荊琚 王杰花 韓麗麗 陳衛(wèi)民 吳品珊 雷榮

關(guān)鍵詞：梨園；氣溶膠；梨火疫病菌；定量檢測

解淀粉歐文氏菌Erwinia arnylouora被列為我國重大檢疫性細(xì)菌，其引起的梨火疫病于2015年6月首次在新疆伊犁地區(qū)霍城縣發(fā)現(xiàn)并暴發(fā)流行，現(xiàn)已蔓延至新疆14個(gè)地州（市），嚴(yán)重危害梨、蘋果、山楂、海棠、榀槨等果樹，尤其在庫爾勒香梨上傳播極為迅速，給新疆乃至全國林果產(chǎn)業(yè)帶來嚴(yán)重威脅。2017年，蘋果在中國的種植面積約222萬hm2，產(chǎn)量382萬t；梨種植面積約107萬hm2，產(chǎn)量1289萬t，種植面積和產(chǎn)量均為世界第一。我國梨每年的出口值超過2億美元，是世界上最大的梨出口國之一，也是我國農(nóng)業(yè)重要的經(jīng)濟(jì)來源之一。因此，梨火疫病害一旦傳播至國內(nèi)其他省份，將造成巨大損失。

細(xì)菌、真菌、病毒、噬菌體等微生物可附著在氣溶膠包含的固體或液體顆粒上，以獨(dú)立個(gè)體或聚集體的形式在空氣中擴(kuò)散，造成病原微生物的長距離傳播和入侵。迄今，大部分研究認(rèn)為梨火疫病菌主要通過傷口、自然孔口和花侵入寄主，進(jìn)而侵染韌皮部組織、花絲及柱頭，引起組織發(fā)病，而通過在種植蘋果的模擬苗圃中研究風(fēng)雨形成的氣溶膠在梨火疫病傳播流行中的作用，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)疫情都與流行之前發(fā)生的風(fēng)暴有關(guān)。梨火疫病菌在相對濕度為40%～90%的空氣粒子中可存活較長時(shí)間。目前自然條件下國內(nèi)梨園氣溶膠攜帶梨火疫病菌情況未見報(bào)道。因此，本研究于2019年-2021年收集了新疆庫爾勒市人和農(nóng)場‘香梨’園中的氣溶膠，對其中可能攜帶的梨火疫病菌進(jìn)行檢測，為掌握梨火疫病的傳播途徑提供技術(shù)依據(jù)，對庫爾勒香梨產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有理論和實(shí)踐意義。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1梨園基本概況

試驗(yàn)地位于新疆巴州庫爾勒人和農(nóng)場，共12個(gè)梨園，經(jīng)緯度：41°40'N～41°49'N，85°59'E～85°47'E，海拔：907.5～928m，株行距：3m×5m，每個(gè)梨園面積0.67hm2，共計(jì)8.04 hm2。其中健康（不發(fā)病）梨園3個(gè)、輕度發(fā)?。ú∏橹笖?shù)1.00～10.00）梨園3個(gè)、中度發(fā)病（病情指數(shù)10.01～30.00）梨園3個(gè)、重度發(fā)病（病情指數(shù)30.01以上）梨園3個(gè)，種植品種‘香梨’。土質(zhì)為沙壤土，土壤肥力中等，地勢平坦，排灌方便，井水灌溉，栽培條件（施肥量、灌水等）均勻一致，符合當(dāng)?shù)貙?shí)際林業(yè)生產(chǎn)。

1.1.2致病性測試材料

2019年4月-2021年6月，采集庫爾勒市綠化4隊(duì)行道樹上未噴任何藥劑、健康的當(dāng)年生‘香梨’樹嫩枝條、葉片、幼果，供離體接種使用。巴音郭楞蒙古自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院溫室秋季栽植2年生‘小葉刺’杜梨Pyrus betulifolia苗，供次年活體接種使用。

1.1.3標(biāo)準(zhǔn)菌株

梨火疫病菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（編號：E．a(chǎn)Y2003，寄主：蘋果），由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)胡白石教授提供。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1梨園氣溶膠中梨火疫病菌收集方法

2019年-2021年，每年春季（4月下旬）、夏季（6月中旬）、秋季（9月中旬）3個(gè)季節(jié)，將病原菌孢子捕捉器（河南云飛科技發(fā)展有限公司）放置于梨園中兩行‘香梨’樹中間，載玻片（長×寬=8cm×3cm，采集面積為24cm2）上涂抹凡士林后放入孢子捕捉器內(nèi)并設(shè)定放置時(shí)間。收集完成的載玻片樣本放入50mL無菌離心管中，帶回實(shí)驗(yàn)室用移液器吸取5mL無菌水重復(fù)沖洗載玻片6次，制備成氣溶膠懸浮液，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。病原菌孢子捕捉器放置按照以?種方法：

1）重度發(fā)病梨園不同空間高度收集：在梨園中兩行‘香梨’樹的中間，距離梨樹2.5m處放置孢子捕捉器，設(shè)置3個(gè)放置高度，分別距地面50、100、150cm，每個(gè)高度放置1個(gè)孢子捕捉器，重復(fù)3次，收集時(shí)間1h。

2）不同發(fā)病程度梨園收集：在健康、輕度、中度、重度發(fā)病4種梨園，每種梨園選擇3個(gè)，每個(gè)梨園在兩行梨樹中間距地面高度100cm處放置1個(gè)孢子捕捉器，重復(fù)3次，收集時(shí)間1h。

3）同一高度不同時(shí)間收集：在重度發(fā)病梨園的同一株香梨樹下，距離樹干2.5m，距地面高度100cm處放置孢子捕捉器，收集時(shí)間分別設(shè)置為2、5、10、15、20、30、45、60min，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)重復(fù)3次，共計(jì)24份樣本。

1.2.2病原菌分離、純化

接種環(huán)蘸取氣溶膠懸浮液在牛肉膏蛋白胨（NA）培養(yǎng)基上劃線分離，28℃，倒置培養(yǎng)48h后觀察菌落形態(tài)。挑取乳白色、表面光滑且凸起、有光澤的疑似單菌落，轉(zhuǎn)皿至新鮮NA培養(yǎng)基上，重復(fù)操作3次，用于后續(xù)致病性測定。

1.2.3致病性測試

1.2.3.1接種菌懸液制備

將從氣溶膠中分離純化得到的96株疑似梨火疫病菌菌株轉(zhuǎn)接到NA培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)48h，挑取單菌落接種于NB培養(yǎng)液中，28℃、150r/min振蕩培養(yǎng)24h，將OD600值為0.4的菌液作為接種菌懸液。

1.2.3.2離體枝條接種

采集生長一致的健康一年生‘香梨’枝條，剪成25cm莖段，75%乙醇消毒后，插入裝有無菌水的三角瓶中，每瓶插入1個(gè)枝條。用噴壺將1×108 cfu/mL的菌懸液均勻噴在待接種枝條上，每處理接種3個(gè)枝條，重復(fù)3次，以無菌水為對照。接種后置于室內(nèi)培育架上，在L∥D=12h∥12h，溫度27～28℃、相對濕度75%條件下培養(yǎng)，記錄發(fā)病情況。

1.2.3.3梨幼果接種

取健康‘香梨’幼果用70%乙醇浸泡10min后，用滅菌解剖刀橫切為二，用滅菌牙簽蘸取濃度為1×108cfu/mL菌液分別在兩個(gè)橫切面上均勻接種6個(gè)點(diǎn)，然后放入90mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿放置于鋪滅菌吸水紙的托盤中，保鮮膜封口，在L∥D=12h∥12h，27～28℃條件下保濕培養(yǎng)。記錄梨幼果菌膿出現(xiàn)的時(shí)間。

1.2.3.4離體葉片接種

設(shè)置接種菌液濃度為1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109cfu/mL，以無菌水為對照，共8個(gè)處理，每處理接種3片香梨葉片，重復(fù)3次。挑選健康、生長期一致的葉片，置于墊有滅菌濕濾紙的90mm培養(yǎng)皿上。用滅菌牙簽在葉片基部葉柄處針刺1個(gè)傷口，取5uL菌液滴在傷口處，培養(yǎng)條件同1.2.3.3。記錄葉片發(fā)病情況。

1.2.3.5溫室幼苗接種

用滅菌牙簽在盆栽‘小葉刺’杜梨苗枝條上針刺10處傷口，將濃度為1×108cfu/mL的菌懸液均勻地噴于待接種枝條上，1盆杜梨幼苗為1個(gè)處理，重復(fù)3次，無菌水為對照，其他條件同上，接種后5～7d調(diào)查記錄發(fā)病情況。

1.2.4致病菌的再分離

1.2.4.1溫室幼苗、幼嫩組織致病菌再分離

取離體枝條發(fā)病幼莖（剪成0.5～1cm的小段）、離體發(fā)病葉片（剪成1×1cm左右小塊）和溫室發(fā)病幼苗枝條，先用75%乙醇表面消毒30s，再用1%次氯酸鈉消毒1min，無菌水沖洗3遍，用滅菌吸水紙吸干水分后轉(zhuǎn)移至研缽中，加入PBS緩沖液研磨，浸泡15min，使用接種環(huán)蘸取研磨液，在NA培養(yǎng)基平板劃線分離。

1.2.4.2梨果實(shí)致病菌再分離

發(fā)病梨果保濕培養(yǎng)5d后，取變黑腐爛的果實(shí)，挑取果實(shí)表面菌膿或腐爛物，在NA培養(yǎng)基上劃線分離。

1.2.5致病菌的測序鑒定

1.2.5.1總DNA提取

選取致病性測試后有發(fā)病癥狀的組織，用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司），參照說明書提取總DNA。

1.2.5.2PCR擴(kuò)增及測序

參照胡白石、袁英哲等方法，使用梨火疫病菌的特異性引物P29B/P29A進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系（25uL）：2×Taq PCR mix 12.5uL，引物P29B/P29A（10umol/L）各1uL，DNA uL，ddH90 9.5uL;反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min; 94℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸8min。選取陽性產(chǎn)物送至北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司雙向測序，所得序列在NCBI中進(jìn)行BLAST比對分析。

1.2.6氣溶膠中梨火疫病菌的定量檢測

1.2.6.1氣溶膠樣品處理與DNA提取

從重度、中度和輕度發(fā)病的果園中分別隨機(jī)選取10份氣溶膠樣本，用無菌水沖洗載玻片收集的氣溶膠樣本于50mL無菌離心管中，12000r/min離心10min，棄上清，用200uL無菌水沖洗離心管底部，混勻，采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取總DNA。

1.2.6.2熒光定量PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)程序

參照袁英哲等，錢國良等的方法進(jìn)行熒光定量PCR。使用AceQ Universal U+Probe MasterMix（Vazyme）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣品重復(fù)3次，以無菌超純水為陰性對照。反應(yīng)體系（20uL）：Mix 10 uL，10umol/L上、下游引物各1.5uL，探針0.4uL，DNA模板2.0UL，超純水補(bǔ)足至20uL;擴(kuò)增條件：95℃ 5min；95℃ 15s，60℃ 1min，40個(gè)循環(huán)。檢測引物及探針序列分別為：Ams116F（5'-TCCCACATACTGTGAATCATCCA-3'）， Arns189R（5-GGGTATTTGCGCTAATTTTATTCG-3'），和Ams14IT （5'-FAM-CCAGAATCTGGCCCGCGT-ATACCG-TAMRA-3'）。

1.2.6.3標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

利用細(xì)菌濁度計(jì)對培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)菌株（E．a(chǎn)Y2003）菌懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)，并把菌懸液稀釋到1×108 cfu/mL，再進(jìn)行5倍梯度稀釋，得到1×108、2×107、4×106、8×105、1.6×105、3.2×104 cfu/mL的標(biāo)準(zhǔn)菌液。各取2．0uL菌液為模板進(jìn)行熒光定量PCR，根據(jù)Ct值與菌液濃度對數(shù)值的線性關(guān)系制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到定量計(jì)算方程。根據(jù)檢測樣品的Ct值，由方程計(jì)算檢測樣品的菌落數(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1氣溶膠中梨火疫病菌的分離結(jié)果

2019年-2021年在梨園中共采集氣溶膠樣本1368份，分離出攜帶疑似梨火疫病菌的樣本96份（表1）。健康梨園內(nèi)未分離到梨火疫病菌；春季僅在重度梨園內(nèi)分離到疑似梨火疫病菌；夏季健康，輕、中、重度發(fā)病梨園中均未分離到疑似梨火疫病菌；秋季梨園中分離到的疑似梨火疫病菌較多。重度發(fā)病梨園同一高度（100cm），收集時(shí)間為2、5、10、15min時(shí)沒有分離到疑似梨火疫病菌，收集時(shí)間為20、30、45min和60min時(shí)可分離到疑似梨火疫病菌，收集時(shí)間越長分離到病菌的氣溶膠樣本越多。分離出的96份疑似梨火疫病菌樣本，其中春季28份，夏季0份，秋季68份。

2.2致病性測定結(jié)果

2019年，對分離出的27份疑似梨火疫病菌菌株進(jìn)行致病性測定，其中離體枝條接種、果實(shí)接種、溫室盆栽杜梨苗接種，菌懸液濃度為1×108 cfu/mL時(shí)可致病，離體葉片接種在菌懸液濃度為1×105～1×109cfu/mL均可致病。

2020年，對分離出的34份疑似梨火疫病菌菌株，使用離體枝條接種法、溫室盆栽杜梨苗接種法進(jìn)行致病性測定，在菌懸液濃度為1×108 cfu/mL時(shí)可致病。

2021年，對分離出的35份疑似梨火疫病菌株，使用離體枝條接種法、果實(shí)接種法進(jìn)行致病性測定，菌懸液濃度為1×108 cfu/mL時(shí)可致?。▓D1）。

2.3接種致病菌的梨樣品PCR檢測

剪取致病性測定后有發(fā)病癥狀的葉片、枝條、果實(shí)，提取基因組DNA進(jìn)行PCR檢測，均擴(kuò)增得到900bp的片段（圖2）。對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙向測序，在GenBank中進(jìn)行序列比對分析，結(jié)果表明，所得序列與GenBank中（登錄號：CP050241.1）的序列相似性在99%以上，確定為梨火疫病菌（表2）。

2.4標(biāo)準(zhǔn)菌液標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作結(jié)果顯示，每個(gè)濃度重復(fù)檢測3次，結(jié)果基本一致，重復(fù)性較好。得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=-3.191x+48.007。R2為0.996，可信度較高。擴(kuò)增效率（E）為105.8%，擴(kuò)增效率較理想。同批檢測樣品的Ct值帶入定量計(jì)算方程式便可獲得總菌落數(shù)cfu/（24cm2．h）。

2.5梨園氣溶膠樣本的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測

病原孢子捕捉器從重度、中度和輕度發(fā)病梨園氣溶膠中收集到的病菌，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測（表3），結(jié)果均為陽性。從30份樣品中均可檢測出不同數(shù)量的梨火疫病菌，其中最高值2. 81×104 cfu/（24cm2．h），最小值8.50×102 cfu/（24cm2·h）。重度發(fā)病果園總菌落數(shù)平均值為8.74×103cfu/（24cm2．h），中度發(fā)病果園總菌落數(shù)平均值為4.55×103 cfu/（24cm2·h），輕度發(fā)病果園總菌落數(shù)平均值為2.36×103 cfu/（24cm2·h）。健康果園在3個(gè)季節(jié)的氣溶膠檢測中均未測到梨火疫病菌，在輕度、中度、重度發(fā)病果園內(nèi)氣溶膠中檢測出梨火疫病菌。且氣溶膠中的梨火疫病菌含量與果園田間發(fā)病程度呈正相關(guān)性。

3結(jié)論與討論

梨園氣溶膠中梨火疫病菌分離試驗(yàn)結(jié)果顯示，在春季（4月下旬）、夏季（6月中旬）采集的氣溶膠樣本中，春季只有重度發(fā)病梨園中攜帶梨火疫病菌，夏季檢測不到梨火疫病菌，而秋季（9月中旬）在不同發(fā)病程度梨園采集的氣溶膠中均檢測到梨火疫病菌，說明秋季梨園空氣中氣溶膠攜帶梨火疫病菌的濃度高于春季、夏季梨園。該試驗(yàn)結(jié)果與梨園梨火疫病發(fā)病規(guī)律相符。春季為果樹生長初期，梨火疫病發(fā)病率低，擴(kuò)散至空氣中的病菌少，因此只有重度發(fā)病梨園檢測到梨火疫病菌；夏季是果樹生長期，氣溫較高，在30℃以上（梨火疫病的適宜溫度為25～28℃），不利于梨火疫病菌的繁殖和擴(kuò)展蔓延；秋季，經(jīng)過整個(gè)生長季節(jié)的積累以及適宜的氣候條件（秋季有一定量的雨水），梨火疫病發(fā)病率高，擴(kuò)散至空氣中的梨火疫病菌也較多，隨著空氣的流動，整個(gè)疫區(qū)梨園空氣中均攜帶梨火疫病菌。因此，根據(jù)秋季是梨火疫病發(fā)病高峰期的特點(diǎn)，秋冬季防控應(yīng)以修剪病枯枝、藥劑清園為主，即在9月下旬至10月中旬果實(shí)采收后進(jìn)行清園，對病枯枝進(jìn)行全面修剪并及時(shí)清除，同時(shí)選用46%氫氧化銅水分散粒劑或33.5%喹啉銅懸浮劑進(jìn)行藥劑清園，噴淋樹體，降低病原越冬基數(shù)。

Southey等報(bào)道，梨火疫病菌在相對濕度40%～90%時(shí)附著在空氣中小顆粒表面可以很好地存活下來，模擬氣溶膠在露天環(huán)境暴露2h仍有大量病菌存活。含有歐文氏菌Erwinia spp．的氣溶膠至少可存活1h。Crosse等研究發(fā)現(xiàn)，在良好的環(huán)境條件下，葉片損傷是蘋果芽感染解淀粉歐文氏菌E．a(chǎn)mylooora的誘發(fā)因素，氣溶膠落在蘋果芽上，細(xì)菌會迅速繁殖，蘋果感染E．a(chǎn)rnylouora與風(fēng)導(dǎo)致的葉片損傷有關(guān)。盡管每個(gè)氣溶膠顆粒攜帶細(xì)菌數(shù)量很低，但其可能是E．a(chǎn)rnylovora流行病學(xué)上的重要來源。McManus等的研究也表明，風(fēng)、降雨是E．a(chǎn)rnylovora在苗圃中傳播的最重要因素，他們利用空氣微生物采樣器收集空氣樣本，調(diào)查了梨火疫病菌在風(fēng)雨形成的氣溶膠內(nèi)懸浮的可能性，結(jié)果在所有收集的風(fēng)雨形成的空氣樣本中均檢測到梨火疫病菌，而在干燥空氣中收集的樣本幾乎不含病菌。本試驗(yàn)夏季梨園氣溶膠樣本中檢測不到梨火疫病菌的結(jié)果與此結(jié)果相符。

本試驗(yàn)采用病原孢子捕捉器有效地收集到梨園氣溶膠中的梨火疫病菌，且氣溶膠中攜帶的梨火疫病菌具有致病性。由此推斷梨園氣溶膠中攜帶的梨火疫病菌可能造成梨火疫病流行，是梨火疫病的傳播途徑之一。