劉欣鑫，姚必君，劉昱宏，邵端陽(yáng)，韓冠英

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院；2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院，遼寧 錦州 121000)

堿蓬(Suaedasalsa，SS)為一年生草本植物。具有降血脂、清熱消積、提高免疫力和抗腫瘤等功效[1]。植物多糖是近幾年來(lái)研究的熱點(diǎn)，是一類(lèi)具有多種生物活性和功能的大分子物質(zhì)[2-4]。堿蓬多糖(Suaedasalsapolysaccharide，SSP)是從堿蓬中提取的主要活性成分，劉欣鑫等采用水提醇沉的方法優(yōu)化了堿蓬多糖的提取工藝[5]，得到了成分均一的堿蓬多糖并驗(yàn)證了其抗腫瘤活性。然而，純度高的多糖得率較低，多糖的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和理化性質(zhì)導(dǎo)致多糖代謝較快，難以在血漿中長(zhǎng)時(shí)間滯留，而多糖脂質(zhì)體制劑的開(kāi)發(fā)不僅能提高其穩(wěn)定性，還可提高其生物利用度[6]。

新型脂質(zhì)體有很多種類(lèi)型，而長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體(long-curculating liposome，LCL)為其中一種，這種類(lèi)脂衍生物的新型脂質(zhì)體的表面均通過(guò)天然或合成聚合物修飾[7]，其中研究較為廣泛和深入的是聚乙二醇修飾聚合物[8]。衍生化磷脂由聚乙二醇分子與磷脂分子通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合所形成，其能夠有效保護(hù)脂質(zhì)體，通過(guò)阻止血液中不同組分對(duì)脂質(zhì)體的結(jié)合[9]，使脂質(zhì)體的識(shí)別和攝取顯著降低，延長(zhǎng)了體循環(huán)時(shí)間，提高了半衰期；同時(shí)更容易通過(guò)腫瘤新生血管間隙滲漏到腫瘤組織中，使腫瘤部位的藥物攝取率得到提高[10]。因此，本研究將SSP制備成長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體(SSP-LCL)，改善藥物在體內(nèi)的吸收，達(dá)到長(zhǎng)效緩釋的效果，為研發(fā)新型抗腫瘤藥物提高一定的理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

堿蓬(遼寧省錦州市沿海灘涂濕地；經(jīng)錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院韓冠英教授鑒定為堿蓬屬堿蓬草)；大豆磷脂(上海太偉藥業(yè)有限公司)；膽固醇(上?？萍坚t(yī)藥有限公司)；PEG2000-DSPE(上海麥克林生化科技有限公司)；其余均為分析純。

電子天平(上海元析儀器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；溶出儀(上海申安醫(yī)療器械)；透析袋(Sigma公司)；Agilent 1200高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)；高速離心機(jī)(江蘇金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 堿蓬多糖的制備

取堿蓬的干燥葉粉碎后，過(guò)20目篩。稱(chēng)取堿蓬粗粉以80%乙醇回流脫脂，每次2 h。提取完畢，過(guò)濾，殘?jiān)糜诤嫦鋬?nèi)烘干。殘?jiān)?0倍量水于80 ℃水浴鍋中加熱回流提取，每次3 h。浸提后抽濾，3000 r/min離心15 min，取上清液濃縮，按Sevag法脫蛋白后，加3倍量的90%乙醇過(guò)夜沉淀，離心，冷凍干燥，即得堿蓬粗多糖。稱(chēng)取0.5 g樣品堿蓬粗多糖分別加載到DEAE-52纖維素陰離子交換柱(2.6 cm×30 cm)和Sephadex G-75凝膠柱上，進(jìn)行梯度洗脫，每5 mL收集一管，合并單一峰位收集，冷凍干燥得均一堿蓬多糖SSP[5]。通過(guò)高效凝膠滲透色譜法測(cè)定，色譜柱為T(mén)SK-gel G3000PWxl(7.5 mm×300 mm)凝膠色譜柱，流動(dòng)相為0.05 M NaCl，流速為0.5 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，得到分子量為53.8 kDa的均一多糖。

1.2.2 堿蓬多糖長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體的制備工藝

稱(chēng)取適量的大豆磷脂、膽固醇、PEG2000-DSPE，均置入250 mL旋蒸瓶中，加20 mL三氯甲烷使其溶解，減壓除有機(jī)溶劑(50 ℃，60 r/min)，旋蒸至溶液在瓶壁上形成透明均勻薄膜。同時(shí)，稱(chēng)取2 mg SSP，加入pH=6.4磷酸鹽緩沖液使其溶解，與上述旋蒸瓶中溶液混合均勻，攪拌水化，水溶超聲20 min，即得SSP-LCL混懸液初品。通過(guò)0.1 μm脂質(zhì)體擠出器將SSP-LCL混懸液擠出數(shù)次，得到帶乳光的SSP-LCL濃溶液混懸液，調(diào)整體積，0.22 μm PVDF膜過(guò)濾除菌，充氮、灌封，即得SSP-LCL。

1.2.3 包封率的測(cè)定

稱(chēng)取10 mg SSP，加水溶解轉(zhuǎn)移容量瓶中，定容至100 mL，震蕩均勻，將濃度為100 mg/L的SSP溶液作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。吸取上述溶液，加流動(dòng)相分別稀釋成濃度為0、8、20、50、80、100 μg/mL的SSP對(duì)照品溶液，將數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸分析，以峰面積(A)為縱坐標(biāo)，濃度(C)為橫坐標(biāo)，苯酚-硫酸法制作多糖含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=210.58C+82.37(r=0.9998)。

采用低溫超速離心法測(cè)定包封率。精密吸取SSP-LCL 1 mL于離心管中，將其放置在高速離心機(jī)中離心90 min，轉(zhuǎn)速為20 000 r/min，確保脂質(zhì)體與游離藥物分離，吸取上清液到容量瓶中，用甲醇定容至10 mL，作為W游離；同時(shí)量取1 mL SSP-LCL至50 mL容量瓶中進(jìn)行破乳，試劑為2 mL乙醇/氯仿(2∶1)的混合溶液，甲醇定容作為W總，分別測(cè)定，計(jì)算包封率(EE%)：EE%=(W總-W游離)/W總×100%。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

采用1.2.1項(xiàng)下方法制備SSP-LCL，處方篩選條件為：固定處方條件為PEG2000-DSPE濃度0.5 mg/mL、磷脂與藥物的質(zhì)量比30∶1、磷脂與膽固醇的質(zhì)量比10∶1、考察不同磷脂濃度(10、20、30、40、50、60 mg/mL)對(duì)SSP-LCL包封率的影響；固定處方條件為磷脂濃度20 mg/mL、磷脂與藥物的質(zhì)量比30∶1、磷脂與膽固醇的質(zhì)量比10∶1、考察不同PEG2000-DSPE濃度(0.1、0.25、0.5、0.7、0.9、1.0 mg/mL)對(duì)SSP-LCL包封率的影響；固定處方條件為磷脂濃度20 mg/mL、PEG2000-DSPE濃度0.5 mg/mL、磷脂與膽固醇的質(zhì)量比10∶1、考察不同磷脂與藥物的質(zhì)量比(15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1)對(duì)SSP-LCL包封率的影響；固定處方條件為磷脂濃度20 mg/mL、PEG2000-DSPE濃度0.5 mg/mL、磷脂與藥物的質(zhì)量比30∶1、考察不同磷脂與膽固醇的質(zhì)量比(3∶1、5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1)對(duì)SSP-LCL包封率的影響；進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，考察各因素變量對(duì)SSP-LCL包封率的影響。

1.2.5 Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

使用單因素試驗(yàn)初步揭示規(guī)律，各因素再選取對(duì)SSP-LCL包封率影響最大3個(gè)的水平，使用Box-Benhnken分析方法建立一個(gè)4因素3水平的中心組合實(shí)驗(yàn)，響應(yīng)值為SSP-LCL的包封率，使用-1、0、1對(duì)試驗(yàn)中各因素的3個(gè)水平進(jìn)行編碼，見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素水平和編碼

1.2.6 堿蓬多糖長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體體外釋放考察

在SSP-LCL體外釋放考察過(guò)程中，釋放介質(zhì)選取pH=6.8的PBS溶液。稱(chēng)取步驟1.2.2中0.5 g SSP-LCL，加2 mL水使其溶解，將樣品轉(zhuǎn)移到透析袋中，同時(shí)加入20 mL釋放介質(zhì)，在37 ℃恒溫條件下進(jìn)行透析，轉(zhuǎn)速為100 r/min，在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)取適量的釋放介質(zhì)，同時(shí)添加與其體積、溫度均相同的新鮮釋放介質(zhì)。采用HPLC測(cè)定釋放介質(zhì)中SSP-LCL濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 磷脂濃度對(duì)包封率的影響

脂質(zhì)體的包封率變化與磷脂濃度相關(guān)。包封藥物的能力在低磷脂濃度條件下較弱，而濃度太高會(huì)發(fā)生聚集并導(dǎo)致穩(wěn)定性下降[11]，當(dāng)磷脂濃度30 mg/mL時(shí)，包封率明顯減小。以上結(jié)果提示包封率受磷脂濃度影響，繼續(xù)將其作為響應(yīng)面法優(yōu)化處方工藝的考察因素，磷脂濃度為30 mg/mL是比較合適的處方條件，見(jiàn)圖1。

圖1 磷脂濃度對(duì)包封率的影響

2.1.2 PEG2000-DSPE濃度對(duì)包封率的影響

包封率變化與PEG2000-DSPE濃度變化相關(guān)，呈現(xiàn)出PEG2000-DSPE濃度由低到高的過(guò)程中二者共同增加，到一定PEG2000-DSPE濃度后包封率會(huì)隨之降低。該現(xiàn)象原因考慮為過(guò)高的PEG2000-DSPE濃度占據(jù)脂質(zhì)雙層膜空間，影響包封率的減小。因此，PEG2000-DSPE濃度為0.7 mg/mL為較合適的處方工藝，見(jiàn)圖2。

圖2 PEG2000-DSPE濃度對(duì)包封率的影響

2.1.3 磷脂與藥物的質(zhì)量比對(duì)包封率的影響

包封率與脂藥比之間呈現(xiàn)出正相關(guān)的趨勢(shì)，且脂藥比為20∶1時(shí)，包封率的值呈穩(wěn)定趨勢(shì)。包封率的值受磷脂與藥物比例的嚴(yán)重影響，磷脂對(duì)藥物的承載能力也同樣有限，所以當(dāng)堿蓬多糖的投藥量過(guò)大時(shí)，脂質(zhì)囊材沒(méi)有足夠的空間對(duì)大量的藥物進(jìn)行包封，引起包封率明顯降低，甚至可能出現(xiàn)藥物析出的情況；若投藥量過(guò)小，則包封率高，載藥量小。由此可見(jiàn)，合適的處方條件為脂藥比20∶1，見(jiàn)圖3。

圖3 磷脂/藥物對(duì)包封率的影響

2.1.4 磷脂與膽固醇的質(zhì)量比對(duì)包封率的影響

隨著膽固醇比例的降低，包封率的值表現(xiàn)為先增大后減小，當(dāng)膜材比為15∶1時(shí)，包封率達(dá)到最大值。究其原因，可能是膽固醇具有調(diào)節(jié)磷脂流動(dòng)性的特性，起到穩(wěn)定脂質(zhì)雙分子膜的作用，但當(dāng)膽固醇所占比例太大時(shí)，其在脂質(zhì)雙層膜中也占據(jù)相當(dāng)?shù)目臻g，這時(shí)的膽固醇則出現(xiàn)干擾脂質(zhì)囊泡形成的行為，表現(xiàn)為包封率降低[12]。綜上所述，脂質(zhì)體的載藥量和脂質(zhì)體的穩(wěn)定性都與膜材比密切相關(guān)，見(jiàn)圖4。

圖4 磷脂/膽固醇對(duì)包封率的影響

2.2 BBD實(shí)驗(yàn)結(jié)果及數(shù)據(jù)分析

2.2.1 BBD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Design-Expert8.0.6統(tǒng)計(jì)分析軟件給出的實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表2，以SSP-LCL的包封率為響應(yīng)值，以磷脂濃度(A)、PEG2000-DSPE濃度(B)、磷脂與藥物的質(zhì)量比(C)、磷脂與膽固醇的質(zhì)量比(D)為自變量，建立4因素3水平中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，可得到29個(gè)實(shí)驗(yàn)方案用以計(jì)算實(shí)驗(yàn)誤差。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)分析方案及結(jié)果

2.2.2 回歸方程擬合及方差分析

通過(guò)Design Expert 8.0.6統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)各因素進(jìn)行回歸方程擬合并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程：Y=+85.62+4.59A+9.17B+3.23C+3.54D+5.03AB+0.52AC+0.58AD-2.60BC+1.60BD+1.15CD-7.93A2-9.5B2-5.13C2-5.68D2；回歸模型的R2=0.9787，RAdj2=0.9574，由方差分析可知回歸方程模型差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001)，證明該方法可行性高，模型與實(shí)際擬合良好，失擬項(xiàng)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，回歸方程可以代替實(shí)驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)，并以此為依據(jù)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果見(jiàn)表3，磷脂濃度(A)、PEG2000-DSPE濃度(B)、磷脂與藥物的質(zhì)量比(C)、磷脂與膽固醇的質(zhì)量比(D)、磷脂濃度與PEG2000-DSPE濃度交互項(xiàng)(AB)、PEG2000-DSPE濃度與磷脂與藥物的質(zhì)量比交互項(xiàng)(BC)、磷脂濃度二次項(xiàng)(A2)、PEG2000-DSPE濃度二次項(xiàng)(B2)、磷脂與藥物的質(zhì)量比二次項(xiàng)(C2)、磷脂與膽固醇的質(zhì)量比二次項(xiàng)(D2)對(duì)響應(yīng)值影響顯著。

表3 回歸模型及方差分析

2.2.3 響應(yīng)面圖分析

當(dāng)存在多因素影響實(shí)驗(yàn)條件時(shí)，可使用響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果，通過(guò)固定的實(shí)驗(yàn)次數(shù)可以對(duì)試驗(yàn)因素進(jìn)行連續(xù)分析，并生成直觀的3D曲面圖用于進(jìn)一步評(píng)價(jià)各因素間的交互作用[13-14]。通過(guò)軟件Design-Expert得到響應(yīng)值的3D曲面，可進(jìn)一步分析各因素對(duì)SSP-LCL包封率的影響及各因素間的交互作用。由圖5可知，磷脂濃度、PEG2000-DSPE濃度、脂藥比和膜材比4個(gè)因素中，當(dāng)兩個(gè)因素為零水平時(shí)，另外兩個(gè)因素間的交互作用對(duì)包封率均有一定程度的影響。包封率隨其中兩個(gè)因素的增加而提高，上升到某一程度時(shí)，曲面略呈現(xiàn)下降或平緩趨勢(shì)，結(jié)果見(jiàn)圖5。其中圖5a和圖5d曲面陡峭，說(shuō)明磷脂濃度和PEG2000-DSPE濃度、PEG2000-DSPE濃度和脂藥比之間交互作用較明顯，與方差分析結(jié)果相符。

a

固定脂藥比、膜材比為零水平，磷脂濃度和PEG2000-DSPE濃度對(duì)包封率的影響和兩者之間的交互作用。隨磷脂濃度增加，包封率呈現(xiàn)先上升后平緩下降的趨勢(shì)；磷脂濃度較高時(shí)，隨溫度增加，包封率呈現(xiàn)先上升再趨于平緩的趨勢(shì)；在固定PEG2000-DSPE濃度條件下，隨磷脂濃度增加，包封率呈現(xiàn)先上升后平緩下降的趨勢(shì)。分析響應(yīng)面圖結(jié)果可見(jiàn)，與磷脂濃度相比，PEG2000-DSPE濃度上升的幅度更陡峭，提示包封率受PEG2000-DSPE濃度影響大于磷脂濃度，見(jiàn)圖5a。固定磷脂濃度和膜材比為零水平，脂藥比和PEG2000-DSPE濃度對(duì)包封率的影響和兩者之間的相互影響程度。隨脂藥比和PEG2000-DSPE濃度的增加，包封率呈先上升后平緩下降的趨勢(shì)，PEG2000-DSPE濃度的上升幅度顯著大于脂藥比的上升幅度，提示包封率受PEG2000-DSPE濃度影響更大，見(jiàn)圖5d。

2.2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過(guò)求解回歸方程，得到最優(yōu)化的處方條件為磷脂濃度為32.72 mg/mL、PEG2000-DSPE濃度為0.69 mg/mL、磷脂與藥物的質(zhì)量比為20.32∶1、磷脂與膽固醇的質(zhì)量比為17.70∶1，最大包封率達(dá)到89.87%，為方便實(shí)際操作將實(shí)驗(yàn)條件定為磷脂濃度33 mg/mL、PEG2000-DSPE濃度0.7 mg/mL、磷脂與藥物的質(zhì)量比20∶1、磷脂與膽固醇的質(zhì)量比為18∶1。在處方優(yōu)化后的條件下進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，所得平均包封率為88.25%。結(jié)果表明，實(shí)際值與回歸方程擬合出的理論值匹配程度相似，表明響應(yīng)面法可以有效的優(yōu)化SSP-LCL的處方工藝。

2.2.5 堿蓬多糖與堿蓬多糖長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體體外釋放測(cè)定結(jié)果

SSP-LCL釋放緩慢，在9 h時(shí)僅釋放80.2%，可能是由于脂質(zhì)雙分子層中的膽固醇對(duì)磷脂膜起到了穩(wěn)定作用，可減緩藥物從膜內(nèi)到膜外的釋放，說(shuō)明SSP制備成長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體后具有一定的緩釋效應(yīng)，見(jiàn)圖6。

圖6 SSP-LCL體外釋放曲線

3 討 論

植物多糖是一種天然高分子聚合物，具有廣泛的生物活性，但由于其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，應(yīng)用上受到了一些限制。隨著多糖納米技術(shù)的研究與發(fā)展，我們可以進(jìn)一步改善藥物的穩(wěn)定性，并延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)的作用時(shí)間。相比于普通脂質(zhì)體而言，聚乙二醇修飾的長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體的物理、化學(xué)和生物穩(wěn)定性均顯著提高，不僅減少了滲漏、聚集和融合，再分散性也明顯增加。近年來(lái)，聚乙二醇長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體在其領(lǐng)域的應(yīng)用研究中取得了進(jìn)展，此類(lèi)脂質(zhì)體可包載的藥物種類(lèi)繁多，并在相關(guān)研究論文及專(zhuān)利申請(qǐng)中占有很大比例[15-16]。

本實(shí)驗(yàn)采用Box-Behnken效應(yīng)面法對(duì)SSP-LCL的處方工藝進(jìn)行優(yōu)化，建立了包封率的回歸模型，通過(guò)優(yōu)化選取合適的處方條件為：磷脂濃度33 mg/mL、PEG2000-DSPE濃度0.7 mg/mL、磷脂與藥物的質(zhì)量比20∶1、磷脂與膽固醇的質(zhì)量比為18∶1。SSP-LCL的平均包封率為88.25%，該數(shù)據(jù)的值貼近模型預(yù)測(cè)的結(jié)果，可證明該模型具有一定的可靠性。通過(guò)體外透析實(shí)驗(yàn)考察SSP-LCL的體外釋放度，并與SSP進(jìn)行比較，說(shuō)明SSP-LCL具有緩釋效應(yīng)。