAPK3、OsSAPK5、OsSAPK7和OsSAPK9在應答細菌性條斑病菌侵染后表達顯著上調(diào),其在細胞質(zhì)和細胞核中均有定位,但聚集在不同的組中,說明其參與不同的抗性信號轉(zhuǎn)導途徑[26]。本研究中水稻SnRK2基因家族OsSAPK3顯示下調(diào)表達,暗示其參與水稻苗期低溫誘導。

蔗糖合酶(Sucrose synthase,SuS)是植物體中廣泛存在的一種糖基轉(zhuǎn)移酶[27],在生長發(fā)育過程中起重要作用,是蔗糖合成分解的重要催化酶,也是葉片光合產(chǎn)物蔗糖進入各種代謝途徑所必需的關鍵酶之一[28]。此外,蔗糖合酶在庫器官的生長發(fā)育及代謝過程中發(fā)揮重要功能,且在植物缺氧、低溫等非生物脅迫環(huán)境適應中也具有十分重要的作用[29]。本研究發(fā)現(xiàn),蔗糖合酶家族SUS6受低溫誘導下調(diào)表達,與Albrecht等[30]和Maraa等[31]的研究結果相吻合,表明蔗糖合酶在植物低溫脅迫調(diào)控中發(fā)揮重要作用。

本研究結果提示RNA-seq獲得的大量差異表達基因中包含水稻響應低溫脅迫的候選基因,對于深入研究耐低溫調(diào)控機制具有潛在的作用,同時也為進一步挖掘低溫誘導基因提供了大量的靶基因和潛在方向。

4 結 論

不同耐冷型品種其耐冷響應基因及調(diào)控機制可能存在差異,強耐冷品種P427存在有別于日本晴和9311的低溫脅迫響應基因。苗期水稻低溫脅迫對植物激素信號轉(zhuǎn)導和苯丙氨酸代謝影響較大,P427可能通過次生代謝產(chǎn)物的生物合成、植物激素信號轉(zhuǎn)導等代謝通路及苯丙烷類生物合成通路上的基因響應苗期水稻的耐冷性。