劉忠義 劉 聰 馬永璠 趙 威 劉艷華 初洪波*

（1長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 長春 130117）

（2長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院， 長春 130021）

益腎排石方以國醫(yī)大師任繼學(xué)教授“益腎通腑”學(xué)術(shù)思想為指導(dǎo)，由金錢草、雞內(nèi)金和牛膝等13 味中藥組成，具有益腎清利濕熱、散瘀通淋排石的功效，治療腎結(jié)石的療效顯著。腎結(jié)石患者眾多，根據(jù)中藥復(fù)方多成分-多靶點-多通路的特點，建立全面闡述益腎排石方有效成分、作用靶點和通路的方法具有重大的臨床和社會意義［1-3］。

近年來，針對中藥復(fù)方有效成分和作用靶點的分析，一般應(yīng)用超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（UHPLC-MS/MS）進(jìn)行成分鑒定； 應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)從系統(tǒng)層次、生物層次等整體角度出發(fā)闡明中藥復(fù)方治療疾病的作用機制； 應(yīng)用GEO數(shù)據(jù)庫中真實臨床數(shù)據(jù)篩選疾病相關(guān)差異基因靶點［4］； 應(yīng)用分子對接技術(shù)對有效成分和關(guān)鍵靶點進(jìn)行對接驗證［5］。特別是應(yīng)用指紋圖譜分析中藥復(fù)方中所包含的化學(xué)信息，因其綜合、可量化地鑒定中藥的化學(xué)成分，并能評價中藥及制劑整體性和穩(wěn)定性的特點，成為近年來研究的熱點［6］。

本研究的創(chuàng)新性在于組合應(yīng)用了上述方法，從串聯(lián)質(zhì)譜鑒定的有效物質(zhì)基礎(chǔ)出發(fā)，建立了益腎排石方的高效液相色譜法（HPLC）指紋圖譜； 從中藥復(fù)方與病證的關(guān)聯(lián)機制出發(fā)，將分子對接驗證與GEO數(shù)據(jù)庫、Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫和TCMSP數(shù)據(jù)庫相結(jié)合，結(jié)合文獻(xiàn)的研究方法［7］，預(yù)測分析了治療腎結(jié)石的關(guān)鍵成分、關(guān)鍵靶點和通路，為益腎排石方質(zhì)量控制提供參考，也為其臨床治療腎結(jié)石奠定理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

Thermo Vanquish 型超高效液相色譜儀（UHPLC，賽默飛世爾科技公司）；Q-Exactive HF 型高分辨質(zhì)譜儀（HRMS，賽默飛世爾科技公司）；TGL-16M 型離心機（長沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機儀器有限公司）；JXFSTPRP-48 型全自動樣品快速研磨儀（上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司）；KQ-00DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；FD-IA-50型冷凍干燥機（上海比郎儀器制造有限公司）；GWB-2B型超純水器（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；G560E 型渦旋儀（美國Scientific Industries 公司）；LC-2030C 3D Plus型島津高效液相色譜儀（HPLC，日本島津公司）。

異丙醇、乙腈、甲醇（質(zhì)譜級，Merck KGaA 公司）、甲酸（質(zhì)譜級，西亞試劑公司）、2-氯丙氨酸（質(zhì)譜級，上海源葉生物科技有限公司）、乙腈（色譜純，美國Fisher 公司）、甲醇（分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司）和磷酸（分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠）。對照品王不留行黃酮苷、松脂醇二葡萄糖苷、虎杖苷、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、蘆丁、木蝴蝶苷A、大黃酸、異橙黃酮、蘆薈大黃素、白楊素、大黃酚、厚樸酚、大黃素甲醚、漢黃芩素和大黃素購自成都普思生物科技股份有限公司。

金錢草為報春花科植物過路黃（Lysimachia christinaeHance）的干燥全草；厚樸為木蘭科植物厚樸（Magnolia officinalisRehd.et Wils.）的干燥干皮、根皮及枝皮；牛膝為莧科植物牛膝（Achyranthes bidentataBL.）的干燥根；柴胡為傘形科植物柴胡（Bupleurum chineseDC.）的干燥根；枸杞子為茄科植物寧夏枸杞（Lycium barbarumL.）的干燥成熟果實；枳實為蕓香科植物酸橙（Citrus aurantiumL.）的干燥幼果；王不留行為石竹科植物麥藍(lán)菜（Vaccaria segetalis（Neck.） Garcke）的干燥成熟種子；路路通為金縷梅科植物楓香樹（Liquidambar formosanaHance）的干燥成熟果序；虎杖為廖科植物虎杖（Polygonum cuspidatumSieb.et Zucc.）的干燥根莖和根；大黃為蓼科植物掌葉大黃（Rheum palmatumL.）的干燥根和根莖；杜仲為杜仲科植物杜仲（Eucommia ulmoidesOliv.）的干燥樹皮；黃芩為唇形科植物黃芩（Scutellaria baicalensisGeorgi）的干燥根；雞內(nèi)金為雉科動物家雞（Gallus gallus domesticusBrisson）的干燥沙囊內(nèi)壁。經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)肖景雷教授鑒定，所購買的飲片均為正品。藥材產(chǎn)地信息及批次見輔助材料表S1。

1.2 實驗方法

1.2.1 UHPLC-MS/MS分析

1.2.1.1 樣品提取方法

益腎排石樣品的制備 取金錢草15 g、虎杖5 g、黃芩5 g、牛膝5 g、柴胡5 g、枸杞子10 g、枳實5 g、大黃5 g、厚樸5 g、杜仲10 g、王不留行5 g、雞內(nèi)金10 g 和路路通5 g 共13 種藥材飲片按益腎排石處方量煎煮益腎排石樣品，加入藥物質(zhì)量6倍量水，煎煮3次，每次1.5 h，頭煎多加2.5倍量水，過濾后合并濾液，冷凍干燥。

供試品溶液的制備 取上述益腎排石凍干粉樣品100 mg 置2 mL 離心管中，加入1 mL 體積分?jǐn)?shù)70%的甲醇和直徑3 mm的鋼珠，用全自動樣品快速研磨儀震蕩破碎3 min，冷卻后低溫超聲10 min，離心10 min（4 ℃，12000 r/min），取上清液稀釋，加入10 μL 100 μg/mL 2-氯苯丙氨酸內(nèi)標(biāo)，過0.22 μm 濾膜，即得。

1.2.1.2 色譜條件

色譜柱： Zorbax Eclipse C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相：0.1%甲酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫條件見表1。

表1 超高效液相色譜梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure of ultra performance liquid chromatography

1.2.1.3 質(zhì)譜條件

正、負(fù)離子模式： 離子源加熱器溫度325 ℃； 鞘氣流速： 810 L/h； 輔助氣流速： 270 L/h； 吹掃氣流速：18 L/h； 電噴霧電壓： 3.5 kV； 毛細(xì)管溫度： 330 ℃； S-Lens RF Level： 55%。

掃描模式： 一級全掃描（Full Scan，m/z100～1500）與數(shù)據(jù)依賴性二級質(zhì)譜掃描（dd-MS2，TopN=10）。分辨率： 120000（一級質(zhì)譜） & 60000（二級質(zhì)譜）。碰撞模式： 高能量碰撞解離（HCD）。

1.2.2 HPLC指紋圖譜的建立

1.2.2.1 益腎排石方樣品溶液的制備

稱取1.2.1.1 小節(jié)制備的益腎排石方樣品0.2 g，置100 mL 錐形瓶中，加50 mL 體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇，稱重后超聲處理30 min放冷，補足重量搖勻，針式濾膜0.22 μm濾過，即得。

1.2.2.2 單味藥材樣品溶液的制備

取益腎排石方中的金錢草、虎杖、黃芩、牛膝、柴胡、枳實、大黃、厚樸、杜仲和王不留行10 種單味藥材飲片按1.2.1.1小節(jié)煎煮方法煎煮，制備單味藥樣品溶液。

1.2.2.3 混合對照品溶液的制備

分別取虎杖苷、大黃酸、大黃素、異橙黃酮、黃芩苷、漢黃芩苷、漢黃芩素、黃芩素、木蝴蝶苷A、大黃酚、厚樸酚、白楊素、大黃素甲醚、松脂醇二葡萄糖苷、蘆薈大黃素、蘆丁和王不留行黃酮苷對照品適量，加甲醇制成100、100、100、50、100、50、50、50、50、50、50、50、100、100、100、50 和50 μg/mL 的混合對照品溶液。

1.2.2.4 色譜條件

采用WondaCract ODS-2 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱； 流動相為0.1%磷酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫條件見表2。

表2 高效液相色譜梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution program of high performance liquid chromatography

1.2.2.5 參照峰的選擇

為了更準(zhǔn)確地計算特征圖譜中各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，因漢黃芩素的分離度及對稱性良好，故選擇更為穩(wěn)定的漢黃芩素色譜峰作為參照峰。

1.2.3 基于生物信息學(xué)的功效關(guān)聯(lián)物質(zhì)作用機制分析

1.2.3.1 化合物作用靶點的預(yù)測

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫（https：//tcmsp-e. com/index. php）、Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫（https：//www.swisstargetprediction. ch/）中對化學(xué)成分的靶點進(jìn)行搜索整理，從UniProt 數(shù)據(jù)庫（https：//www. uniprot.org/）下載注釋文件，對靶點的基因名進(jìn)行進(jìn)一步整理。

1.2.3.2 中藥-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將整理好的文件導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件中構(gòu)建中藥-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.3.3 靶點蛋白與蛋白相互作用（Protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)分析及網(wǎng)絡(luò)核心的篩選

將靶點導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫（https：//cn.string-db.org/），物種選擇欄選擇“Homo sapiens”，設(shè)置蛋白交互參數(shù)評分值大于0.40 的蛋白互作數(shù)據(jù)，去掉網(wǎng)絡(luò)中游離節(jié)點，將結(jié)果以TSV 文本格式導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2 軟件計算Betweenness（BC）、Closeness（CC）、Degree（DC）、Eigenvector（EC）、Local Average Connectivity-based method（LAC）、Network（NC）6 個打分值都在中位數(shù)以上的靶點蛋白，完成PPI 網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建，以及網(wǎng)絡(luò)核心的篩選。

1.2.3.4 功能富集分析與通路分析

應(yīng)用R4.2.2 軟件進(jìn)行基因本體（Gene ontology，GO）功能及京都基因與基因組百科全書（Kyto encyclopedia of genes and genomes， KEGG）富集分析。

1.2.3.5 腎結(jié)石疾病相關(guān)差異基因分析

從GEO 數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中以“Kideny stones”為關(guān)鍵詞搜索獲得腎結(jié)石疾病相關(guān)的數(shù)據(jù)集GSE73680。用R4.2.2 通過GEOquery 包從GEO 數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中下載GSE73680數(shù)據(jù)集，設(shè)置參考組合實驗組，進(jìn)行腎結(jié)石疾病相關(guān)差異基因分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜成分分析

選擇正離子模式和負(fù)離子模式分別對供試品溶液進(jìn)行掃描，總離子流圖見輔助材料圖S1。通過數(shù)據(jù)庫匹配、元素組成和碎片結(jié)構(gòu)分析，共從益腎排石方中鑒定出32 種成分，各化學(xué)成分的分子式、保留時間等信息見輔助材料表S2和S3。

2.2 HPLC指紋圖譜的建立及相似度評價

2.2.1 方法學(xué)考察

2.2.1.1 精密度試驗

為了驗證儀器的精密度，連續(xù)進(jìn)樣6 次，取同一益腎排石方供試品溶液，以樣品12的保留時間和峰面積為參照進(jìn)行RSD 值計算，結(jié)果見輔助材料表S4，相對保留時間的RSD 值為0.00%～0.20%，相對峰面積的RSD值為0.60%～4.84%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.2.1.2 重復(fù)性試驗

為了驗證方法的重復(fù)性，平行測定了6份按同一方法制備的益腎排石供試品溶液，以樣品12的保留時間和峰面積為參照進(jìn)行RSD值計算，結(jié)果見輔助材料表S4，相對保留時間的RSD值為0.02%～0.12%，相對峰面積的RSD值為1.97%～8.78%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.1.3 穩(wěn)定性試驗

為了驗證供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，對同一益腎排石供試品溶液分別在0、2、4、8、12和24 h共進(jìn)行6 次測定。以樣品12 的保留時間和峰面積為參照進(jìn)行RSD 值計算，結(jié)果見輔助材料表S4，相對保留時間的RSD值為0.00%～0.16%，相對峰面積的RSD值為0.50%～9.06%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.2 相似度評價

按1.2.2.4小節(jié)色譜條件，對10批益腎排石供試品溶液（按1.2.2.1小節(jié)方法制備）進(jìn)行測定，記錄色譜圖。將轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012年版），設(shè)定對照品圖譜為參照圖譜，設(shè)定時間窗寬度為0.1 min，多點校正后進(jìn)行峰匹配，共得到17個特征峰，與標(biāo)準(zhǔn)品比對后可以確定分別是：松脂醇二葡萄糖苷（峰1）、王不留行黃酮苷（峰2）、虎杖苷（峰3）、蘆?。ǚ?）、木蝴蝶苷A（峰5）、黃芩苷（峰6）、漢黃芩苷（峰7）、黃芩素（峰8）、異橙黃酮（峰9）、蘆薈大黃素（峰10）、大黃酸（峰11）、漢黃芩素（峰12）、白楊素（峰13）、大黃素（峰14）、厚樸酚（峰15）、大黃酚（峰16）和大黃素甲醚（峰17）見圖1。比對后的化合物的詳細(xì)信息見輔助材料表S5。10 批益腎排石樣品的相似度比對結(jié)果分別為0.998、0.999、0.999、0.999、0.998、0.998、0.999、0.999、0.997和0.994，10批益腎排石方指紋圖譜之間相似性在合理范圍內(nèi)，表明益腎排石方總體質(zhì)量具有良好的重現(xiàn)性。

圖1 混合對照品（A）、益腎排石供試品（B）和10批益腎排石方（C）的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of mixed reference substance （A）， Yishen Paishi test substance （B） and 10 batches of Yishen Paishi prescription （C）

按1.2.2.4小節(jié)色譜條件，對單味藥材樣品溶液和益腎排石供試品溶液進(jìn)行測定，對共有峰進(jìn)行藥材歸屬。通過分析，確認(rèn)了益腎排石HPLC指紋圖譜17個特征峰的來源，指紋峰1號來源于杜仲、2號來源于王不留行、3、14、17 號來源于虎杖、4 號來源于柴胡、金錢草和牛膝、5、6、7、8、12、13 號來源于黃芩、9號來源于枳實、10、11、14、16、17號來源于大黃、15號來源于厚樸見圖2。

圖2 益腎排石單味藥色譜圖Fig.2 Chromatogram of a single drug for Yishen Paishi a. Rheum； b. Citrus； c. Vaccariae Semen； d. Achyranthes bidentata； e. Lysimachia christinae Hance； f. Scutellaria baicalensis Georgi； g.Polygonum cuspidatum； h.Magnolia officinalis； i.Eucommia ulmoides； j.Bupleurum； k.YSPS

2.3 基于生物信息學(xué)的益腎排石方的功效關(guān)聯(lián)物質(zhì)作用機制的預(yù)測分析

2.3.1 化合物的確定

通過文獻(xiàn)［8-16］查詢對益腎排石方中的成分進(jìn)行分析，其中含有的化學(xué)成分包括木脂素類、三萜類、季銨堿類、蒽醌類、多酚類、黃酮類、苯丙素類和甾體類等化合物。其中，黃酮類、木脂素類和蒽醌類成分為益腎排石方的主要化學(xué)成分。通過UHPLC-MS/MS 確定了32 種成分。應(yīng)用指紋圖譜檢測出包含虎杖苷、黃芩苷、黃芩素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素、木蝴蝶苷A、王不留行黃酮苷、松脂醇二葡萄糖苷、蘆丁、異橙黃酮、厚樸酚、白楊素、漢黃芩苷和漢黃芩素共17 種成分，其中王不留行黃酮苷為指紋圖譜新檢測出，其余16種成分為UHPLC-MS/MS 和指紋圖譜共同檢出。通過UHPLC-MS/MS和指紋圖譜雙重檢測得到的17種成分，能夠全面地反映制劑有效成分的組成。

2.3.2 中藥-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

中藥-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖見圖3。該網(wǎng)絡(luò)包括54 個基因靶點、17 種中藥成分和10 個中藥。紫色六邊形節(jié)點代表中藥名稱，橙色圓圈代表通過實驗確定的益腎排石方中的17 種化學(xué)成分，淺綠色方形節(jié)點代表成分對應(yīng)的靶點，其中節(jié)點越大，Degree值越大說明節(jié)點連接數(shù)目越多。

圖3 中藥-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Network diagram of traditional Chinese medicine-component-target

結(jié)合文獻(xiàn)［17-18］的研究方法，通過節(jié)點大小和Degree值的篩選，預(yù)測王不留行黃酮苷、蘆丁、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚、漢黃芩素、厚樸酚和松酯醇二葡糖糖苷為主要成分，PTGS2、PTGS1、AR、SCN5A 和NCOA2為主要靶點，中藥、成分和靶點相互關(guān)聯(lián)成網(wǎng)絡(luò)，顯示了中藥復(fù)方的作用特點。

2.3.3 PPI網(wǎng)絡(luò)分析及網(wǎng)絡(luò)核心的篩選

PPI 網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建，如圖4 所示。通過對核心靶點進(jìn)行篩選，共篩選獲得AR、CASP3、PTGS2、TNF、IL6、HIF1A、CXCL8、IL1B、CAT、ESR1、NOS2、RELA、ACHE、IL2、SOD1 和PTGS1 共16 個核心靶點蛋白（圖5）。結(jié)合文獻(xiàn)［19］的研究方法預(yù)測這16個靶點為核心靶點。

圖4 益腎排石方關(guān)鍵成分靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 PPI network diagram of key components of Yishen Paishi recipe

圖5 網(wǎng)絡(luò)核心篩選結(jié)果圖Fig.5 Network core screening result diagram

2.3.4 功能富集分析與通路分析

在GO 富集分析中（生物過程（BP）共獲得1343個分析條目、分子功能（MF）共獲得77個分析條目和細(xì)胞成分（CC）共獲得33個分析條目），對BP、MF 和CC 的分析結(jié)果分別取排名前10的富集結(jié)果見圖6。其中，BP主要涉及調(diào)節(jié)平滑肌收縮、調(diào)節(jié)體液平衡、急性炎癥反應(yīng)和對異生刺激的反應(yīng)等，MF主要涉及碳酸脫氫酶活性、黃素腺嘌呤二核苷酸結(jié)合、轉(zhuǎn)錄激活因子結(jié)合和G 蛋白偶聯(lián)胺受體的活性等，CC主要涉及突觸前膜的組成部分、突觸前膜的內(nèi)在成分、突觸后膜和膜筏等。在KEGG 富集分析中，益腎排石方治療腎結(jié)石的通路有98條，富集分析結(jié)果取前30條通路繪制KEGG 通路氣泡圖。KEGG 通路富集結(jié)果顯示，主要涉及神經(jīng)退化通路、阿爾茲海默病通路、百日咳通路和IL-17 信號通路等，見圖6。結(jié)合文獻(xiàn)［20-22］的研究方法推測益腎排石方通過多種途徑通路起到治療腎結(jié)石的作用。

圖6 GO和KEGG富集分析圖Fig.6 Enrichment analysis diagram of GO and KEGG

2.3.5 腎結(jié)石疾病相關(guān)差異基因分析結(jié)果

通過搜索獲得腎結(jié)石疾病相關(guān)的數(shù)據(jù)集GSE73680，納入6 例正常人腎乳頭組織設(shè)置為參考組，29例腎結(jié)石患者腎乳頭組織設(shè)置實驗組。繪制箱式圖查看樣本的校正情況，見圖7A。對差異基因進(jìn)行了篩選，篩選結(jié)果見表3。使用limma 包對腎結(jié)石患病組和正常組進(jìn)行差異基因分析，設(shè)置閾值為log FC（＞1）、P＜0.05，火山圖結(jié)果見圖7C?；鹕綀D中紅色的點為腎結(jié)石患病組相對于正常組顯著上調(diào)的基因，其中涉及上調(diào)基因有5650個； 藍(lán)色的點為腎結(jié)石患病組，相對于正常組顯著下調(diào)的基因，涉及下調(diào)基因共有577 個。對顯著表達(dá)的分子用熱圖加以分析表達(dá)，見圖7D，熱圖中每個方塊表示行列所對應(yīng)的數(shù)值，紅色表示高于均值，顏色深淺與值的大小成正比，藍(lán)色表示低于均值，顏色深淺與值的大小成反比，圖中的樹狀圖是對數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析后的結(jié)果。

表3 差異基因篩選結(jié)果表Table 3 Screening results of differential genes

2.3.6 化合物靶點與疾病靶點的交集

利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫查找主要的活性成分靶點基因，去除重復(fù)后，共獲得54個靶點。從GEO 數(shù)據(jù)庫腎結(jié)石疾病相關(guān)差基因異靶點6227 個，去除空白和重復(fù)后，共獲得5029 個靶點。二者取交集，共獲得F10、PLB1、PTGS1、F7、ESR1、CHRM3、NMUR2和MAOB共8個共同靶點基因見圖8。

圖8 益腎排石主要活性成分與腎結(jié)石疾病靶點Venn圖Fig.8 Venn diagram of the main active components of Yishen Paishi and the target of kidney stone disease

2.3.7 活性成分與關(guān)鍵靶點的分子對接

通過2.3.3小節(jié)的方法篩選后獲得的核心靶點有AR、CASP3、PTGS2、TNF、IL6、HIF1A、CXCL8、IL1B、CAT、ESR1、NOS2、RELA、IL2、SOD1、PTGS1 和ACHE 共16 個靶點，化合物靶點與疾病靶點的交集靶點為F10、PLB1、PTGS1、F7、ESR1、MAOB、CHRM3和NMUR2共8個靶點，二者的共同靶點為ESR1和PTGS1。將17個主要活性物質(zhì)分別與這2 個核心靶點進(jìn)行分子對接驗證。結(jié)合最小自由能結(jié)果見表4 可知，當(dāng)結(jié)合能的值小于-20.93 kJ/mol時，表明成分與靶點對接的結(jié)果穩(wěn)定良好［23］。由表4可知，PTGS1與王不留行黃酮苷的效果最好，ESR1 靶點與大黃酸的對接結(jié)果最好?；钚猿煞峙c核心靶點的分子對接3D 圖如圖9所示。

圖9 活性成分與關(guān)鍵基因的分子對接3D圖Fig.9 3D diagram of molecular docking between active ingredients and key genes

表4 核心靶點與活性成分對接的結(jié)合最小自由能Table 4 Minimum free energy of binding between core target and active ingredient

ESR1和PTGS1分別與雌激素和人前列腺素等兩種人體重要的激素分泌和代謝相關(guān)，目前腎結(jié)石約80%是由于草酸鈣結(jié)晶引起，依據(jù)文獻(xiàn)［24-30］雌性激素可以減少草酸鈣的排泄，減少尿液中的草酸鈣，抑制機體的氧化應(yīng)激，減少腎損傷以減少草酸鈣在體內(nèi)的積累，從而預(yù)防腎結(jié)石的形成。但也有證據(jù)表明，雌激素替代療法與腎結(jié)石預(yù)防之間不呈正相關(guān)［31-33］。故推測益腎排石方通過ESR1 靶點，調(diào)節(jié)與雌激素相關(guān)的腎損傷和腎臟氧化應(yīng)激，發(fā)揮治療腎結(jié)石的作用。依據(jù)文獻(xiàn)［34-36］腎結(jié)石可能是通腎血管損傷或炎癥而引發(fā)，前列腺素與這些生理過程的產(chǎn)生密切相關(guān)，而PTGS1 是前列腺素類化合物生物合成途徑的關(guān)鍵酶。故推測益腎排石方可能通過PTGS1靶點，調(diào)節(jié)前列腺素相關(guān)的腎損傷和炎癥達(dá)到治療腎結(jié)石的目的。在此基礎(chǔ)上，結(jié)合文獻(xiàn)的研究方法［37］，進(jìn)行了分子對接驗證，17 種藥效成分與靶點對接良好。基于上述討論，預(yù)測益腎排石方的關(guān)鍵有效成分為大黃酸和王不留行黃酮苷，關(guān)鍵靶點基因為ESR1和PTGS1。

3 結(jié) 論

通過UHPLC-MS/MS 全面分析了益腎排石方的化學(xué)成分，同時將指紋圖譜與生物信息學(xué)相結(jié)合，對17種中藥成分的靶點進(jìn)行篩選，篩選得到16個核心靶點，進(jìn)而預(yù)測了2個關(guān)鍵成分（大黃酸和王不留行黃酮苷）和2 個關(guān)鍵靶點（ESR1 和PTGS1）。在找到了益腎排石方制劑質(zhì)量控制的指標(biāo)成分的基礎(chǔ)上，為闡明中藥復(fù)方治療腎結(jié)石機制提供了思路。但由于指紋圖譜特征峰指認(rèn)不完全以及使用單一GEO數(shù)據(jù)集樣本的限制，仍有很多活性成分未鑒定、疾病靶點未發(fā)現(xiàn)，并且未做作用機制驗證實驗，這都有待后續(xù)深入研究。

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