蒙艷麗，孫一，雷敏瑞，姜焱，王萍，王曉溪，王欣，王偉明

黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150036

肺炎是影響全球兒童健康的一個(gè)公眾問(wèn)題，隨著肺炎相關(guān)疫苗的應(yīng)用，肺炎的常見(jiàn)病原譜正在發(fā)生變化，肺炎支原體（MP）已成為社區(qū)獲得性肺炎的最常見(jiàn)病原之一，占社區(qū)獲得性肺炎的10%～40%，在部分封閉人群中可高達(dá)70%。近年來(lái)，我國(guó)北方地區(qū)MP 感染的發(fā)病率在不斷增加，每2～3 年有1 次流行，流行季節(jié)多在秋冬季[1]。

社區(qū)獲得性呼吸窘迫綜合征毒素（CARDs TX）蛋白被認(rèn)為是目前為止肺炎支原體體內(nèi)單一的毒力因子[2]，是由肺炎支原體MPN372 基因編碼的蛋白，在肺炎支原體的致病過(guò)程中起到了至關(guān)重要的作用[3]。CARDs TX 能夠引起多種炎癥因子釋放，導(dǎo)致相關(guān)組織病理的改變[4]。此外，CARDs TX 作為一種可溶性的炎癥觸發(fā)因子，在MP 感染控制穩(wěn)定一段時(shí)間后仍具有激發(fā)氣道神經(jīng)源性炎癥的功能[5]，如緩激肽及其緩激肽受體，可引發(fā)患者劇烈咳嗽。目前的臨床用藥常選用阿奇霉素等大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素，由于臨床不規(guī)范化及反復(fù)使用，導(dǎo)致肺炎支原體耐藥性劇增，中國(guó)尤為突出，耐藥率接近90%[6-7]，使其臨床應(yīng)用受到限制。無(wú)痰而劇烈的干咳往往需鎮(zhèn)咳藥緩解癥狀，但鎮(zhèn)咳藥主要為中樞性鎮(zhèn)咳藥（可待因、嗎啡、右美沙芬等）、周?chē)枣?zhèn)咳藥（那可丁、苯丙哌林）等，屬特殊藥品，有成癮性或較大不良反應(yīng)，兒童不宜服用[8]。因此，開(kāi)發(fā)既能殺滅肺炎支原體又能治療其感染引起干咳的藥物是臨床的迫切需求。

芩百清肺濃縮丸是國(guó)家批準(zhǔn)的第1 個(gè)用于小兒肺炎支原體肺炎治療的中藥，已完成Ⅲ期臨床，前期作為醫(yī)院制劑用于臨床10 余年，療效確切，患兒咳痰喘等癥狀能夠快速緩解，避免了抗生素不良反應(yīng)及耐藥性，是黑龍江省呼吸科應(yīng)用量最大的醫(yī)院制劑。本研究通過(guò)驗(yàn)證芩百清肺濃縮丸對(duì)CARDs TX、緩激肽受體B2（BDKRB2）表達(dá)的影響，探討芩百清肺濃縮丸減緩患者咳嗽治療肺炎支原體肺炎的作用機(jī)制，為芩百清肺濃縮丸的臨床使用提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 菌株與質(zhì)粒

肺炎支原體菌株（批號(hào)ATCC15531）購(gòu)自美國(guó)Type Culture Collection 公司，大腸桿菌表達(dá)菌株BL21（DE3）、pET28α 質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要藥品和試劑

LB 培養(yǎng)基購(gòu)自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；卡那霉素（批號(hào)2021/12）購(gòu)自索萊寶公司；還原型谷胱甘肽（批號(hào)2021/12）、氧化型谷胱甘肽（批號(hào)2021/12）、異丙基-β-D硫代半乳糖苷（IPTG）（批號(hào)410H052）、溶菌酶（批號(hào)2020/12）購(gòu)自北京博奧拓達(dá)科技有限公司；胎牛血清（批號(hào)11011-8611）購(gòu)自浙江天杭生物科技股份有限公司；RT-PCR 試劑盒（批號(hào)15322、17122）購(gòu)自江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司。

芩百清肺濃縮丸（規(guī)格 6 g，批號(hào) CXZS 1000045）購(gòu)自天合力藥業(yè)有限公司；阿奇霉素分散片（規(guī)格0.25 g，批號(hào)274150404）購(gòu)自石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司。

1.3 主要儀器

MDF-382E-80 ℃低溫冰箱（日本三洋公司）；多功能酶標(biāo)儀（瑞士TECAN 公司）；DP73 顯微鏡成像系統(tǒng)（日本奧林巴斯公司）；BP211D 型電子天平（Sartorius 公司）；GT16-3 型離心機(jī)（北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司）；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技有限公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雄性BALB/c 小鼠，日齡4～6 周，體質(zhì)量18～22 g，56 只，購(gòu)自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（黑）2019-001，實(shí)驗(yàn)單位使用許可證號(hào)SYXK（黑）2019-007，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理批準(zhǔn)單位為黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理批號(hào)SY3R-2021021。

2 方法

2.1 CARDs TX 蛋白的獲取與純化

2.1.1 CARDs TX 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 從NCBI 上獲取MPN372 基因序列，按照大腸桿菌密碼子偏好進(jìn)行序列優(yōu)化，合成目的片段，鏈接于pET28α 質(zhì)粒，得到pET28α-CARDs TX 重組質(zhì)粒。

2.1.2 pET28α-CARDs TX 重組質(zhì)粒的表達(dá) 將pET28α-CARDs TX 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，涂布于含卡那霉素的LB 固體培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。隨機(jī)挑取飽滿的單克隆菌落接種于含1 μg/mL卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃、220 r/min 至600 nm 處吸光度（A600）值為0.4～0.6 時(shí)，加入終濃度0.25 mmol/L 的IPTG 誘導(dǎo)6 h 收菌。

2.1.3 CARDs TX 蛋白的純化 收集誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液，4 ℃、7 000 r/min、10 min 離心收集沉淀；按照濕質(zhì)量每100 毫克加2 mL 的量，加入含有10 mmol/L 咪唑的PBS 溶液，按照1 mg/mL 的量加入溶菌酶，于冰上放置30 min 后，進(jìn)行超聲破碎；破碎后進(jìn)行離心，分離上清與含有包涵體的沉淀；使用復(fù)性液洗滌包涵體3～5 次后離心，棄上清取沉淀，加入3 mL 變性液變性12 h 后，再次離心并取上清；緩慢加入10 倍體積復(fù)性液，于4 ℃冰箱復(fù)性24 h 之后，離心取上清；將液體轉(zhuǎn)移置透析袋中，將裝滿溶液的透析袋置于含大體積PBS 的燒杯中透析24 h；透析后離心去除沉淀，取上清加入超濾離心管中濃縮，收樣用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 Biacore 實(shí)驗(yàn)

2.2.1 CARDs TX 蛋白的預(yù)富集試驗(yàn) 將CARDS TX 蛋白溶液用pH 值為4.0、4.5、5.0 的醋酸鈉溶液充分溶解，用蛋白與氨基直接偶聯(lián)的方法將CARDs TX 固定在CM5 芯片表面（將1 通道視為參比通道，2 通道作為樣本的偶聯(lián)通道）。

2.2.2 CARDs TX 蛋白的配體偶聯(lián)試驗(yàn) 使用EDC、NHS 活化芯片。依據(jù)2.2.1 項(xiàng)下結(jié)果配制CARDs TX 蛋白溶液（pH 值4.0 醋酸鹽緩沖溶液）用于與芯片偶聯(lián)。

2.2.3 芩百清肺濃縮丸進(jìn)樣及結(jié)合能力檢測(cè) 使芩百清肺濃縮丸溶液流經(jīng)CM5 芯片表面。pH 為2.5甘氨酸–鹽酸溶液作為再生試劑流經(jīng)CM5 芯片表面。觀察芩百清肺濃縮丸溶液與CARDs TX 蛋白結(jié)合的響應(yīng)曲線變化情況。

2.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.3.1 肺炎支原體肺炎模型的建立 小鼠自適應(yīng)飼養(yǎng)7 d 后，56 只BALB/c 小鼠被隨機(jī)分為對(duì)照組（9 只）與模型組（47 只）。將除對(duì)照組外的小鼠用乙醚麻醉后，每只從鼻滴入20 μL 1×106CCU 肺炎支原體，每天1 次，共3 d[9]。剔除實(shí)驗(yàn)過(guò)程中死亡的小鼠剩余45 只（造模成功率為96%），將造模成功的小鼠平均分為模型組、阿奇霉素組、以及芩百清肺濃縮丸（4.6、2.3、1.15 g/kg）組，每組9 只。給藥劑量均按照藥品說(shuō)明書(shū)上的人用劑量換算為小鼠劑量ig 給藥。阿奇霉素組ig 0.03 g/kg 阿奇霉素，芩百清肺濃縮丸（4.6、2.3、1.15 g/kg）組分別ig 4.6、2.3、1.15 g/kg 芩百清肺濃縮丸。對(duì)照組與模型組小鼠給予等體積生理鹽水。每天1 次，連續(xù)給藥7 d。末次給藥24 h 后，眼球取血，摘除小鼠肺組織，一半用甲醛固定，另一半凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2 引咳實(shí)驗(yàn) 小鼠末次給藥后被置于內(nèi)有氨水浸潤(rùn)棉球的倒扣的密閉容器中，用秒表計(jì)時(shí)。將小鼠從被放入密閉容器開(kāi)始到第1 次出現(xiàn)咳嗽的時(shí)間稱為咳嗽潛伏期，記錄小鼠從第1 次咳嗽開(kāi)始的2 min 內(nèi)的咳嗽總次數(shù)。

2.3.3 小鼠肺組織病理學(xué)檢測(cè) 取各組小鼠肺組織，用4%甲醛固定，用于病理學(xué)檢測(cè)，顯微鏡下觀察各組肺組織蘇木素–伊紅（HE）染色、Masson 染色的肺組織變化情況。

2.3.4 免疫組化方法檢測(cè)各組肺組織BDKRB2 的表達(dá) 取各組小鼠肺組織，進(jìn)行石蠟包埋并切片制片。將片子脫蠟后沖洗，進(jìn)行抗原修復(fù)處理，孵育一抗、二抗，最后終止反應(yīng)。在電子顯微鏡下觀察各組組織BDKRB2 的染色情況，每張切片分別在不同的位置選取3 個(gè)視野，以著色深淺程度及面積進(jìn)行評(píng)分，淺色為弱陽(yáng)性為1 分，棕黃色為中等陽(yáng)性為2 分，褐色為強(qiáng)陽(yáng)性為3 分；著色細(xì)胞面積數(shù)在25%以下為1 分，在25%～49%為2 分，在50%以上為3 分。最終以二者相乘的綜合積分計(jì)量，若≤3 為陰性，若≥4 為陽(yáng)性，若≥6 為強(qiáng)陽(yáng)性[9]。

2.3.5 RT-PCR 法測(cè)定小鼠肺組織中MPN372、BDRKD2mRNA 表達(dá)水平 取各組小鼠肺組織，根據(jù)RNA 提取試劑盒提取各組小鼠肺組織總RNA，酶標(biāo)儀檢測(cè)各組RNA 濃度。依照One-step reverse transcription PCR kit 說(shuō)明書(shū)檢測(cè)MPN372、BDRKD2mRNA 的表達(dá)水平。其中各引物基因序列如下：

MPN372 正向：5’-CCGGATCCATGCCAAATC CTGTTAG-3’；反向：5’-CTCCTCGAGCTAAAAG CGATCAAA-3’。BDKRB2 正向：5’-CCGAAAGA AGTCTTGGGAGGT-3’；反向：5’-CTGGCGTTCC ACGGAGATG-3’

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 CARDs TX 蛋白的獲取與純化

經(jīng)目的蛋白獲取與純化過(guò)程中各步留樣的SDS-PAGE 電泳可知，加入IPTG 誘導(dǎo)可明顯提高轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌的目的蛋白表達(dá)量（圖1B、C）；破碎菌體并離心后，發(fā)現(xiàn)目的蛋白存在于沉淀中，表明目的蛋白為包涵體表達(dá)（圖1D、E）；變性后得到可溶性蛋白（圖1F）；復(fù)性離心后、透析后得到純度較高的可溶性目的蛋白（圖1G、H）。

圖1 重組質(zhì)粒的表達(dá)及蛋白純化Fig.1 Recombinant plasmid expression and protein purification

3.2 Biacore 驗(yàn)證芩百清肺濃縮丸與CARDs TX 結(jié)合結(jié)果

3.2.1 CARDs TX 預(yù)富集實(shí)驗(yàn) 將CARDs TX 蛋白分別用pH 值為4.0、4.5、5.0 的醋酸鈉溶液中充分溶解，用蛋白與氨基直接偶聯(lián)的方法將CARDs TX固定在CM5 芯片表面。圖2 顯示當(dāng)醋酸鈉溶液的pH 值為4.0 時(shí)（0～250 s），CARDs TX 的富集效果最佳。則pH 值4.0 醋酸鈉溶液即為正式偶聯(lián)時(shí)的實(shí)驗(yàn)條件。

圖2 CARDs TX 蛋白預(yù)富集Fig.2 CARDs TX protein preenrichment

3.2.2 CARDs TX 蛋白與CM5 芯片的偶聯(lián) 結(jié)果顯示CARDs TX 蛋白與CM5 芯片的偶聯(lián)值為953.5。

3.2.3 Biacore 驗(yàn)證芩百清肺濃縮丸與CARDs TX蛋白的結(jié)合結(jié)果 圖3 為芩百清肺濃縮丸溶液與CARDs TX 蛋白結(jié)合的相應(yīng)曲線。圖中顯示通道中CARDs TX 蛋白與芩百清肺濃縮丸溶液的結(jié)合曲線有上升趨勢(shì)，且始終高于通道1。當(dāng)結(jié)合狀態(tài)穩(wěn)定時(shí)，通道2-1 結(jié)合值為130.5 RU（RU＞100 即有效結(jié)合）。因此芩白清肺濃縮丸在體外能與CARDs TX存在分子間結(jié)合作用，故CARDs TX 可能是芩百清肺濃縮丸治療肺炎支原體肺炎作用的靶點(diǎn)。

圖3 Biacore 驗(yàn)證芩百清肺濃縮丸與CARDS TX 蛋白的結(jié)合Fig.3 Biacore verified the combination of Qinbai Qingfei Concentrated Pills and CARDs TX protein

3.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.3.1 小鼠氨水引咳實(shí)驗(yàn)結(jié)果 如表1 所示，與模型組比較，芩百清肺濃縮丸各劑量組小鼠的咳嗽潛伏期顯著延長(zhǎng)（P＜0.01）；芩百清肺濃縮丸4.6、2.3 g/kg 組2 min 內(nèi)咳嗽次數(shù)顯著減少（P＜0.05）。

表1 小鼠氨水引咳實(shí)驗(yàn)結(jié)果（，n=9）Table 1 Experimental results of cough induced by ammonia water in mice (,n=9)

表1 小鼠氨水引咳實(shí)驗(yàn)結(jié)果（，n=9）Table 1 Experimental results of cough induced by ammonia water in mice (,n=9)

與對(duì)照組比較：**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01**P＜0.01 vs control group;#P＜0.05 ##P＜0.01 vs model group

3.3.2 芩百清肺濃縮丸對(duì)小鼠肺組織病理狀態(tài)的影響 如圖4 所示，對(duì)照組小鼠無(wú)感染現(xiàn)象，其肺組織結(jié)構(gòu)完整。模型組小鼠肺組織明顯有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡壁充血嚴(yán)重，肺泡出現(xiàn)塌陷，支氣管上皮大量脫落，還伴有黏膜水腫以及間隙變窄等情況。阿奇霉素組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)較模型組有所好轉(zhuǎn)，炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度降低。芩百清肺濃縮丸各劑量組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)的完整性、支氣管肺組織的水腫情況、炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度等都較模型組有顯著改善。

圖4 各組小鼠肺組織HE 染色顯微圖（×200）Fig.4 HE staining micrograph of lung tissue in each group(×200)

3.3.3 芩百清肺濃縮丸對(duì)小鼠肺組織纖維化的影響 如圖5 所示，對(duì)照組小鼠支氣管壁膠原表現(xiàn)正常，肺泡有較少量膠原纖維；模型組小鼠肺實(shí)質(zhì)、支氣管有大量膠原纖維增生且肺纖維化呈彌漫性；阿奇霉素組、芩百清肺濃縮丸各劑量組小鼠肺泡間隔、支氣管纖維化都得到緩解。

圖5 各組小鼠肺組織Masson 染色顯微圖（×200）Fig.5 Masson staining micrograph of lung tissue of mice in each group (×200)

3.3.4 芩百清肺濃縮丸對(duì)小鼠肺組織BDKRB2 表達(dá)的影響 如圖6、7 所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠肺組織中細(xì)胞著色程度以及著色面積數(shù)最高，BDKRB2 蛋白表達(dá)評(píng)分顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，阿奇霉素組、芩百清肺濃縮丸各劑量組BDKRB2 蛋白表達(dá)評(píng)分顯著降低（P＜0.05、0.01）。

圖6 芩百清肺濃縮丸對(duì)小鼠肺組織BDKRB2 表達(dá)的影響（×200）Fig.6 Effect of Qinbaiqingfei Concentrated Pills on the expression of BDKRB2 in lung tissue of mice (×200)

圖7 芩百清肺濃縮丸對(duì)小鼠肺組織BDKRB2 表達(dá)的影響（IHC 評(píng)分）Fig.7 Effect of Qinbaiqingfei Concentrated Pills on the expression of BDKRB2 in mouse lung tissue (IHC score)

3.3.5 芩百清肺濃縮丸對(duì)小鼠肺組織MPN372、BDKRB2 mRNA 表達(dá)的影響

如表2 所示，與模型組比較，阿奇霉素組、芩百清肺濃縮丸各劑量組小鼠肺組織中MPN372、BDKRB2mRNA 表達(dá)顯著降低（P＜0.05、0.01）。

表2 芩百清肺濃縮丸對(duì)小鼠肺組織MPN372、BDKRB2 mRNA 表達(dá)的影響（，n=9）Table 2 Effects of Qinbaiqingfei Concentrated Pills on MPN372 and BDKRB2 mRNA expression in mouse lung tissue (,n=9)

表2 芩百清肺濃縮丸對(duì)小鼠肺組織MPN372、BDKRB2 mRNA 表達(dá)的影響（，n=9）Table 2 Effects of Qinbaiqingfei Concentrated Pills on MPN372 and BDKRB2 mRNA expression in mouse lung tissue (,n=9)

與對(duì)照組比較：**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01**P＜0.01 vs control group;#P＜0.05 ##P＜0.01 vs model group

4 討論

芩百清肺濃縮丸最早由黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院研發(fā)，作為院內(nèi)制劑在臨床上治療小兒肺炎支原體肺炎10 余年，療效確切。前期研究證實(shí)芩百清肺濃縮丸有抑制纖維素沉積的作用[9]，能促進(jìn)肺組織修復(fù)[10-11]。

CARDs TX 毒素是由MPN372 基因編碼的毒素蛋白，在肺炎支原體肺炎發(fā)病中發(fā)揮著重要作用，與表面活性蛋白A 結(jié)合，黏附氣道表面，刺激氣道神經(jīng)源性炎癥介質(zhì)緩激肽及其BDKRB2 表達(dá)，BDKRB2 的激活會(huì)導(dǎo)致陣發(fā)性咳嗽，因此選擇CARDs TX 與BDKRB2 為靶蛋白，研究芩百清肺濃縮丸治療肺炎支原體肺炎緩解咳嗽癥狀的效果。

本研究通過(guò)前期所做的芩百清肺濃縮丸與CARDs TX 的Biacore 實(shí)驗(yàn)以及后續(xù)的體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，探討芩百清肺濃縮丸干預(yù)后小鼠肺組織咳嗽相關(guān)蛋白與mRNA 表達(dá)水平的變化并得出結(jié)論。HE染色檢測(cè)實(shí)驗(yàn)小鼠肺結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果表明，芩百清肺濃縮丸各劑量組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)的完整性、支氣管肺組織的水腫情況、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度等都較模型組有顯著的改善。Masson 染色檢測(cè)實(shí)驗(yàn)小鼠肺組織纖維化程度，結(jié)果顯示模型組病變明顯，肺組織中出現(xiàn)大量的膠原纖維增生，且肺纖維化呈彌散性；芩百清肺濃縮丸各劑量組小鼠肺泡間隔、支氣管纖維化都得到緩解，膠原含量降低。免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BDKRB2 在小鼠肺組織內(nèi)蛋白量表達(dá)，結(jié)果表明與模型組比較，芩百清肺濃縮丸各劑量組BDKRB2 表達(dá)顯著降低。

綜上所述，芩百清肺濃縮丸可以抑制肺炎支原體CARDs TX 蛋白的作用，具有抑制MPN372、BDKRB2 的表達(dá)的作用，減緩患者咳嗽癥狀治療肺炎支原體肺炎。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突