健康的氣道上皮能夠促進氣道中的空氣運輸、屏障功能、粘液纖毛清除和肺免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié),是機體呼吸道防御系統(tǒng)的重要屏障,主要由基底細胞、纖毛細胞、刷細胞、杯狀細胞、神經(jīng)內(nèi)分泌細胞等細胞組成[1-2]。疾病發(fā)生時,各細胞功能狀態(tài)常發(fā)生改變。構(gòu)建與體內(nèi)自然生長狀態(tài)相近的體外氣道上皮模型,可更好的研究氣道慢性疾病機制或外源性毒理評價。目前,氣-液界面(air-liquid interface, ALI)培養(yǎng)技術(shù)是培養(yǎng)氣道上皮的重要方法,ALI培養(yǎng)可形成典型的假復(fù)層纖毛柱狀上皮結(jié)構(gòu),分化為纖毛細胞、杯狀細胞和基底細胞[3-4]。雖然ALI培養(yǎng)在國外已有多年研究的歷史,但目前國內(nèi)也只有少數(shù)實驗室成功建立了該培養(yǎng)體系[5-7],仍存在技術(shù)不夠成熟,實驗結(jié)果不一致的問題。而且各實驗室采用的方法都不同,包括原代細胞的分離培養(yǎng)、ALI培養(yǎng)基添加成分、預(yù)鋪膠原類型的選擇、細胞的接種密度等都各不相同[8-9]。ALI培養(yǎng)大多選用原代氣道上皮細胞,如冀曉麗等[10]用分離的原代細胞成功構(gòu)建了ALI培養(yǎng)小鼠氣道上皮細胞模型,但每次ALI培養(yǎng),需要大量的實驗動物(10～30只小鼠)才可分離足夠的原代細胞,存在一定的動物倫理問題。另外,原代細胞數(shù)量少,構(gòu)建的氣道上皮模型不足以用于后續(xù)各種對比實驗的開展。氣道上皮的基底細胞具有自我更新和分化潛能,可分化為主要分泌型和多纖毛細胞類型[11]。因此,本實驗進行了原代基底細胞的分離、鑒定,細胞傳代及ALI培養(yǎng)等實驗,從而研究基底細胞的增殖和定向分化,通過細胞擴增構(gòu)建更多的體外氣道上皮模型,為研究各種慢性氣道疾病機制和吸入性物質(zhì)暴露的毒性評價提供了體外實驗?zāi)Ｐ汀?/p>

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級10～12周成年KM小鼠,由遵義醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供,生產(chǎn)許可證號為SCXK(黔)2021-0002:使用許可證(黔)2021-0004。通過遵義醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會的審查(NO:ZMU21-2309-009)。

1.2 主要試劑及儀器 Ⅰ型膠原蛋白(CORNING,354236);PneumaCultTM-Ex Plus基礎(chǔ)培養(yǎng)基、PneumaCultTM-Ex Plus 50×增補劑(STEMCELL Techsupport,#05040);PneumaCultTM-ALI基礎(chǔ)培養(yǎng)基、PneumaCultTM-ALI 10×增補劑、PneumaCultTM-ALI 維持補充劑(STEMCELL Techsupport, #05001);氫化可的松(STEMCELL Techsupport,#74142);肝素(STEMCELL Techsupport, #07980);中性蛋白酶(上海懋康生物科技有限公司,MX1006-100MG);0.25%胰酶-EDTA(上海源培生物科技股份有限公司,S310JV);青霉素-鏈霉素(Solarbio, P1400);DMEM培養(yǎng)基(gibco,C11995500BT);胎牛血清(SORFA,SH5021);6.5mm Transwell小室(Jet·Biofil, TCS016024);KRT5(proteintech, 28506-1-AP);DAPI(Solarbio,C0065);Triton X-100(BioFroxx,1139ML100);山羊血清(Solarbio,S9070);山羊抗兔熒光二抗(ABclonal, AS05);甲醇(成都金山化學(xué)試劑有限公司,20200204);乙酸(重慶川東化工有限公司);4% 多聚甲醛(biosharp, BL539A);多聚賴氨酸(Solarbio,P210);蔗糖(成都金山化學(xué)試劑有限公司,20220624);細胞篩(biosharp,BS-40-CS)。倒置顯微鏡(OLYMPUS,CKX53);冰凍切片機(Leica,CM1900-1-1);倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS,IX73);場發(fā)射掃描電鏡(HITACHI,SU8010);研究級正置顯微鏡(OLYMPUS,BX43)。

1.3 試劑的配置 增殖培養(yǎng)基:在484.5 mL PneumaCultTM-Ex Plus基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入 10 mL PneumaCutTM-Ex Pus 50×Supplement、0.5 mL 0.2 mM氫化可的松、5 mL 青霉素/鏈霉素(P/S),保存于4 ℃ 冰箱。分化培養(yǎng)基:50 mL PneumaCultTM-ALI 10×Supplcment+450 mL Pn-eumaCultTM-ALI基礎(chǔ)培養(yǎng)配成PneumaCultTM-ALI 完全基礎(chǔ)培養(yǎng)基。在486.5 mL的PneumaCultTM-ALI 完全基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入5 mL的PneumaCultTM-ALI維持增補劑、1 mL肝素、2.5 mL氫化可的松、5 mL青霉素/鏈霉素,混合配成PneumaCultTM-ALI 分化培養(yǎng)基。

1.4 小鼠原代基底細胞的分離培養(yǎng) 頸椎脫臼法處死小鼠,酒精消毒后,從胸骨到下頜剪開皮毛,打開小鼠胸腔,暴露氣道。手術(shù)獲取小鼠氣道5～6個,沿長軸剪開,PBS清洗,1.5 mg/mL中性蛋白酶37 ℃孵育消化0.5 h,手術(shù)刀背刮氣道管腔面,眼科剪刀剪碎刮下的黏液團,再消化0.5 h,含10% FBS的 DMEM終止消化。1 000 r/min,5 min離心后40 μm細胞篩過濾,接種于含增殖培養(yǎng)基的60 mm的培養(yǎng)皿中,記為培養(yǎng)第0天,2～3 d后換液,倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。

1.5 小鼠原代基底細胞鑒定 選用NIH/3T3成纖維細胞作為陰性對照組,鑒定方法如下:-20 ℃甲醇固定培養(yǎng)的基底細胞,室溫10 min,PBS沖洗3次,每次5 min。用1× PBS制成的0.2% Triton X-100孵育5 min,1× PBS沖洗,封閉緩沖液孵育1 h。KRT5一抗(1∶300)稀釋在4 ℃孵育過夜,1×PBS洗滌3次,每次5 min。用山羊抗兔熒光二抗(1∶300)稀釋在室溫下避光孵育1 h,1× PBS清洗3次,每次3 min。加入DAPI室溫避光孵育5 min,1× PBS清洗3次,每次3 min。熒光顯微鏡觀察KRT5熒光表達情況。

1.6 小鼠原代基底細胞ALI培養(yǎng)體系構(gòu)建 氣道上皮原代基底細胞生長至70%～80%匯合度后0.25%胰酶消化8 min,用含有 10%FBS的DMEM終止消化, 1 000 r/min、離心 5 min, 加入增殖培養(yǎng)基懸浮沉淀,細胞計數(shù)板計數(shù),將細胞濃度稀釋到1.65×105個/mL,在6.5 mm Transwell小室加入200 μL細胞懸液,并在小室下方添加600 μL增殖培養(yǎng)基。待細胞達到100%融合率,培養(yǎng)基更換為分化培養(yǎng)基,開始進行氣液界面培養(yǎng),每2～3天換1次液,鏡下觀察分化情況。在培養(yǎng)7、14、21 d時用掃描電鏡觀察纖毛生長情況。

1.7 小鼠基底細胞的傳代實驗 按上述方法,收集氣道上皮原代基底細胞制成細胞懸液,細胞計數(shù)板計數(shù),將細胞濃度稀釋到2.3×105個/mL,在6孔板中加入1 mL細胞懸液及2 mL增殖培養(yǎng)基。每24 h觀察細胞生長情況,待細胞融合率達70%～80%,連續(xù)傳代,重復(fù)上述操作。

1.8 不同代數(shù)基底細胞的ALI培養(yǎng) 收集1～8代的基底細胞,制成細胞懸液,按上述方法進行ALI培養(yǎng),2～3 d換液1次。

1.8.1 HE染色觀察ALI培養(yǎng)后各代細胞分化情況 取氣液界面培養(yǎng)21 d的Tanswell小室,1×PBS清洗兩2次,4% PFA固定,30%蔗糖脫水后將Transwell小室底部的膜切割,經(jīng)OCT包埋進行冰凍切片,用1×多聚賴氨酸包被的蓋玻片貼取切片,于50 ℃烘烤2 h,HE染色,中性樹膠封片后觀察。

1.8.2 掃描電鏡觀察分化后游離面纖毛 取ALL培養(yǎng)21 d的Tanswell小室,PBS潤洗小室兩遍,加入2.5%戊二醛室溫固定2 h,PBS沖洗4次,每次15 min。加入1%四氧化鋨固定 1.5 h。吸去鋨酸,用PBS沖洗4次,每次10 min。梯度脫水:30%、50%、70%、90%乙醇脫水1次,每次15 min,100%乙醇脫水2次,每次15 min。臨界點干燥儀干燥,真空鍍膜機待金或碳噴鍍到樣品表面,取出用掃描電鏡觀察、拍照。

2 結(jié)果

2.1 光鏡下觀察小鼠氣道原代基底細胞情況 結(jié)果顯示,培養(yǎng)第2 天(圖1A),有散在的小團塊成“簇狀”增殖生長的貼壁細胞,另有呈梭型、圓形的細胞。培養(yǎng)第3 天(圖1B),“簇狀”團塊細胞增殖快速變大,呈經(jīng)典的“鋪路石”狀。同時梭型細胞增多,圓形透明的細胞減少。培養(yǎng)第4天(圖1C),細胞大小不等,有部分細胞體積繼續(xù)變大,更加扁平,胞質(zhì)空泡化,細胞呈現(xiàn)老化狀態(tài)。培養(yǎng)至第5～6天(圖1D,E), “鋪路石”狀細胞排列明顯,但空泡化的細胞增多,梭型細胞在減少。鵝卵石樣細胞、體積變大細胞、胞質(zhì)空泡化細胞融合在一起。圖1F顯示,第2～4天,細胞生長緩慢,第4天后細胞進入對數(shù)生長期,細胞增殖活躍,培養(yǎng)至第6天細胞融合高達70%～80%,老化細胞增多,可以進行傳代。

A～E分別代表:培養(yǎng)第2、3、4、5、6 天;所指為梭型細胞;所指為空泡化的細胞;所指為體積大且扁平的細胞;F:P0生長曲線;標(biāo)尺:100 μm,放大倍數(shù)×100。

2.2 免疫熒光鑒定小鼠氣道原代基底細胞 KRT5基因標(biāo)記氣道上皮基底細胞,小鼠胚胎成纖維細胞(NIH/3T3細胞)陰性對照,KRT5標(biāo)記為綠色,DAPI標(biāo)記為藍色。免疫熒光染色顯示:分離培養(yǎng)的原代細胞大部分表達KRT5陽性,通過軟件分析,陽性率(KTR5陽性細胞數(shù)/DAPI核染細胞總數(shù))可達95%(圖 2C),陰性對照NIH/3T3細胞未觀察到綠色熒光(圖2F),提示該分離方法可獲取氣道上皮基底細胞,且純度達95%。

A～C:分離細胞的KRT5熒光和DAPI熒光;D～F:NIH/3T3KRT5熒光和DAPI熒光;標(biāo)尺:20 μm,放大倍數(shù)×400。

2.3 ALI培養(yǎng)觀察小鼠氣道基底細胞的分化 倒置顯微鏡下觀察:ALI d 7至ALI d 21均觀察到細胞堆疊,小室表面凹凸不平并有粘液分布(圖3B～D)。ALI d 21可明顯觀察到纖毛快速擺動。

A～D:倒置顯微鏡觀察ALI d 0、ALI d 7、ALI d 14、ALI d 21;E～G:HE染色觀察ALI d 7、ALI d 14、ALI d 21;所指為纖毛;H～J:掃描電鏡觀察ALI d 7、ALI d 14、ALI d 21;A～D標(biāo)尺:100 μm,放大倍數(shù)×100;E～G標(biāo)尺:20 μm;H～I標(biāo)尺:10 μm,放大倍數(shù)×5.00 K。

HE染色和掃描電鏡觀察:ALI d 7細胞已經(jīng)出現(xiàn)堆疊,達到2～3細胞層,細胞表面凹凸不平(圖3E),HE染色和掃描電鏡均未觀察到纖毛(圖3E、H);ALI d 14和ALI d 21細胞層數(shù)沒有增加,均為2～3層(圖3F、G),HE染色和掃描電鏡均可觀察到游離面的纖毛,ALI d 21纖毛的數(shù)量更多,提示基底細胞已經(jīng)出現(xiàn)分化(圖3I、J)。

2.4 小鼠氣道基底細胞傳代實驗

2.4.1 各傳代基底細胞生長情況 倒置顯微鏡下觀察(圖4):傳代的細胞生長旺盛,接種培養(yǎng)3 d細胞融合度可達到90%。目前已傳至第八代,P1至P8:傳代細胞一直保持著“鵝卵石”上皮細胞樣的形態(tài),細胞形態(tài)和大小較一致。但P5～P8細胞扁平、體積變大或胞質(zhì)空泡化衰老的細胞逐漸增多。

標(biāo)尺:100 μm,放大倍數(shù)×100。

2.4.2 免疫熒光檢測各傳代基底細胞的KRT5表達水平 免疫熒光結(jié)果(圖5)顯示,P1到P8都有KRT5陽性熒光,也出現(xiàn)KRT5陰性的細胞,熒光強度在P5后出現(xiàn)減弱趨勢。說明隨著傳代數(shù)的增加,KRT5的表達水平發(fā)生了改變,提示P5代后基底細胞的功能是否也出現(xiàn)改變?

標(biāo)尺:50 μm,放大倍數(shù)×200

2.5 ALI培養(yǎng)后各傳代基底細胞的分化情況

2.5.1 HE觀察形態(tài)結(jié)構(gòu) 結(jié)果顯示,P1至P3細胞層較高,可觀察到柱狀細胞,游離面有纖毛,P4細胞形態(tài)變?yōu)楸馄?游離面也可觀察到纖毛,但P5至P8細胞形態(tài)均扁平,游離面未觀察到纖毛,說明從P4后細胞分化出現(xiàn)異?，F(xiàn)象(圖6)。

圖6 HE觀察各傳代基底細胞分化后的形態(tài)結(jié)構(gòu)

2.5.2 掃描電鏡觀察分化后細胞表面的情況 掃描電鏡觀察:P1至P8,均可觀察到纖毛、微絨毛結(jié)構(gòu)。P1～P3纖毛成束狀,周圍可見卵圓形細胞,可能為黏液細胞。P4～P8纖毛單根分明,周圍細胞呈扁平狀。2.50 K放大倍數(shù)下,任意取3個視野比較定向分化細胞游離面特化結(jié)構(gòu)的面積,P1～P4代細胞游離面特化結(jié)構(gòu)的面積多,而P5～P8細胞游離面特化結(jié)構(gòu)的面積少,與P1相比有統(tǒng)計學(xué)差異(圖7)。

標(biāo)尺:20 μm,放大倍數(shù)×2.5 K;***:與P1比較,P<0.001。

3 討論

在呼吸系統(tǒng)中,對肺上皮細胞的研究取得了很大的進展,已經(jīng)可以了解到肺泡 II 型(AT2)細胞維持分化AT1 細胞[12],但氣道上皮,因其細胞成分的復(fù)雜性,仍然存在很多未知的東西?；准毎挥谏掀さ幕撞?且數(shù)量少,消化分離時較為困難,按傳統(tǒng)的原代分離方法,無法獲取足夠多活性好的細胞,分離時,國內(nèi)、外大多使用的是蛋白酶4 ℃消化4～24 h[10,13-14]。本實驗對酶消化法進行了改良,將氣道剖開進行分段消化和處理(先組織整體中性蛋白酶消化0.5 h,刮下腔面黏液團剪碎后再消化0.5 h),避免消化時間過短無法消化下來,時間過長活性減弱或黏膜下層其他細胞一并消化下來。改良后的酶消化法,縮短了消化時間,可獲取活性好、數(shù)量較多的氣道上皮細胞。除基底細胞的其他上皮細胞屬于成體細胞,增殖能力弱,通過培養(yǎng)就可清除。在小鼠中,大多數(shù)穩(wěn)態(tài)氣道上皮基底細胞是KRT5/KRT15/14++-[15],通過免疫熒光鑒定95%為KRT5陽性細胞,所以該分離方法可行,能分離純度較高的基底細胞。

基底細胞分布于上皮的基底部,體內(nèi)環(huán)境相對穩(wěn)定,體外培養(yǎng)時DMEM/F12等培養(yǎng)基無法滿足要求。目前,基底細胞培養(yǎng)方法選用含有Rho相關(guān)蛋白激酶抑制劑Y-27632的培養(yǎng)基,將與有絲分裂滅活的3T3成纖維細胞進行共培養(yǎng)[16-17]。有絲分裂滅活的方法有射線照射或者絲裂霉素C處理[18-19],過程繁瑣,聯(lián)合培養(yǎng)需要探索,3T3成纖維細胞和基底細胞共存,不利于后續(xù)實驗開展。因此,本實驗無血清和BPE的細胞培養(yǎng)基PneumaCultTM-Ex Plus只適合氣道上皮細胞的培養(yǎng),不利于成纖維細胞等其他類型細胞生長,該培養(yǎng)基培養(yǎng)上皮細胞時不需要飼養(yǎng)層細胞,也不需要使用差速貼壁法分離成纖維細胞,只需通過培養(yǎng)和傳代可進一步使細胞純化。通過細胞傳代和定向分化實驗,該培養(yǎng)基可很好的維持基底細胞的增殖和定向分化效果。

原代細胞ALI培養(yǎng)物與浸沒的單層培養(yǎng)物相比,ALI培養(yǎng)物與體內(nèi)天然氣道上皮結(jié)構(gòu)和功能更相似[20]。ALI培養(yǎng)極大地擴展了在體外系統(tǒng)中測量組織特異性終點的可能性,例如組織屏障功能,離子通道生理學(xué),MCC和組織形態(tài)。評估與呼吸系統(tǒng)疾病相關(guān)的組織反應(yīng)有望為確定空氣中物質(zhì)的潛在不良健康影響提供有價值的信息。本實驗ALI培養(yǎng),將原代或傳代的細胞接種到Transwell小室,在頂端和基底外側(cè)隔室中添加增殖培養(yǎng)基。培養(yǎng)2～4 d,當(dāng)細胞達到完全匯合時,通過去除頂端隔室中的培養(yǎng)基并向基底外側(cè)隔室添加分化培養(yǎng)基。這使得培養(yǎng)物的頂端側(cè)暴露在空氣中,基底外側(cè)與分化培養(yǎng)基接觸,這種培養(yǎng)條件模擬天然環(huán)境,對于驅(qū)動及基底細胞分化為氣道中發(fā)現(xiàn)的粘液纖毛表型至關(guān)重要。ALI 14 d和ALI 21 d后細胞層數(shù)為2～3層,HE染色和掃描電鏡均可觀察到游離面的纖毛,ALI 21 d纖毛的數(shù)量更多,提示基底細胞已經(jīng)出現(xiàn)分化。因此,實驗室已成功構(gòu)建了基底細胞ALI培養(yǎng)體系,為從細胞水平上分析研究各種疾病的分子基礎(chǔ)奠定了條件。

基底細胞雖可以分離和傳代培養(yǎng)[13],但傳代后是否保持干細胞的特性和定向分化,未見研究。因此,本實驗涉及了基底細胞的增殖和分化實驗研究。階段研究結(jié)果顯示,基底細胞已傳至P8代,細胞增殖效果好,P5代后,細胞老化、死亡相對增多,免疫熒光強度也變?nèi)酢LI培養(yǎng),HE染色和掃描電鏡均體現(xiàn)P5代,細胞層扁平,分化能力弱,形成纖毛數(shù)量減少。說明P1代到P4代基底細胞增殖效果好,分化能力強,但P5代后增殖和分化均出現(xiàn)下降趨勢。實驗結(jié)果與Rayner等[21]用PneumaCuTM-Ex Pus和PneumaCultTM-ALI對人類氣道上皮細胞進行傳代和ALI培養(yǎng)結(jié)果一致。至于為什么P5代后各項指標(biāo)出現(xiàn)下降有待于進一步研究。根據(jù)目前結(jié)果,基底細胞ALI培養(yǎng)應(yīng)選擇P4代以前細胞進行培養(yǎng)效果更好。