譚 雪,董 智,張麗苗,袁中勛,李昌曉,*

1 西南大學生命科學學院,三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室,三峽庫區(qū)植物生態(tài)與資源重點實驗室,重慶 400715

2 西南山地生態(tài)循環(huán)農業(yè)國家級培育基地,重慶 400715

三峽大壩正式竣工后,采用了冬蓄夏排的水位調度方式,形成了水位落差達30 m,面積近400 km2的消落帶[1]。在此特殊的水文條件下,消落帶原有的陸生植被大量減少,環(huán)境污染、土地退化等問題日益嚴重,生物多樣性明顯降低[2]。為了改變這一現狀,研究者們篩選出了一些物種用于消落帶的植被重構,其中兩種C4植物狗牙根(Cynodondactylon)[3]和牛鞭草(Hemarthriaaltissima)[4]被確定為消落區(qū)植被修復的優(yōu)良適生草本植物種類。狗牙根屬禾本科多年生草本植物,在消落區(qū)廣泛分布,其根系發(fā)達、繁殖能力強,對水淹和干旱有較強的適應能力[5];牛鞭草是一種在濕潤和干旱環(huán)境都能生長的植物[6—7],在河岸帶植被修復中得到廣泛的應用[8]。目前有關狗牙根、牛鞭草的研究主要集中在水淹脅迫下植物土壤養(yǎng)分變化、根系酶活[9]、光合特性[10]等方面,但對兩種適生草本的土壤微生物,特別是三峽庫區(qū)消落帶水文變化條件下根際微生物的季節(jié)動態(tài)及功能特征方面報道較少,這使得難以準確深入地理解和認識兩種適生草本植物在三峽消落帶特定環(huán)境下的根際微生態(tài)特性。

“根際”這一概念系1901年德國微生物學家 Hiltner首次提出,根際為根系周圍、受根系生長影響的土體[11]。根際微生物是受植物影響最大的土壤微生物群體[12],一方面植物根系分泌物提供能源供微生物所需,另一方面根際微生物還能夠推動土壤物質和能量的流動,促進植株生長[13]。因此,為了從根際微生態(tài)的視角探究適生草本如何適應三峽庫區(qū)消落帶這一特殊生境,本研究選取位于三峽庫區(qū)的重慶忠縣汝溪河流域消落帶修復示范基地為研究區(qū)域,選取經8 a淹水周期,仍然保持良好生長特性的牛鞭草、狗牙根草本植被根際土壤作為實驗材料,采用illumina hiseq測序技術,對兩種適生草本植物根際土壤細菌的季節(jié)動態(tài)分布格局及其驅動因子進行研究,同時結合基于未觀測狀態(tài)重建的群落系統(tǒng)發(fā)育研究(PICRUSt2)功能預測[14]方法,對兩種適生草本植物根際土壤細菌功能類群進行了預測分析,為深入探究消落帶根際土壤細菌群落的變化規(guī)律,了解三峽庫區(qū)消落帶植被修復與重建對土壤微生物菌群的影響提供參考依據。

1 研究地點與方法

1.1 研究地點概況

研究區(qū)域位于重慶市忠縣汝溪河流域(107°32′—108°14′E,30°03′—30°35′N),處于重慶市中部,遠離主城區(qū),水位變化與三峽大壩水位調度方式一致,區(qū)域屬亞熱帶東南季風氣候,季節(jié)分明,降雨充沛,全年溫度≥10℃,年積溫為5787℃,年均氣溫18.2℃,無霜期341 d,日照時數1327.5 h,日照率29%,太陽總輻射能3.5×105J/cm2,年降雨量1200 mm,相對濕度80%。該區(qū)域土壤主要為石灰性紫色土,土壤熟化程度較低,水土流失、土層侵蝕現象嚴重。

課題組于2012年3—4月在重慶忠縣石寶鎮(zhèn)汝溪河流域的消落帶構建植被修復示范基地,基地面積13.3 hm2,土壤質地、肥力狀況基本一致。研究區(qū)域內,栽植有大量的牛鞭草、狗牙根多年生草本植物,所選岸坡樣地平均坡度為26°,岸坡光照輻射強度大致相同,土壤雨熱條件基本一致,植被覆蓋率為100%。經過連續(xù)8 a的淹水周期,植物生長狀況良好。

1.2 樣品采集與土壤化學性質測定

根據水位在忠縣石寶鎮(zhèn)汝溪河流域的變化及植被生長情況,本實驗分別于2020年5月(春季)、7月(夏季)、9月(秋季)進行野外取樣調查,其采樣時間分別對應消落帶退水初期、草本植被生長旺盛期及消落帶淹水前期,而冬季適生草本植被處于水淹狀態(tài),無法完成土壤取樣。

實驗材料為經過8 a反復水淹,生長狀況良好的多年生草本植物狗牙根、牛鞭草根際土壤。為了確保樣地不受到消落帶上部可能的人為干擾以及下部的水文干擾帶來的影響,采樣時選擇在海拔160—170 m中間地帶劃定S形取樣帶。在此海拔區(qū)間,兩種草本生長狀況良好,植被純度及覆蓋率高,在S形樣帶內劃定3個1 m×1 m取樣樣方,每個樣方間距十米以上。在每個樣方內按梅花形設置5個(15 cm×15 cm×20 cm)重復取樣點,去除表層地被物后,采集0—20 cm土層的原狀土壤樣品,然后將一個樣方內的根際土壤混合。根際土壤的采樣方法參考Riley和Barberd的抖落法,除去根系附近的石子及動植物殘體,抖落根系表面的粒土和雜質,采集附著于根際表面4 mm以內的土壤作為根際土樣[15]。每個季節(jié)采集土壤混合樣本6個,3個季節(jié)共采集根際土壤混合樣本18個。

采集的土壤樣品分為兩部分,一部分儲存于-80℃用于細菌群落測定,一部分自然風干,研磨過篩(1 mm和0.25 mm),用于其他土壤化學性質的測定。土壤含水量采用烘干法[16]測定,土壤pH值采用電極電位法測定(1∶2.5土水比浸提液),土壤全碳(TC)、全氮(TN)含量測定采用元素分析儀(Elementar Vario EL,德國),土壤有機質(OM)測定采用水合熱重鉻酸鉀-硫酸-比色法[17];土壤全磷(TP)、速效磷(AP)含量測定采用鉬銻抗比色法;全鉀(TK)、速效鉀(AK)含量測定采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜法[18](ICP-OES, Thermo Fisher iCAP 6300,英國),土壤硝態(tài)氮、銨態(tài)氮采用全自動間斷化學分析儀(CleverChem,德國)測定。

1.3 基于高通量測序的細菌群落結構分析

本研究中根際土壤總DNA的提取采用DNeasy? PowerSoil? Kit(QIAGEN)試劑盒,操作步驟按內置使用說明書進行,提取的總DNA經過1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,然后置于-20℃保存?zhèn)溆?。采用通用引物細?6S V4—V5 區(qū)進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增,引物序列為515F(5-GTGCCAGCMGCCGCGG-3)和907R(5-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3),每個樣品進行三次重復擴增,然后混合同一樣品擴增產物;PCR產物切膠純化,Qubit熒光定量儀定量之后,等摩爾混合,建立測序文庫,采用 illumina hiseq 進行測序。

測序獲得的數據采用微生物生態(tài)學定量研究平臺研究平臺(QIIME)進行進一步的生物信息學分析[19],采用FLASH算法拼接雙端序列,同時,為獲得高質量序列,根據質量分數Q20對序列進行質控,使用UPARSE算法[20]將得到的高質量序列進行聚類OTU,在聚類過程中嚴格去除嵌合體序列,使用核糖體數據庫項目(RDP)數據庫對可操作分類單元(OTU)代表序列進行物種注釋。

土壤細菌α多樣性由Chao1指數、Simpson指數、Shannon指數、Observed-Otus和PD-whole-tree指數進行表征,Chao1指數反映了種群的豐富度,Shannon和Simpson指數反映了物種多樣性,Observed-Otus表示注釋的OTU數目,通過對相似度高于97%的序列進行Cluster聚類得到。PD-whole-tree指數是基于系統(tǒng)發(fā)育樹進行計算的,其過程是將樣品的代表序列發(fā)育樹枝長加和,得到多樣性指數,其值越大,群落多樣性越高。

相關計算公式為:

其中,S1為觀察到的OTU目;ni=含有i條序列的OTU數目;N=所有序列數。

1.4 統(tǒng)計分析

采用單因素方差分析(ANOVA)對不同季節(jié)根際土壤理化特性及細菌群落功能豐度進行分析,采用冗余分析(RDA)分析微生物群落與土壤理化性質之間的關系,用PICRUSt2[21]對細菌群落進行功能預測分析,下游數據分析在QIIME、R軟件、SPSS 18.0中進行,采用R 4.0.3、Canoco 5、Excel 2018作圖。

2 結果與分析

2.1 植物根際土壤理化性質

研究區(qū)域土壤溫度在不同季節(jié)間存在顯著差異(P<0.05),其中夏季溫度最高(表1)。如表1所示,根際土壤含水量范圍為16.84%—18.86%,季節(jié)間差異不顯著。狗牙根和牛鞭草兩種適生草本根際土壤pH值范圍為6.89—7.37,且夏秋兩季pH值顯著高于春季(P<0.05)。與此同時,根際土壤全碳、全氮含量夏季顯著高于秋季(P<0.05);土壤有機質含量秋季顯著低于春夏兩季(P<0.05);土壤銨態(tài)氮含量夏季顯著大于春季(P<0.05);土壤速效鉀隨季節(jié)逐漸升高,且秋季顯著大于春季(P<0.05)。

表1 植物根際土壤理化性質的季節(jié)動態(tài)變化

2.2 根際土壤微生物群落α多樣性指數

經過對3個季節(jié)兩種適生草本根際土壤樣品進行16S rRNA測序及物種注釋,共得到 24409個OTU,其中春季、夏季、秋季各有16499、17111、19559個OTU。3個季節(jié)共有的OTU數目為11486,約占總數的47.1%;春季和夏季獨有的OTU數目較為相似,分別占OTU總數的8.1%和8%,而秋季獨有的OTU數目最多,約占全部的13.1%?？梢?秋季草本根際土壤中細菌物種數最多,春季和夏季較少(圖1)。

圖1 不同季節(jié)根際土壤細菌OTUs Venn圖

如表2所示,研究區(qū)域狗牙根與牛鞭草兩種草本的根際土壤細菌群落α多樣性指數存在顯著的季節(jié)性差異,在春、夏、秋三次取樣中,Chao1、Shannon指數、Observed-Otus均表現為秋季顯著大于春夏兩季(P<0.05)、PD-whole-tree指數在秋季顯著大于春季(P<0.05)。

表2 根際土壤細菌群落α多樣性指數的季節(jié)變化

2.3 根際土壤微生物群落結構組成

通過對3個季節(jié)植物根際土壤樣本的高通量測序,共獲得1882871條高質量序列,其中最少序列為27715條,最多序列為233350條,平均104604條。這些序列的99.87%可以分類到不同的細菌門,0.09%與數據庫進行對比后分類到古菌門類。

所有樣本共檢測到細菌60門、151綱、245目、268科和403屬。圖2和圖3分別展示了不同季節(jié)各樣地門(Phylum)和綱(Class)分類水平的細菌群落結構。由圖2可知,3個季節(jié)適生草本根際土壤中檢測到的主要門有變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、放線菌門(Actinobacteria)、浮霉菌門(Planctomycetes)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、厚壁菌門(Firmicutes)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)和未知菌門(WS3)。其中,變形菌門、酸桿菌門、擬桿菌門是根際土壤中占主導地位的細菌門類,約占細菌總數的70.46%。各個季節(jié)根際細菌群落在組成上較為相似,其中僅放線菌門的相對豐度在春季顯著低于秋季(P<0.05),芽孢桿菌門的相對豐度在夏季顯著低于秋季(P<0.05),其余各門在季節(jié)間分布較均勻,差異不顯著。綱分類層次(圖3)的統(tǒng)計表明,樣品中優(yōu)勢菌綱主要有α-變形桿菌綱(Alphaproteobacteria)、β-變形菌綱(Betaproteobacteria)、酸桿菌綱(Acidobacteria-6)、δ 變形菌綱(Deltaproteobacteria)、γ變形菌綱(Gammaproteobacteria),約占全部樣品的51.41%,其中,僅α-變形桿菌綱相對豐度在春季顯著高于夏季(P<0.05)。

圖2 不同季節(jié)根際土壤樣品中優(yōu)勢細菌門的相對豐度

2.4 根際土壤細菌群落與環(huán)境因子相關性

圖4展示了各季節(jié)對細菌群落結構貢獻率較大的理化因子與主要細菌門類的相關關系,其結果表明,春季適生草本根際土壤中94.26%的細菌群落變化是由土壤理化性質引起的,此外,RDA圖的軸1解釋了81.04%,軸2進一步解釋了13.22%,對根際細菌群落結構貢獻率較大的有土壤氧化還原電位(ORP)和TP;此外,變形菌門、硝化螺旋菌門與土壤pH值和含水量呈顯著正相關關系,與土壤ORP呈顯著負相關關系。

圖4 不同季節(jié)環(huán)境因素對土壤細菌群落結構特征影響的冗余分析

夏季第一物種軸與第二物種軸分別可以解釋78.17%、17.36%的物種數據變化,累計解釋了95.53%的物種-環(huán)境關系,對夏季根際細菌群落貢獻較大的有土壤AK和TP,其中土壤AK對細菌群落有顯著影響;此外,土壤AK、TK、TP和TN與放線菌門、變形菌門呈正相關關系,與硝化螺旋菌門、厚壁菌門和綠彎菌門呈負相關關系。

2.5 根際土壤細菌群落功能預測

通過對京都基因與基因組百科全書(KEGG)數據庫進行比對,共獲得6類一級生物代謝通路功能(圖5):代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理、細胞過程、有機系統(tǒng)、人類疾病。在分布于6個代謝途徑的細菌群落中,共鑒定了45個二級KEGG數據庫中功能直系同源物(KO)組。其中,代謝、人類疾病、遺傳信息處理和環(huán)境信息處理途徑最為普遍,分別占27.47%、19.4%、18.23%和14.06%。

圖5 不同季節(jié)根際細菌預測功能基因一級功能豐度圖

對預測基因二級功能層豐度進行分析(圖6),發(fā)現根際細菌群落主要涉及膜運輸(10.69%)、翻譯(9.69%)、氨基酸代謝(8.84%)、碳水化合物代謝(7.09%)、輔助因子和維生素的代謝(5.78%)、能量代謝(Energy metabolism)(5.38%)、復制和修復(5.14%)等45個二級功能,其中14個功能基因的豐度表現出顯著的季節(jié)性差異(圖6)。

圖6 不同季節(jié)根際細菌預測功能基因二級功能豐度圖

3 討論

3.1 不同季節(jié)適生草本根際細菌群落結構特征

三峽庫區(qū)消落帶適生草本根際土壤細菌優(yōu)勢門為變形菌門、酸桿菌門、擬桿菌門、綠彎菌門,這與大量研究土壤細菌的文獻結果較為一致[22—23]。本研究中,3個季節(jié)細菌群落結構在門水平上組成較為相似,說明適生草本經過8 a的反復水淹,形成了較為穩(wěn)定的根際細菌群落環(huán)境。變形菌門是根際細菌群落中豐度最大的一個門,現有的研究表明,變形菌門廣泛分布于各種生境,如湖泊濕地[24]、鹽漬化土壤[25]、溫帶針葉林土壤[26]等,其包括的α-變形桿菌綱、β-變形菌綱、δ變形菌綱和γ變形菌綱在綱水平所占比例也超過了41%。α-變形桿菌綱包含有植物共生菌(根瘤菌)等固氮細菌[27],春季α-變形桿菌綱的相對豐度顯著高于秋季,對提高適生草本在退水初期固氮能力,進而促進植物快速生長具有重要意義。

放線菌門多數嚴格好氧,其分枝狀的菌絲體能夠產生各種胞外水解酶,降解土壤中各種難溶性有機物質以供細胞代謝所需的各種營養(yǎng),在自然界物質循環(huán)、土壤改良等方面都具有重要作用[28]。本研究中,放線菌門在秋季的相對豐度均顯著高于春季,這與春季消落帶退水初期土壤含水量高有一定關系,土壤水分過多會降低其透氣性,而土壤含氧量較高的環(huán)境更適合放線菌門的生長,同時,放線菌能夠分解纖維素和木質素[29],秋季的土壤中,由于經過了一個生長季,可能有更多的纖維素和木質素,提供了更多的營養(yǎng)源供給放線菌的生長繁衍。Lauber等[30]發(fā)現芽單胞菌門更適合在土壤含水量較低的環(huán)境下生存,芽單胞菌門在夏季的相對豐度均顯著低于秋季,這與取樣年份研究區(qū)降水過多有關,且取樣當年夏季水位線一直保持較高水平,這也在一定程度上說明了環(huán)境條件的變化會影響細菌群落的組成和分布。

3.2 不同季節(jié)適生草本根際土壤細菌群落與多樣性的影響因素

利用多樣性指數分析土壤細菌群落是一種非常有效的方法[31],土壤細菌多樣性對提高土地生產力、增強脅迫環(huán)境下群落穩(wěn)定性有著重要影響[32]。本研究發(fā)現,根際細菌α多樣性的變化與季節(jié)顯著相關,說明土壤環(huán)境的季節(jié)變化顯著影響適生草本根際細菌群落的豐富度和均勻度,且根際細菌群落的α多樣性指數都表現為秋季>夏季>春季,即根際細菌種類隨時間推移逐漸增加。有學者通過研究呼倫貝爾草原土壤細菌多樣性的季節(jié)變化特征,發(fā)現α多樣性指數在夏季最高,其次為秋季[33]。但本研究結果與之不同,這與三峽庫區(qū)反季節(jié)水位調度方式有關,即夏季低水位運行,冬季高水位運行,春季消落帶水位逐漸下降,植物初露開始生長,細菌群落多樣性最低;夏季溫度最高,植被逐漸恢復生長,群落多樣性較春季有所上升,但取樣當年研究區(qū)夏季降水較多,土壤通氣性和水分入滲減少,厭氧條件會限制好氧微生物的生長[34];秋季降水較夏季減少,植物生長繁茂,植被的生長可以為細菌提供分泌物等一系列資源,故秋季群落多樣性最大?？傮w而言,這些結果表明,適生草本根際細菌群落多樣性對季節(jié)性環(huán)境波動有明顯響應。

土壤溫度、濕度、pH值、有機和無機養(yǎng)分水平的變化可以影響微生物群落的結構[35]。RDA分析顯示,影響研究區(qū)適生草本根際土壤細菌群落結構的理化因子主要有土壤ORP、土壤有機質、土壤全磷和全鉀等。Husson證明了土壤ORP是土壤、植物、微生物系統(tǒng)的主要驅動因素[36],這與本研究結果相似,消落帶為水陸交錯地帶,干濕交替的土壤環(huán)境下,土壤氧化還原電位降低,促進還原物質產生,有利于有機質及氮元素的積累[37],從而對細菌群落結構造成影響;土壤有機質對秋季細菌群落結構有顯著影響(P<0.05),有機質含量與土壤肥力存在著密切的關系,可為植物提供營養(yǎng)物質,促進植物的生長發(fā)育,同時也可改變土壤的物理性質,促進土壤微生物的活動[38],本研究中土壤有機質含量與細菌群落結構顯著相關,其原因是隨著人工修復草本植被年份的增加,土壤肥力得到很大改善,土壤根系分泌物增加,進而導致微生物群落結構的改善。

3.3 不同季節(jié)適生草本根際土壤細菌功能特征

植被對土壤細菌群落結構的影響會進一步影響土壤細菌功能組成[39],目前三峽庫區(qū)消落帶土壤微生物研究主要集中在細菌群落多樣性[40],對細菌功能方面鮮有研究。PICRUSTt較宏基因組研究成本低,更加方便快捷,已廣泛的用于土壤[41]、水體[42]等不同生境的微生物功能研究。

PICRUSt2功能預測結果表明,三峽庫區(qū)消落帶適生草本根際土壤中共有代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理、細胞過程、有機系統(tǒng)、人類疾病6個一級功能層和膜運輸、翻譯、氨基酸代謝、碳水化合物代謝等45個二級功能層。土壤代謝功能在一級功能層中占比最高,這與對濕地土壤細菌功能研究的結果一致[43]。部分細菌類群可通過代謝產生抗生素、抑菌蛋白及促生長激素等,從而提高消落帶適生草本植物抑制病原菌的能力,促進植物的生長[44]。

碳和氮的數量和質量可以通過調節(jié)細菌群落組成來驅動地下生態(tài)功能[45]。二級功能層中,膜運輸、翻譯、氨基酸代謝、碳水化合物代謝的功能基因豐度最高,總計超過了36%。土壤細菌活躍的膜運輸功能有利于維持細菌各項生命活動,是土壤細菌正常發(fā)揮其功能的基礎[46]。氨基酸代謝主要通過脫氨作用、轉氨作用、聯(lián)合脫氨或脫羧作用分解成α-酮酸、胺類及CO2,是碳代謝和氮代謝的中樞;碳水化合物合成與代謝則與氮、磷循環(huán)呈正相關,間接說明土壤細菌豐富度越高越有利于氮、磷的轉化和遷移[47],適生草本根際細菌中高豐度的此類功能基因,證明了根際土壤細菌在氮磷循環(huán)中發(fā)揮著重要的作用,同時氨基酸代謝可助細菌吸收氨基酸[48],利于適生草本在消落帶特殊生境下的存活與繁衍。根際土壤細菌α多樣性指數在春季最低,而膜運輸基因則在春季表現出最高豐度,這一現象與生態(tài)系統(tǒng)的自我調節(jié)機制有關,高豐度的膜運輸功能基因可調節(jié)溶質如離子和小分子等通過生物膜,以促進根際土壤細菌在消落帶退水初期快速生長。同時,各代謝途徑在不同季節(jié)中也表現出一定差異,這與不同季節(jié)的植物相關活動有關,植被凋落物和根系分泌物的季節(jié)差異會改變土壤細菌組成和多樣性,進而對土壤功能微生物產生特定的影響[49]。

盡管PICRUSt2功能預測能夠對細菌功能進行分析,但由于該功能預測沒有基因數據支持,存在一定缺陷[50],后續(xù)可結合宏基因組技術,對根際細菌與適生草本的相互作用機制進行進一步的研究。

4 結論

三峽庫區(qū)適生草本植物根際土壤細菌多樣性在秋季顯著大于夏秋兩季,而細菌群落組成在各季節(jié)差異不大,其中變形菌門、酸桿菌門、擬桿菌門、綠彎菌門為適生草本根際土壤中的優(yōu)勢菌門。土壤ORP和TP對春季細菌群落影響較大,AK對夏季細菌群落影響顯著,OM和SWC對秋季細菌群落影響顯著。根際土壤細菌功能預測表明,三峽庫區(qū)消落帶適生草本根際土壤中與C、N、P有關的細菌代謝功能豐度較高。