殷發(fā)祥，許睿，朱超，趙文娣，張立功，錢軍

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤外科中德乳腺病區(qū)，安徽 蚌埠 233000)

2020年女性乳腺癌(breast cancer，BC)發(fā)病率在全球癌癥中躍升至首位，占所有新發(fā)癌癥病例的11.7%，占女性癌癥病例的25.0%[1]。在臨床上，BC的篩查和早期診斷主要依靠鉬靶、超聲、MRI、CT等相關(guān)手段[2]。在過去的幾十年里，雖然采用化療、放療、手術(shù)治療、內(nèi)分泌治療、靶向治療、免疫治療等方法取得了一定的效果，但對(duì)晚期BC患者的治療效果仍不盡人意，這可能與晚期乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移具有一定相關(guān)性[3]。RNA結(jié)合蛋白近年來被認(rèn)為是癌癥進(jìn)展的轉(zhuǎn)錄后驅(qū)動(dòng)因素。聚嘧啶束結(jié)合蛋白3 (polypyyrimidine tract-binding protein 3，PTBP3)也被稱為分化調(diào)節(jié)劑3，PTBP3是PTB家族的一員。PTB家族有3個(gè)成員，即PTBP1、PTBP2和PTBP3。PTBP1和PTBP2可與調(diào)控RNA相互作用，調(diào)控mRNA的剪接、穩(wěn)定性、定位和翻譯[4-5]。相比之下，關(guān)于PTBP3的細(xì)胞功能或生理作用的信息很少。最新研究表明，PTBP3在調(diào)控胃癌及非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生物學(xué)行為過程中具有促癌作用[6-7]。為進(jìn)一步了解PTBP3在乳腺癌中的調(diào)控機(jī)制，本研究通過分析PTBP3在乳腺癌中及癌旁組織的表達(dá)差異，揭示PTBP3是否影響乳腺癌患者生存狀況，并探討相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

收集2017年6月至2017年12月蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院90例女性年齡為(48.52±9.92)歲的外科手術(shù)的乳腺癌組織及相對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織蠟塊。同時(shí)收集2022年3月至2022年6月在腫瘤外科行乳腺癌根治術(shù)的手術(shù)患者20例。手術(shù)切除癌組織及癌旁正常組織(距離癌切緣≥3 cm)后，立即放入-80 ℃ 冰箱保存，直至提取mRNA或蛋白質(zhì)。所有病人均有明確的診斷，且術(shù)前均未接受過任何治療。所有患者均簽署知情同意書，并由蚌醫(yī)一附院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑

乳腺癌細(xì)胞MCF7購于上海中科院細(xì)胞庫；PTBP3、E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin、GAPDH一抗、IgG二抗均購于中國武漢三鷹公司；SYBR Green試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒由中國上海碧云天公司生產(chǎn)；qRT-PCR引物由中國上海吉?jiǎng)P基因公司提供。

1.3 qRT-PCR測(cè)定RNA表達(dá)量

取相應(yīng)組織，通過TRIzol法提取總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄變?yōu)閏DNA。加入引物，模板為cDNA，GAPDH作為內(nèi)參，通過2-△△Ct方法得出PTBP3相對(duì)表達(dá)量。反應(yīng)條件：變性95 ℃15 s，退火60℃35s，延伸74 ℃35 s，共40個(gè)循環(huán)。引物序列：PTBP3正向序列：5′-GCCTTGCTTCAGTATGCTGACC-3′；反向序列：5′-AAGGCTGGTGAGCTTGGAGAAG-3′。GAPDH正向序列：5′-TGGTATCGTGGAAGGACTC-3′；反向序列：5′-AGTAGAGGCAGGGATGATG-3′。

1.4 免疫組化檢測(cè)PTBP3蛋白及分析

取組織蠟塊，經(jīng)過組織切片、脫臘、復(fù)水并進(jìn)行抗原修復(fù)后，滴加適量PTBP3一抗(1∶100)，冰箱4 ℃孵育過夜。清洗后，滴加適量二抗(1∶1000)，半小時(shí)室溫孵育。DAB試劑盒染色，蘇木素復(fù)染，脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。胞漿及胞質(zhì)中的黃染顆粒即為PTBP3蛋白。

免疫組化結(jié)果判定：高倍視野 (200×)每例組織隨機(jī)取5個(gè)視野，將陽性細(xì)胞占比分?jǐn)?shù)和染色強(qiáng)度的乘積作為判斷依據(jù)。染色強(qiáng)度為0分=未染上色，1分=淺黃色，2分=棕黃色，3 分=棕褐色；陽性細(xì)胞所占細(xì)胞數(shù)目百分比計(jì)分，0分=0%，1分占比<10%，2分占比 11.0%～50.0%，3分占比51.0%～75.0%，4分占比>75.0%。得數(shù)在0～4分為PTBP3低表達(dá)組，4～12分為PTBP3高表達(dá)組。評(píng)分結(jié)果由兩名高年資病理醫(yī)師單獨(dú)讀片判定。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

乳腺癌細(xì)胞MCF7培養(yǎng)于10%胎牛血清和1%的青-鏈霉素溶液配置成的DMEM培養(yǎng)基，放置于37 ℃5.0% CO2的培養(yǎng)箱中。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，通過脂質(zhì)體Lipo2000按照說明書將si-NC及si-PTBP3轉(zhuǎn)染至細(xì)胞。

1.6 Western Blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

Ripa裂解液提取總蛋白質(zhì)，測(cè)定濃度通過BCA試劑盒，SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)。再將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。完成轉(zhuǎn)膜后，用5.0%脫脂牛奶粉進(jìn)行封閉，室溫1 h。TBST洗3遍后加入一抗，4 ℃條件下孵育過夜。洗去一抗，加入二抗室溫孵育1 h。ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯影。GAPDH設(shè)為內(nèi)參，通過Image J分析目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值來計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.7 Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲

將配置好的matrigel基質(zhì)膠均勻鋪在transwell小室底部。24 h后，取每組對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞5×104個(gè)，接種于無血清的上室中，再將完全培養(yǎng)基(700 μL)置于24孔板下室中。培養(yǎng)24 h后，甲醇固定20 min，結(jié)晶紫染色。通過倒置顯微鏡任意捕獲5個(gè)視野，在高倍鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行柱狀圖制作，率的比較采用卡方檢驗(yàn)，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PTBP3 mRNA在乳腺癌組織中表達(dá)

通過qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在20例乳腺癌組織及相對(duì)應(yīng)的癌旁組織中，與癌旁組織相比(n=20，4.06±0.38)，PTBP3 mRNA的表達(dá)量在癌組織(n=20，17.22±0.69)中明顯升高，且兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見圖1。

*P<0.001。

2.2 免疫組化檢測(cè)乳腺癌PTBP3蛋白表達(dá)情況

免疫組化檢測(cè)90例乳腺癌組織蠟塊和與其相對(duì)應(yīng)癌旁正常組織PTBP3蛋白表達(dá)，PTBP3在乳腺癌中高表達(dá)59例，低表達(dá)31例，而癌旁組織高表達(dá)33例，低表達(dá)57例，兩者比較明顯具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見圖2。

圖2 PTBP3蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)情況(200×)

2.3 PTBP3表達(dá)與乳腺癌臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性

收集患者臨床病理學(xué)資料，與PTBP3免疫組化表達(dá)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析可以發(fā)現(xiàn)，PTBP3的表達(dá)與乳腺癌的腫瘤大小(P=0.044)TNM分期(P=0.018)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.022)、有關(guān)，與年齡(P=0.276)、Ki-67(P=0.608)和分化程度(P=0.124)無關(guān)，見表1。

表1 PTBP3表達(dá)與患者臨床病理因素的關(guān)系

2.4 PTBP3與乳腺癌患者預(yù)后的相關(guān)性

根據(jù)90例乳腺癌患者60個(gè)月生存隨訪，死亡12人，總生存率86.8%。對(duì)PTBP3在乳腺癌中的表達(dá)進(jìn)行Kaplan-Meier分析，結(jié)果顯示乳腺癌組織中PTBP3陽性患者總體生存率顯著低于陰性患者(P<0.05)，見圖3。

圖3 乳腺癌患者PTBP3高表達(dá)組與低表達(dá)組5年生存率比較

2.5 PTBP3表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF7的侵襲作用

為了驗(yàn)證PTBP3對(duì)MCF7細(xì)胞侵襲的影響，通過siRNA敲低乳腺癌細(xì)胞MCF7中PTBP3表達(dá)量。Western Blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，與siNC組(1.08±0.13)相比，siPTBP3組(0.21±0.06)中PTBP3的表達(dá)量明顯降低(P<0.05)，表明轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)成功，見圖4。

圖4 Bestern Blot驗(yàn)證MCF7細(xì)胞PTBP3表達(dá)降低

通過transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，48 h各組細(xì)胞培養(yǎng)后，與siNC組(237.70±26.44，)相比，siPTBP3組(112.70±13.74)的MCF7細(xì)胞侵襲能力明顯下降，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖5。

圖5 Western Blot驗(yàn)證MCF7細(xì)胞PTBP3表達(dá)降低

2.6 PTBP3通過EMT相關(guān)蛋白變化改變MCF7細(xì)胞侵襲

Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相較于轉(zhuǎn)染空載體的siNC組，敲低組中E-Cadherin相對(duì)表達(dá)量明顯升高，而N-Cadherin與Vimentin相對(duì)表達(dá)量則明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見圖6。

圖6 Western Blot 檢測(cè)PTBP3對(duì)EMT相關(guān)蛋白的影響

3 討 論

乳腺癌傳統(tǒng)治療方式主要包括手術(shù)、化療、放療等多種手段。近年來，由于上述治療方法無明顯突破，尤其對(duì)晚期及三陰型乳腺癌治療效果欠佳，因此患者5年生存率無明顯提高[8-9]。最近幾年，隨著乳腺癌發(fā)病分子機(jī)制的研究，乳腺癌相關(guān)基因及通路的發(fā)現(xiàn)以及分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，乳腺癌基因治療取得了極大的進(jìn)展，為乳腺癌患者特別是晚期患者的治療提供了新思路。目前，對(duì)于晚期和生物侵襲性亞型，包括HER-2陽性和三陰性乳腺癌患者，傳統(tǒng)乳腺改良根治術(shù)及腋窩清掃聯(lián)合基因治療明顯降低了乳腺癌的死亡率[10-11]。因此，隨著未來對(duì)乳腺癌發(fā)病機(jī)制的分子研究，患者的預(yù)后將得到極大的提升。

PTBP3是一種重要的RNA結(jié)合蛋白，參與RNA剪接、加工和翻譯[12]。PTBP3通過結(jié)合大量影響癌細(xì)胞生物學(xué)行為的RNA，從而在調(diào)節(jié)基因表達(dá)方面發(fā)揮重要作用[13]。選擇性剪接允許一個(gè)基因產(chǎn)生多個(gè)mRNA亞型，這些基因亞型通常編碼不同的蛋白質(zhì)亞型，從而豐富了生物體可利用的蛋白質(zhì)庫[14]。最新研究表明，PTBP3的表達(dá)在不同的細(xì)胞類型中差異很大，它在幾種胚胎細(xì)胞類型和成人造血細(xì)胞中表達(dá)[15]。此外，關(guān)于不同癌癥類型中PTBP3的證據(jù)也有報(bào)道。敲除PTBP3表達(dá)，使肺腺癌細(xì)胞的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力受損[16]。與正常胃黏膜相比，PTBP3在胃癌組織中表達(dá)上調(diào)，這一發(fā)現(xiàn)可能與胃癌的進(jìn)展密切相關(guān)[17]。這些發(fā)現(xiàn)提示PTBP3在惡性腫瘤的進(jìn)程及演變中發(fā)揮重要作用。

上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中起著至關(guān)重要的作用。在EMT過程中，上皮腫瘤細(xì)胞發(fā)生明顯的形態(tài)和表型變化，包括緊密連接、細(xì)胞極性和細(xì)胞骨架的喪失重組，從而使細(xì)胞的支撐和表型更具侵襲性[18-19]。最新研究表明，轉(zhuǎn)移性的分子機(jī)制已被證明是EMT的信號(hào)通路失調(diào)，并且EMT與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和浸潤密切相關(guān)，這可能與轉(zhuǎn)錄因子如Snail、Zeb和Twist在EMT中起著至關(guān)重要的作用相關(guān)[20-21]。在分子層面，EMT與上皮標(biāo)記物(如E-cadherin、occludin、zonula occludens (ZO-1))的丟失以及間充質(zhì)標(biāo)記物(如vimentin、N-cadherin、Fibronectin)的獲得有關(guān)[22]。因此，在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中，抑制EMT來阻斷轉(zhuǎn)移是非常重要的。

本研究組首先通過qRT-PCR，發(fā)現(xiàn)PTBP3在乳腺癌中的表達(dá)顯著高于癌旁組織，并且免疫組化檢測(cè)PTBP3蛋白在乳腺癌中的表達(dá)量與腫瘤大小(P=0.024)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.001)、TNM分期(P=0.036)有關(guān)。同時(shí)，追蹤90例乳腺癌患者生存時(shí)間，并通過Kaplan-Meier分析發(fā)現(xiàn)，PTBP3陽性乳腺癌的患者總體生存率顯著低于陰性患者。這些都提示PTBP3可能是乳腺癌的預(yù)后標(biāo)志物。為進(jìn)一步探究PTBP3對(duì)乳腺癌的作用機(jī)制，本研究通過siRNA敲低乳腺癌細(xì)胞株MCF7的PTBP3的表達(dá)水平，transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染敲低后的MCF7細(xì)胞的侵襲能力明顯降低。為探究具體調(diào)控增殖機(jī)制，接下來通過Western Blot檢測(cè)EMT相關(guān)蛋白，發(fā)現(xiàn)敲低PTBP3表達(dá)后E-Cadherin相對(duì)表達(dá)量明顯升高，而N-Cadherin與Vimentin相對(duì)表達(dá)量則明顯降低。因此我們認(rèn)為PTBP3可能通過調(diào)控EMT相關(guān)蛋白影響乳腺癌細(xì)胞增殖。

綜上所述，本研究主要發(fā)現(xiàn)PTBP3在乳腺癌中表達(dá)明顯升高，且PTBP3表達(dá)影響乳腺癌患者的生存預(yù)后，這可能與PTBP3調(diào)控EMT相關(guān)蛋白，進(jìn)而改變?nèi)橄侔┘?xì)胞侵襲具有一定相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)主要得出PTBP3可能是乳腺癌患者預(yù)后判斷及治療的新靶點(diǎn)，為今后乳腺癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究提供新思路。