木犀草素(3′,4′,5,7-四羥基黃酮,luteolin,LUT)屬于天然黃酮類化合物,是臨床治療類風濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)的經(jīng)典苗藥追風傘、吉祥草、獐牙菜中的主要藥效成分之一[1],其具有較好的抗氧化、抗炎、抗腫瘤、心腦血管保護、神經(jīng)保護和調(diào)節(jié)血糖等作用[2-7]。研究表明,LUT在微摩爾濃度下即顯示較強的抗炎活性,且課題組前期工作發(fā)現(xiàn)其可抑制RA中NLRP3炎性小體的表達,起到骨關(guān)節(jié)保護作用[8]。然而,LUT的水溶性差、半衰期短,經(jīng)靜脈及口服等方式給藥后在關(guān)節(jié)腔內(nèi)的濃度較低,很難達到有效治療濃度。因此,需要長期重復給藥,病人依從性差,極大地限制了其臨床應(yīng)用[9]。

經(jīng)皮給藥較其他給藥途徑,在治療RA方面具有顯著的療效優(yōu)勢,如患者可自主在炎癥部位給藥,無肝首過效應(yīng),具有平穩(wěn)的血-藥濃度和持續(xù)的藥物釋放等,提高了患者的依從性。但由于皮膚角質(zhì)層的屏障作用,使得大多數(shù)活性成分難以透過皮膚,從而影響了藥效的發(fā)揮。因此,如何突破皮膚的角質(zhì)層屏障作用是目前LUT經(jīng)皮用于RA治療亟待解決的問題。

微針是采用微米級尺寸的針頭穿刺皮膚角質(zhì)層的技術(shù),具有疼痛感小、遞送藥物精準和給藥方便等優(yōu)勢[10-11]。而采用水溶性高分子材料作為基質(zhì)制備的可溶性微針(dissolvable microneedles,DMNs)克服了傳統(tǒng)微針在載藥方式和使用安全性等方面的缺陷,如固體微針存在給藥劑量無法確定、針體斷裂等安全風險。DMNs插入皮膚后可自行降解,且無殘留物,從而提高了安全性[12-14]。然而,由于皮膚的彈性,DMNs針尖需要有足夠的機械強度才能穿透角質(zhì)層,背襯層則需要有足夠的柔韌性與皮膚緊密貼合,以利于藥物的成功遞送。因此,選擇合適的基質(zhì)制備出具有合適機械強度的針尖與柔韌背襯的DMNs是一個關(guān)鍵的問題。當前,已有透明質(zhì)酸(hyaluronic acid,HA)、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone,PVP)、聚甲基乙烯基醚扁桃酸(gantrez S-97 BF)、硫酸軟骨素(chondroitin sulfate,CS)及絲素蛋白等多種材料被用于DMNs的制備[15-16]。Gantrez S-97 BF為脆性材料,制備出的微針針尖具有很強的機械強度,且安全性高。CS為糖胺聚糖類的天然來源生物活性大分子,生物相容性和生物降解性好,無毒副作用,且具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化等生物活性,已用于骨關(guān)節(jié)炎的治療[17]。

因此,針對LUT在治療RA中存在的水溶性差、體內(nèi)吸收低、半衰期短及目前LUT的給藥系統(tǒng)對皮膚角質(zhì)屏障的突破作用有限等問題,本研究采用脆性材料Gantrez S-97 BF和具有抗炎作用的CS作為基質(zhì),使用兩步法制備具有合適機械強度及貼合性優(yōu)良的LUT-DMNs經(jīng)皮給藥系統(tǒng),并對LUT-DMNs進行了初步評價。

1 儀器與材料

1.1 實驗儀器 Y29型聚二甲基硅氧烷(PDMS)陰模(針長570 μm,底部直徑260 μm,針尖距離700 μm,350顆圓形排布,直徑17.5 mm,臺州微芯醫(yī)藥科技有限公司);TD5M低速離心機(長沙湘智離心機儀器有限公司);CX40P偏光顯微鏡(寧波舜宇儀器有限公司);SU8010型掃描電子顯微鏡(日本日立公司);1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司);SQP型電子分析天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)。

1.2 藥品與試劑 木犀草素對照品(含量:94.4%,批號:111520-202006,中國食品藥品檢定研究院);木犀草素原料藥(純度96.0%,批號:C29J8Y38884,上海源葉生物科技有限公司);硫酸軟骨素(批號:9007-28-7,凱米克化工有限公司);聚甲基乙烯基醚扁桃酸(批號:0002389247,Ashland公司);聚乙烯吡咯烷酮K-90(批號:C181110102,西安天正有限公司);聚乙烯醇(批號:20201001,無錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司);亞甲基藍(批號:20180310,天津市致遠化學試劑有限公司);甲醇為色譜純,制劑用水為純化水,高效液相色譜用水為超純水。

2 結(jié)果

2.1 LUT-DMNs處方及制備工藝考察

2.1.1 LUT-DMNs的制備 本實驗采用金屬微針模具制備PDMS陰模,采用兩步澆筑法制備可溶性微針。將基質(zhì)材料分散至純水中,靜置24 h使其充分溶脹。稱取一定量含藥基質(zhì)倒入模具中,4 000 r/min離心20 min,將離心管旋轉(zhuǎn)180°,再次離心20 min。倒入背襯基質(zhì)溶液,于干燥器中室溫條件下干燥24 h后,用鑷子小心脫模,即得LUT-DMNs貼片。

2.1.2 針尖基質(zhì)材料的篩選 CS為脆性高分子材料,故選擇羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、聚乙烯吡咯烷酮K-30(PVP K-30)、透明質(zhì)酸(HA)、羥丙基甲基纖維素(HPMC)和Gantrez S-97 BF等常見的5種韌性高分子材料與其聯(lián)合使用。以微針陣列完整性、氣泡量及針尖硬度作為評價指標,篩選出適合的LUT微針基質(zhì)材料。

結(jié)果如圖1所示,以CS聯(lián)合CMC-Na制得的微針貼片完整性較差,且機械強度不足;CS聯(lián)合PVP K-30制得的微針貼片完整性較好,但貼片韌性較差,容易碎裂,且貼片背襯不平整;CS聯(lián)合HA制得的微針貼片完整性較差,且難以干燥完全;CS聯(lián)合HPMC無法獲得成型的微針貼片;CS聯(lián)合Gantrez S-97 BF制得的微針貼片完整性好,背襯平整,無氣泡,且機械強度良好,表明由CS聯(lián)合Gantrez S-97 BF制備出的可溶性微針貼片在以上所有組合中性能最佳。因此,在后續(xù)試驗中選擇CS與Gantrez S-97 BF作為微針的針尖基質(zhì)材料。

A:CS+CMC-Na;B:CS+PVP K-30;C:CS+HA;D:CS+Gantrez S-97 BF。

2.1.3 針尖基質(zhì)比例考察 采用CS與Gantrez S-97 BF為針尖基質(zhì)材料,分別以CS:Gantrenz S-97質(zhì)量比為1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1,基質(zhì)材料與純水的比例為1∶2,按2.1.1項下方法制備空白DMNs,以干燥脫模后DMNs有無氣泡、體積有無明顯縮小、針尖完整度及機械強度為指標,考察針尖混合基質(zhì)材料的比例。

結(jié)果如圖2所示,因基質(zhì)溶液黏度隨CS用量的增加而減小(CS∶Gantrez S-97 BF = 9∶1),干燥后所得的DMNs貼片體積明顯縮小,貼片中含有較多氣泡,貼片顏色加深,且機械強度下降。當Gantrez S-97 BF的占比較大時(CS∶Gantrez S-97 BF =1∶9),基質(zhì)溶液黏度過大,不易澆筑。而當CS∶Gantrez S-97 BF為2∶8、3∶7、4∶6時,基質(zhì)溶液黏度適中,易于澆筑,干燥后所得DMNs貼片體積變化較小,貼片中氣泡產(chǎn)生較少。其中,當CS∶Gantrez S-97 BF比例為2∶8時,所制得的貼片外觀形態(tài)最佳,機械強度最優(yōu)。因此,選擇CS∶Gantrez S-97 BF為2∶8作為針尖基質(zhì)材料。

A:1∶9;B:2∶8;C:3∶7;D:4∶6;E:5∶5;F:6∶4;G:7∶3;H:8∶2;I:9∶1。

2.1.4 針尖基質(zhì)材料與純水比例考察 采用2.1.3項下所篩選出的基質(zhì)材料比例,分別以基質(zhì)材料∶純水為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4,按2.1.1項下方法制備空白DMNs,以干燥脫模后DMNs貼片有無氣泡、體積變化程度、針體完整度及機械強度為指標,考察針尖基質(zhì)材料與純水比例。

當基質(zhì)材料與純水的比例為1∶1時,因溶劑量過少,基質(zhì)材料無法充分溶脹于水中,基質(zhì)液過于黏稠,導致無法成功澆筑。隨著純水比例的增加,針尖基質(zhì)材料溶液流動性增強,但DMNs貼片干燥后體積縮小程度隨著純水比例的增大而增加,且脫模時貼片質(zhì)脆易碎。當基質(zhì)材料與純水比例為1∶2、1∶4時,微針貼片中存在顆粒物,可能為部分基質(zhì)材料析出,外觀形態(tài)較差。而當基質(zhì)材料與純水比例為1∶3時,針尖基質(zhì)材料溶液黏度適中,干燥后所得貼片體積變化較小,且脫模時不易碎裂(圖3)。因此,選擇1∶3作為DMNs處方中針尖基質(zhì)材料與純水的比例。

A:1∶2;B:1∶3;C:1∶4。

2.1.5 針尖基質(zhì)材料溶液與LUT乙醇溶液比例考察 采用2.1.4項下所篩選出的針尖基質(zhì)材料與純水比例,稱取10.0 mg的LUT,并將其加入到5 mL的95%乙醇中,超聲溶解,得到2.0 mg/mL的LUT乙醇溶液。分別以針尖基質(zhì)材料溶液∶LUT乙醇溶液為1∶1、1∶2、1∶3、2∶1、2∶3、3∶1、3∶2,按2.1.1項下方法制備LUT-DMNs,以所得針尖基質(zhì)材料溶液黏度是否易于澆筑,干燥脫模后體積變化程度,針尖完整度及機械強度為指標,考察針尖基質(zhì)材料溶液與LUT乙醇溶液的比例。

當針尖基質(zhì)材料與LUT乙醇溶液比例為1∶1、1∶2、1∶3時,脫模時極易碎裂,無法完整脫模,不能形成完整微針。當基質(zhì)材料與LUT乙醇溶液比例為2∶1、2∶3、3∶2時,所得貼片中存在顆粒物,可能為基質(zhì)材料或LUT析出,外觀形態(tài)不佳。當針尖基質(zhì)材料溶液與LUT乙醇溶液比例為3∶1時,干燥后所得的LUT-DMNs貼片外觀形態(tài)良好,體積變化小,易于脫模,機械強度良好(圖4)。因此,選擇3∶1作為LUT-DMNs處方中針尖基質(zhì)材料溶液與LUT乙醇溶液的比例。

A:2∶1;B:2∶3;C:3∶2;D:3∶1。

2.1.6 針尖干燥條件考察 將LUT-DMNs置于(25±1) ℃條件下干燥器中干燥24 h或(40±1) ℃烘箱中干燥10 h,以干燥后所得LUT-DMNs的成型性為指標,考察針尖的干燥條件。

結(jié)果如圖5所示,烘箱干燥所得LUT-DMNs貼片氣泡較多,表面不平整。而在室溫(25±1) ℃條件下于干燥器中干燥所得微針貼片無氣泡,外觀形態(tài)良好。因此,選擇室溫(25±1) ℃條件下于干燥器中干燥24 h作為LUT-DMNs的干燥方式。

A:烘箱(40±1) ℃干燥10 h;B:干燥器(25±1) ℃干燥24 h。

2.1.7 LUT-DMNs背襯基質(zhì)考察 分別選取15% PVA、30% PVA、15% PVP K-90、30% PVP K-90、HPMC(10%)+Gantrenz S-97(2.5%)作為背襯基質(zhì)材料,按2.1.1項下方法制備LUT-DMNs,以干燥脫模后LUT-DMNs貼片中氣泡、韌性、含針量以及干燥時間為指標,考察背襯基質(zhì)材料的種類和用量。

結(jié)果如圖6所示,以15% PVP K-90或30% PVP K-90 作為背襯層時,所需干燥時間較其他組延長了2～4 h,干燥時間較長。以HPMC(10%)+Gantrez S-97 BF(2.5%)作為背襯層時,干燥后韌性差,LUT-DMNs貼片無法彎曲,不能貼合皮膚。30% PVA溶液則過于黏稠,難以澆筑。而以15% PVA作為背襯層時,干燥后韌性較其他組好,能夠較大程度彎曲,易于貼合皮膚。因此,選用15% PVA作為LUT-DMNs的背襯材料。

A:HPMC(10%)+Gantrez S-97 BF(2.5%);B:15% PVA;C:15% PVP K-90;D:30% PVP K-90。

2.2 LUT-DMNs的表征

2.2.1 LUT-DMNs的形貌表征 將按2.1.1項下方法制得的LUT-DMNs貼片分別置于光學顯微鏡與掃描電子顯微鏡下,觀察LUT-DMNs的立體形狀、針長、含針量及針尖斷裂等情況。

結(jié)果如圖7所示,所制得的LUT-DMNs針形良好,含針量高,背襯具有較好的韌性,彎曲時不易開裂。光學顯微鏡與掃描電子顯微鏡下發(fā)現(xiàn),微針針體為圓錐體,表面光滑,針體長度約為500 μm,表明所得LUT-DMNs形貌良好。

A:貼片外觀;B:貼片彎曲情況;C:光學顯微鏡形態(tài);D:掃描電子顯微鏡形態(tài)。

2.2.2 LUT-DMNs機械性能考察 取LUT-DMNs貼片置于物性分析儀樣品基座上,將LUT-DMNs針尖朝上,使針的方向與探頭的軸向平行,選取合適的模式和參數(shù),測量隨著探頭位移過程中LUT-DMNs針尖所受到的應(yīng)力,并繪制壓變曲線。

結(jié)果如圖8所示,空白微針與載藥微針的針尖在壓縮至0.2 mm時,應(yīng)力均大于1.5 N,具備刺穿皮膚角質(zhì)層所需應(yīng)力,載藥后的微針與空白微針的機械性能相似,表明所制備的LUT-DMNs具有良好的機械性能。

A:空白微針貼片;B:載藥微針貼片。

2.2.3 LUT-DMNs皮膚穿刺性能考察 將LUT-DMNs貼片針尖朝向已去除脂肪的裸鼠離體皮膚角質(zhì)層側(cè),以適當力度按壓3 min后,移去貼片,立即用亞甲基藍試劑染色,保留1 min后用脫脂棉蘸取異丙醇擦去角質(zhì)層表面染料,觀察被染色的孔道并拍照。

結(jié)果如圖9所示,皮膚表面的藍點清晰可見,呈規(guī)律排列,且與微針陣列的排列一致,表明制備的LUT-DMNs具備穿刺皮膚角質(zhì)層的機械強度,具有優(yōu)良的皮膚穿刺性能。

圖9 LUT-DMNs應(yīng)用于離體裸鼠皮膚后染色結(jié)果

2.2.4 LUT-DMNs溶解性能考察 將LUT-DMNs貼片針尖朝向保鮮膜,以適當力度按壓1 min后,置于盛有適量純水的燒杯上,于(37±1) ℃水浴鍋中加熱,模擬LUT-DMNs作用于皮膚上的水合作用,并于0、5、10、30、60、120 min取出,于顯微鏡下觀察針尖溶解狀況,并拍照記錄。

LUT-DMNs的溶解性能如圖10所示,結(jié)果顯示,微針在10 min內(nèi)溶解較為緩慢,針尖溶解不明顯;30 min時溶解加快,在2 h時僅有部分針體殘留,幾乎溶解完全。

A:0 min;B:5 min;C:10 min;D:30 min;E:60 min;F:120 min。

2.2.5 DMNs作用于皮膚后皮膚愈合情況考察 取空白DMNs貼片,以適當力度按壓于裸鼠背部皮膚,30 s后取下,并采用攝像記錄皮膚愈合情況。結(jié)果如圖11所示,取下LUT-DMNs貼片后,在3 min時部分孔道逐漸閉合,在10 min時孔道已完全消失,無紅腫等現(xiàn)象,皮膚愈合狀況良好。

A:取下貼片后0 min;B:取下貼片后3 min;C:取下貼片后10 min。

2.3 LUT-DMNs載藥量測定

2.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取LUT對照品適量,加甲醇溶液溶解并制成59.29 μg/mL的LUT對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備 取LUT-DMNs 1片,用解剖刀將針尖與底座分離,將針尖用200 μL去離子水溶脹,加甲醇超聲提取并定容至2 mL,用0.45 μm濾膜過濾,收集續(xù)濾液,即得。

2.3.3 色譜條件 Platisil C18色譜柱(250×4.6 mm,5 μm),流動相甲醇-0.4%磷酸水溶液(60∶40),流速1.0 min/mL,檢測波長350 nm,柱溫35 ℃,進樣量5 μL。

2.3.4 專屬性 分別取空白甲醇、空白DMNs供試品、LUT對照品及LUT-DMNs樣品溶液,按照上述色譜條件進樣。結(jié)果顯示,LUT的出峰時間約為11 min,微針基質(zhì)無干擾,表明該方法專屬性良好(圖12)。

A:空白甲醇;B:空白DMNs供試品;C:LUT對照品;D:LUT-DMNs樣品。

2.3.5 標準曲線的建立 分別精密吸取適量對照品溶液于量瓶中,加甲醇制成質(zhì)量濃度為0.46、0.92、1.84、7.41、14.82、29.64、59.29 μg/mL的系列對照品溶液。按照上述色譜條件測定,以LUT質(zhì)量濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標,得回歸方程y=42.802x-3.257 3(r=1.000 0),表面LUT在0.46～59.29 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.3.6 精密度考察 取濃度為0.92、7.41、29.64 μg/mL的LUT對照品溶液,按上述色譜條件分別連續(xù)進樣6次,計算得LUT峰面積的RSD分別為1.43%、1.08%、0.29%,表明儀器精密度良好。

2.3.7 穩(wěn)定性考察 取LUT-DMNs 1片,按2.3.2項下方法處理,在上述色譜條件下分別于0、2、4、8、12、48 h進樣分析,計算得LUT峰面積在48 h內(nèi)的RSD為1.15%,表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.8 重復性試驗 取LUT-DMNs 6片,照2.3.2項下方法制備供試品溶液,按上述色譜條件測定,結(jié)果平均每片微針針尖含LUT 25.35 μg,重復性的RSD為1.63%,表明該方法重復性良好。

2.3.9 加樣回收率考察 取已知含量的LUT-DMNs 6片,各自切取一半的針尖,分別加入LUT對照品12.65 μg,照2.3.2項下方法制備供試品溶液,按上述色譜條件測定,結(jié)果平均加樣回收率102.97 %,RSD(%)為1.13%,表明加樣回收率符合要求(表1)。

2.3.10樣品測定 取3批LUT-DMNs,每批3片,按2.3.2項下方法制備供試品溶液,按上述色譜條件測定,結(jié)果3批LUT-DMNs的載藥量為(25.66±0.25) μg/片。

3 討論

LUT屬于天然四羥基黃酮化合物,具有消炎、抗過敏、抗菌、抗病毒等多種藥理活性。CS作為基質(zhì)材料之一,生物相容性和生物降解性好,無毒副作用,具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化等生物活性[18-20],已用于骨關(guān)節(jié)炎的治療[21]。臨床上胸腺肽腸溶片聯(lián)合復方硫酸軟骨素片治療類風濕性關(guān)節(jié)炎獲得較好的治療效果[22],將其用于DMNs的制備可起到藥-輔合一的作用。

本研究采用物理交聯(lián)法將CS與Gantrez S-97 BF混合作為LUT-DMNs的針尖材料,將聚乙烯醇(PVA)作為背襯材料,以利用新型經(jīng)皮給藥系統(tǒng)來改善LUT難以透過皮膚角質(zhì)層屏障的問題。本研究考察了不同比例下的基質(zhì)材料、基質(zhì)水溶液、基質(zhì)水-含藥溶液、背襯材料濃度以及干燥條件對LUT-DMNs的影響,結(jié)果顯示,針尖基質(zhì)比例為CS∶Gantrez S-97 BF(2∶8),基質(zhì)材料與水溶液比例為1∶3,基質(zhì)水溶液與LUT醇溶液比例為3∶1,以及干燥條件為室溫下干燥器中干燥24 h時所得到的LUT-DMNs針體機械性能良好,具備穿刺皮膚角質(zhì)層的能力,能夠在一定時間內(nèi)溶解,以達到經(jīng)皮遞送藥物的目的,且移除后創(chuàng)口恢復迅速,不易感染;背襯材料為15% PVA時具有較好的韌性,以便于給藥時貼合皮膚。本研究制備的木犀草素可溶性微針擁有良好的外觀、形貌和機械性能,具有一定的藥物緩釋功能,皮膚貼合性好,去除后皮膚孔道能夠快速愈合,可實現(xiàn)LUT的成功載藥,為今后的制劑開發(fā)和醫(yī)學應(yīng)用奠定了實驗基礎(chǔ)。