李明華，馬郁芳

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)，遼寧 錦州 121000；2.大連醫(yī)科大學(xué)，遼寧 大連 116044)

金黃色葡萄球菌是細(xì)菌感染中的重要病原體，主要存在皮膚表面和上呼吸道黏膜表面，可引起皮膚和軟組織感染[1]，也可引起心內(nèi)膜炎、腦膜炎、膿毒癥等多種疾病[2]。機(jī)體感染金黃色葡萄球菌后，細(xì)菌利用黏附分子黏附到感染部位的組織或細(xì)胞表面，通過獲取營養(yǎng)完成增殖，導(dǎo)致宿主免疫系統(tǒng)和抗菌藥物對(duì)它們難以清除[3]。金黃色葡萄球菌會(huì)產(chǎn)生多種致病的毒力因子，通過侵害宿主細(xì)胞引發(fā)病癥，主要包括結(jié)構(gòu)成分、酶以及毒素等，有助于細(xì)菌黏附定殖、營養(yǎng)獲取和抵抗宿主免疫防御[4]，是細(xì)菌產(chǎn)生致病性的主要原因[5]。同時(shí)金黃色葡萄球菌還可通過多種方式破壞宿主免疫反應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體持續(xù)感染，加重病癥[3]。

金黃色葡萄球菌是一種革蘭氏陽性耐藥菌，外層包裹著細(xì)胞壁，可以防御細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外部滲透壓，并保持細(xì)胞形狀和結(jié)構(gòu)的完整性。肽聚糖層是細(xì)胞壁的主要成分，其生物合成途徑中涉及許多對(duì)細(xì)胞存活具有重要作用的酶，抑制酶活性可導(dǎo)致細(xì)菌的裂解死亡，是抗菌藥物發(fā)現(xiàn)的重要靶向途徑之一。因此，靶向細(xì)菌細(xì)胞壁組分，對(duì)其生物合成途徑中酶的特性進(jìn)行了解，有利于更好的發(fā)現(xiàn)和開發(fā)新型抗菌藥物。

金黃色葡萄球菌引起的感染一般采用抗生素藥物進(jìn)行治療，主要包括青霉素、甲氧西林、萬古霉素等抗菌藥物。然而抗生素的廣泛使用和不規(guī)范使用，降低了細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的敏感性，導(dǎo)致耐藥性病原菌的出現(xiàn)。此外，生物被膜的形成導(dǎo)致抗生素難以滲透[6]，以及耐藥相關(guān)基因發(fā)生突變都會(huì)引發(fā)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，使細(xì)菌的治療過程非常困難，迫切需要尋找新的抗菌藥物。

依布硒啉是一種含硒化合物，具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗菌抗毒性、抗氧化特性，具有免疫調(diào)節(jié)作用，對(duì)神經(jīng)和心臟具有保護(hù)作用，在臨床中主要用于關(guān)節(jié)炎、哮喘、中風(fēng)、糖尿病等疾病的治療[7]。該化合物的抑制機(jī)制已經(jīng)在酵母和大腸桿菌中進(jìn)行了詳盡的研究，具有巨大的應(yīng)用前景。因此，研究依布硒啉對(duì)MurA和金黃色葡萄球菌的抑制作用具有重要意義。

UDP-N-乙酰葡糖胺烯醇丙酮轉(zhuǎn)移酶(MurA)作為細(xì)胞壁應(yīng)急刺激相關(guān)蛋白的代表基因之一[8]，是肽聚糖生物合成途徑細(xì)胞質(zhì)階段的第一個(gè)酶，可催化兩個(gè)底物UDP-N-乙酰葡萄糖胺(UNAG)和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)，反應(yīng)過程中會(huì)釋放磷酸。在反應(yīng)過程中，UNAG首先與MurA的活性位點(diǎn)結(jié)合，然后PEP的C-2被UNAG的3′-羥基攻擊，產(chǎn)生四面體中間體(THI)；然后MurA催化THI向最終產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，在反應(yīng)過程中捕獲和釋放無機(jī)磷酸[9]。由于MurA是細(xì)菌生長的必需基因，在哺乳動(dòng)物中不存在同源基因，因此MurA可成為重要的潛在靶標(biāo)。許多細(xì)菌菌株的MurA結(jié)構(gòu)和特性都已經(jīng)被鑒定，關(guān)于金黃色葡萄球菌MurA酶及其抑制劑鮮有報(bào)道，因此對(duì)金黃色葡萄球菌MurA的特性進(jìn)行研究具有十分重要的意義。

在本研究中以SauMurA為研究對(duì)象，構(gòu)建了SauMurA蛋白表達(dá)系統(tǒng)，并利用親和層析方法獲得MurA蛋白，對(duì)其酶學(xué)特性進(jìn)行了探究，以期理解其生化特性；利用定點(diǎn)突變的方法對(duì)MurA的6個(gè)特定氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行突變，并構(gòu)建了突變蛋白的表達(dá)體系，通過親和層析方法獲得純化的突變蛋白并對(duì)其活性進(jìn)行鑒定，旨在確定MurA的活性位點(diǎn)。此外，本研究還測定了依布硒啉對(duì)MurA酶和金黃色葡萄球菌的抑制作用，為MurA抑制劑的研究提供了重要的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)，美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC)；UDP-N-乙酰葡糖胺(UNAG)、磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)、刃天青鈉鹽、結(jié)晶紫，依布硒啉，美國Sigma公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、Mutant BEST Kit試劑盒，TaKaRa大連生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1SauMurA蛋白的表達(dá)和純化

利用引物從Sau基因組DNA擴(kuò)增SauMurA基因，然后將SauMurA基因(1266 bp)連接到pJET1.2/鈍載體，產(chǎn)生克隆質(zhì)粒pJET-SauMurA。測序后，將SauMurA連接到 pEHisTEV載體的NcoI和XhoI位點(diǎn)。

將pEHisTEV-SauMurA轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，使細(xì)菌在LB培養(yǎng)基中生長。然后用1 mM異丙基-β-D-硫代乳糖苷(IPTG)在37 ℃下誘導(dǎo)4 h，使MurA蛋白充分表達(dá)。將細(xì)菌培養(yǎng)物以5000×g離心，將細(xì)胞沉淀與裂解緩沖液(50 mM Tris-HCl，pH=8.0，100 mM NaCl，1 mM EDTA，5%甘油)與1 mM苯甲基磺酰氟(PMSF)重懸。通過超聲波法破碎細(xì)胞，然后以10 000×g離心25 min。

首先利用平衡緩沖液(20 mM Tris-HCl，pH=8.0，500 mM NaCl，20%甘油)平衡鎳柱，然后將上清液加到10 mL體積的Ni-NTA色譜柱上；用10 mL 20 mM咪唑緩沖液和5 mL 25 mM咪唑緩沖液洗滌鎳柱；再用5 mL含有1 mM PMSF的洗脫液(20 mM Tris-HCl，pH=8.0，500 mM NaCl，200 mM咪唑)洗脫蛋白。利用SDS-PAGE和Western Blot檢測純化后的蛋白。

1.2.2SauMurA 蛋白的活性檢測

采用孔雀石綠比色法檢測SauMurA活性，該方法廣泛用于無機(jī)磷酸的測定。MurA催化UNAG和PEP，以及反應(yīng)過程中無機(jī)磷酸的釋放。該反應(yīng)體系包括50 mM Tris-HCl、1 mM DTT、0.5 mM PEP、1 mM UNAG、0.25 ng純化的SauMurA蛋白。將底物UNAG、MurA蛋白等組分加入到96孔板中，在37 ℃下孵育5 min，將底物PEP加入到混合物中開始反應(yīng)10 min。然后加入50 μL孔雀石綠溶液反應(yīng)5 min，測定620 nm處的吸光度值。在測定中，反應(yīng)中無SauMurA蛋白的實(shí)驗(yàn)體系作為陰性對(duì)照，Na2HPO4作為陽性對(duì)照。

1.2.3SauMurA酶學(xué)特性的測定

測定SauMurA酶的酶促動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，在96孔板中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次。

在37 ℃條件下將不同濃度的SauMurA蛋白(10、15、20、25 ng/mL)加入到96孔板中，反應(yīng)時(shí)間分別為10、15、20、25 min。繪制酶濃度曲線和時(shí)間濃度曲線，以確定最佳的酶濃度和反應(yīng)時(shí)間。

反應(yīng)分別在18、30、37、42、60、80 ℃下進(jìn)行，測定最佳溫度；利用6種不同pH值的緩沖液(5、6、7、7.5、8、9、10)進(jìn)行反應(yīng)，以確定最佳pH值。此外，不同濃度的Ca2+和Mg2+(0、2.5、5、10、20 mM)加入到反應(yīng)中以確定其對(duì)酶促反應(yīng)的效果。

對(duì)于Km和Vmax，將5種不同濃度的UNAG(0.5、1、2、4、7 mM)和PEP(0.5、1、2、3、4 mM)添加到反應(yīng)中，然后繪制1/V-1/S曲線，并計(jì)算Km和Vmax。

1.2.4SauMurA 活性位點(diǎn)的確定

為了研究SauMurA的活性位點(diǎn)，設(shè)計(jì)了編碼丙氨酸的引物，利用定點(diǎn)突變的方法將6種氨基酸(K22、N23、C119、R124、D308、R400)突變?yōu)楸彼?，通過TaKaRa mutant BEST Kit試劑盒進(jìn)行突變實(shí)驗(yàn)。

突變蛋白的表達(dá)條件與野生型蛋白的表達(dá)條件相似。然而，突變蛋白的可溶性表達(dá)條件可能會(huì)因?yàn)榘被岬娜〈淖儭Ｒ虼?，MurA突變蛋白在30 ℃和37 ℃下以0.1、0.3、0.5、1 mM IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)4 h。

至于突變蛋白的純化，該過程與野生型蛋白相同。特別的是，6種突變蛋白的洗滌緩沖液濃度不同。MurAD308A蛋白洗滌緩沖液的濃度為10 mL 20 mM咪唑緩沖液和5 mL 25 mM咪唑緩沖液，其他蛋白質(zhì)則由10 mL的20 mM咪唑緩沖液洗脫。采用SDS-PAGE和Western Blot檢測突變蛋白純度，采用孔雀石綠比色法檢測純化的MurA突變蛋白的活性，然后計(jì)算蛋白質(zhì)的相對(duì)活性，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 依布硒啉對(duì)MurA抑制活性和類型的測定

將濃度為0.2 mg/mL的依布硒啉用MurA酶和UNAG預(yù)孵育5 min，將底物PEP加入混合物中以在37 ℃條件下開始反應(yīng)10 min。然后通過加入50 μL孔雀石綠溶液停止反應(yīng)，5 min后，測量620 nm處的吸光度值。抑制率的計(jì)算公式為：(OD抑制組-OD正常組)/(OD正常組-OD陰性組)×100%。抑制組含有50 mM Tris-HCl，1 mM DTT，1 mM UNAG，0.5 mM PEP，10 ng/mL MurA蛋白，0.2 mg/mL依布硒啉。陰性組不含MurA和依布硒啉，正常組不含依布硒啉。如果該值小于50%，則化合物的濃度將繼續(xù)半倍稀釋，直到其沒有抑制作用，IC50由GraphPad計(jì)算。為了探究依布硒啉的抑制類型，將1×IC50(4.9 μM)和2×IC50(9.8 μM)的依布硒啉加到MurA酶促反應(yīng)中，然后測定MurA酶活性。

1.2.6 依布硒啉對(duì)金黃色葡萄球菌MIC的測定

依布硒啉對(duì)金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)的抗菌活性通過刃天青染色法法測定，是測量細(xì)菌MIC的最常用方法。氧化狀態(tài)下的刃天青溶液呈藍(lán)紫色無熒光，如果發(fā)生氧化還原反應(yīng)，可用熒光還原成粉紅色還原物質(zhì)，測定OD600可反映細(xì)菌的活性。

MIC測量在在96孔板中進(jìn)行，將生長24 h后的金黃色葡萄球菌濃度稀釋至1×106CFU/mL。在每個(gè)孔內(nèi)加入50 μL LB培養(yǎng)基，并以2倍稀釋法連續(xù)稀釋依布硒啉溶液，最終濃度為0.54～68.5 μg/mL。將只加50 μL LB培養(yǎng)基的孔作為陰性對(duì)照，50 μL終濃度為25 μg/mL卡那霉素(Kan)的孔為陽性對(duì)照。最后，向每個(gè)孔中加入50 μL細(xì)菌培養(yǎng)物。用Bemis Parafilm(PM-996)密封板并在37 ℃下孵育24 h，然后將100 μL刃天青染料加入每個(gè)孔中，孵育12 h，觀察顏色并測量OD600。培養(yǎng)物顏色不變的濃度即藥物的MIC。

1.2.7 依布硒啉對(duì)金黃色葡萄球菌生長的作用

分別利用0.5×MIC，1×MIC，4×MIC的依布硒啉處理細(xì)菌培養(yǎng)物，對(duì)照組不作處理。每隔4 h測定OD600，同時(shí)取10 μL細(xì)菌培養(yǎng)物進(jìn)行CFU測定。CFU/mL=菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×100%。

1.2.8 依布硒啉對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜的作用

培養(yǎng)金黃色葡萄球菌當(dāng)OD600達(dá)0.05時(shí)，用改進(jìn)的M63培養(yǎng)基稀釋100 μL的細(xì)菌培養(yǎng)物。將150 μL的細(xì)菌培養(yǎng)物稀釋到U-Bottom 96孔板(Costar)中，并用Bemis Parafilm(PM-996)密封板。在37 ℃孵育24 h后，輕輕取出培養(yǎng)物并用PBS洗滌3次。分別用0.5×MIC，1×MIC，2×MIC，4×MIC，8×MIC，16×MIC的依布硒啉處理生物膜，對(duì)照組不作處理。孵育24 h后，用0.01%結(jié)晶紫染色生物膜15 min，然后用PBS洗滌3次。最后加入95%乙醇溶解生物膜2 min，將結(jié)合生物膜的染料移至96孔板中并測定OD600，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用GraphPad Prism 6.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較應(yīng)用單因素方差分析，兩組間比較應(yīng)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 表達(dá)并純化Sau MurA蛋白

成功構(gòu)建了SauMurA的表達(dá)系統(tǒng)，MurA 蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)，并通過Ni柱親和層析法純化。通過SDS-PAGE和Western Blot檢測蛋白質(zhì)的純度，MurA蛋白的預(yù)期分子量為48.28 kDa，見圖1。

圖1 Sau MurA蛋白的SDS-PAGE(a)和Western Blot(b)檢測

2.2 分析Sau MurA蛋白的酶促動(dòng)力學(xué)性質(zhì)

采用孔雀石綠法檢測SauMurA的活性，結(jié)果表明MurA蛋白表現(xiàn)出UDP-N-乙酰葡糖胺烯醇丙酮基轉(zhuǎn)移酶的活性。為了了解MurA的酶促性質(zhì)，探究了SauMurA蛋白的酶促動(dòng)力學(xué)，首先確定最佳反應(yīng)系統(tǒng)，蛋白質(zhì)的最佳濃度為10 ng/mL、反應(yīng)時(shí)間為10 min，見圖2a、2b。MurA蛋白在37 ℃，pH=7.5下顯示出最大活性，見圖2c、2d。此外，MurA活性不依賴于Ca2 +和Mg2 +，見圖2e、2f；并計(jì)算了兩個(gè)底物UNAG和PEP的Km和Vm。UNAG和PEP的Km值分別為(0.2379±0.0434)mM和(0.5305±0.0461)mM，UNAG和PEP的Vm值分別為(0.1546±0.0077)mM/min和(0.7772±0.0658)mM/min，見圖2g、2h。

a：MurA時(shí)間曲線；b：MurA酶濃度曲線；c～d：溫度(c)和pH(d)對(duì)MurA活性的影響；e～f：Ca2+(e)和Mg2+(f)對(duì)MurA活性的影響；g～h：UDP-GlcNAc(g)和PEP(h)的Km和Vmax。

2.3 確定Sau MurA酶的活性位點(diǎn)

利用定點(diǎn)突變的方法對(duì)氨基酸的重要活性位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證。在本研究中，設(shè)計(jì)了編碼丙氨酸的引物，將6種氨基酸(K22，N23，C119，R124，D308，R400)替換為丙氨酸。通過SDS-PAGE和Western Blot檢測，對(duì)6種突變蛋白進(jìn)行純化和檢測，見圖3，并計(jì)算出突變蛋白的相對(duì)活性。結(jié)果表明，所有突變蛋白都沒有顯示出活性，見圖4。

a、b：M：蛋白標(biāo)準(zhǔn)品；1：Sau MurAK22A；2：Sau MurAN23A；3：Sau MurAC119A；4：Sau MurAR124A；5：Sau MurAD308A；6：Sau MurAR400A。

與對(duì)照組相比，**P<0.01。

2.4 依布硒啉對(duì)MurA的抑制作用和類型

依布硒啉對(duì)MurA活性具有抑制作用，IC50為4.9 μM，見表1，同時(shí)探究了該化合物對(duì)MurA的抑制類型。結(jié)果表明依布硒啉與PEP是競爭性抑制，見圖5b，與UNAG是反競爭性抑制，見圖5c。

表1 依布硒啉的IC50和MIC

a：依布硒啉的化學(xué)結(jié)構(gòu)；b：依布硒啉與PEP的抑制作用；c：依布硒啉與UNAG的抑制作用。

2.5 依布硒啉對(duì)金黃色葡萄球菌的生長抑制作用

本研究測定了依布硒啉對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制活性，依布硒啉對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑制濃度為4.28 μg/mL，見表1。然后分別用0.5×MIC，1×MIC，4×MIC的依布硒啉處理金黃色葡萄球菌，繪制生長曲線和CFU曲線，見圖6。結(jié)果表明，當(dāng)依布硒啉濃度為0.5×MIC和1×MIC時(shí)，細(xì)菌生長趨勢緩慢，低于對(duì)照組；當(dāng)濃度達(dá)到4×MIC時(shí)，細(xì)菌明顯受到抑制，活菌數(shù)量逐漸減少直至死亡。

圖6 金黃色葡萄球菌ATCC 25923的生長曲線和CFU曲線

2.6 依布硒啉對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜的去除作用

此外，本文還探究了依布硒啉對(duì)金黃色葡萄球菌的成熟生物膜的作用。結(jié)果表明，當(dāng)利用不同濃度的化合物處理細(xì)菌生物膜時(shí)，該化合物可以明顯去除粘附的生物膜。當(dāng)藥物濃度為16×MIC時(shí)，對(duì)于金黃色葡萄球菌的抑制率約為80%，相比之下，作為對(duì)照組的利福平僅減少了約40%的生物膜，見圖7。這些數(shù)據(jù)表明，依布硒啉對(duì)成熟的生物膜有高效的去除作用。

與對(duì)照組相比，** P<0.01。

3 討 論

在過去的幾十年里，MurA作為重要的靶標(biāo)，對(duì)許多細(xì)菌MurA酶的結(jié)構(gòu)和特征進(jìn)行了深入研究。近年來國內(nèi)外報(bào)道了幾篇有關(guān)MurA酶的文章。FUNES CHABN等人[10]研究發(fā)現(xiàn)了來自植物的抗菌二萜及其合成類似物對(duì)大腸桿菌MurA和金黃色葡萄球菌MurA具有有效的抑制作用。CHANG等人[11]在費(fèi)希新薩托菌中提取分離了3種對(duì)MRSA具有抑制作用的燕麥曲菌素，其中1號(hào)和2號(hào)化合物能同時(shí)抑制野生型菌株和耐磷霉素菌株的MurA酶；并通過分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)證明了2號(hào)燕麥曲菌素競爭性地阻斷了四面體中間復(fù)合物的形成。SONKAR等人[12]對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的MurA進(jìn)行了生物化學(xué)和結(jié)構(gòu)性質(zhì)的研究，結(jié)果表明最佳溫度是37 ℃、pH=8，UNAG和PEP的Km分別是(1.062±0.09)mM和(1.806±0.23)mM，證明Cys116是與磷霉素結(jié)合的重要活性位點(diǎn)。在我們的研究中，確定了SauMurA的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。UNAG和PEP的Km分別為(0.2379±0.0434)mM和(0.5305±0.0461)mM?；诓煌?xì)菌MurA酶的數(shù)據(jù)，將本研究中SauMurA與其他細(xì)菌MurA酶的Km數(shù)值進(jìn)行了對(duì)比[13-20]。SauMurA對(duì)UNAG的Km值低于肺炎鏈球菌，結(jié)核分枝桿菌，恥垢分枝桿菌，鮑曼不動(dòng)桿菌；對(duì)PEP的Km值僅低于鮑曼不動(dòng)桿菌。這說明了不同物種的MurA對(duì)兩個(gè)底物UNAG和PEP的親和性是不同的，SauMurA對(duì)UNAG和PEP的親和力較低。

對(duì)SauMurA與其他細(xì)菌序列的對(duì)比顯示，該菌株具有保守的氨基酸殘基。此外，通過定點(diǎn)突變方法對(duì)MurA重要的活性位點(diǎn)(K22，N23，C119，R124，D308，R400)進(jìn)行了驗(yàn)證。據(jù)報(bào)道，Lys22參與酶的催化過程以及與PEP形成共價(jià)鍵[21]。Cys119作為主要的催化殘基，它的取代可以導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)磷霉素產(chǎn)生抗性。此外，Cys119還參與了MurA產(chǎn)物釋放過程，進(jìn)而影響酶的催化過程。Asn23和Asp308分別與UNAG形成一個(gè)氫鍵和兩個(gè)氫鍵[15]，同時(shí)Asp308在四面體中間復(fù)合物的形成過程中也發(fā)揮了重要作用[14]。另外，Lys22，Arg124和Arg400參與了無機(jī)磷酸的產(chǎn)生與釋放過程[9]。

金黃色葡萄球菌在體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生20多種毒力因子[22]，包括α-溶血素、腸毒素、血漿凝固酶、中毒性休克毒素-1、凝集因子A、殺白細(xì)胞毒素、剝脫毒素A等[23]，這些毒力因子通過調(diào)控宿主的免疫應(yīng)答系統(tǒng)，增強(qiáng)金黃色葡萄球菌的致病性及耐藥性[1]。隨著耐藥性金黃色葡萄球菌菌株的產(chǎn)生，傳統(tǒng)的抗生素不再奏效。因此，迫切需要尋找新的抗菌藥物。依布硒啉是一種含有硒的化合物，具有抗炎、抗氧化和細(xì)胞保護(hù)活性，主要用于心腦血管疾病的治療以及抗炎和噪聲致聽力損傷防治的研究[24]。本研究中我們發(fā)現(xiàn)依布硒啉抑制了金黃色葡萄球菌MurA酶的活性，此外有研究報(bào)道依布硒啉對(duì)耐藥金黃色葡萄球菌臨床分離株的強(qiáng)效殺菌活性，在我們的研究中證實(shí)了依布硒啉的抗菌活性，對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為 4.28 μg/mL。

生物膜的形成是大多數(shù)細(xì)菌的自然現(xiàn)象，主要附著在機(jī)體或物體表面，當(dāng)機(jī)體組織受損時(shí)，細(xì)菌會(huì)分泌大量毒素導(dǎo)致感染[25]。金黃色葡萄球菌及其分泌的毒素會(huì)形成密集的生物膜，向外分泌細(xì)胞外聚合物基質(zhì)，形成具有組織性和功能性的細(xì)菌聚合體[26]。生物膜阻礙藥物的滲透，降低對(duì)宿主防御系統(tǒng)、抗生素和其他藥物的敏感性，導(dǎo)致了金黃色葡萄球菌在慢性感染中的持久性，從而產(chǎn)生耐藥菌株[27-28]。因此，需要探索新的藥物治療細(xì)菌的生物膜感染。本部分實(shí)驗(yàn)證明了依布硒啉能夠有效去除金黃色葡萄球菌的生物膜，與對(duì)照組相比，抑制率高出40%，展現(xiàn)了依布硒啉對(duì)成熟生物膜高效的去除能力。這些研究結(jié)果為耐藥金黃色葡萄球菌抑制作用的進(jìn)一步研究以及依布硒啉在臨床治療中的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。