全棋,管時偉,林泉,彭明暉,俞海波
溫州醫(yī)科大學定理臨床學院/溫州市中心醫(yī)院 肝膽胰外科,浙江 溫州 325000
胰腺癌是目前世界上高度惡性腫瘤之一,盡管近年來胰腺癌患者的5 年生存率有所上升,但仍低于10%[1-2]。在免疫治療對胰腺癌療效并不顯著的現(xiàn)今,化療仍是胰腺癌臨床治療的重要手段[3-4]。吉西他濱(gemcitabine,GEM)在卵巢癌、膀胱癌和非小細胞肺癌等多種腫瘤中取得了不錯的效果。但在胰腺癌中,GEM的臨床療效面臨兩個巨大的問題:GEM的毒副作用和GEM耐藥性。GEM的化療耐藥涉及多個方面,如藥物代謝途徑的改變、腫瘤微生物的影響和腫瘤微環(huán)境改變等[5-6]。如何改善GEM對胰腺癌的治療效果是一個值得深入研究的問題。其中一種有效改善GEM耐藥的策略是采用納米材料包載GEM,提高其遞送效率和選擇性[7]。而基于SiO2包被的Fe3O4復合納米顆粒在彌補Fe3O4較不穩(wěn)定的缺點同時具有較好的水溶性,可作為一種具有應用潛力的材料。
氨水(濃度為28%)、三氯化鐵(FeCl3)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、甲醇、乙二醇、乙酸銨、冰乙酸、鹽酸GEM、硅酸四乙酯(TEOS)購自阿拉丁公司。1640 培養(yǎng)基、胎牛血清FBS、胰酶、磷酸鹽緩沖液(PBS)、青霉素-鏈霉素購自Gibco公司。二甲苯、酒精、中性樹膠購自國藥公司。蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒購自Solarbio公司。CCK-8試劑盒購自碧云天公司。PANC02小鼠胰腺癌細胞和PaEC小鼠胰腺上皮細胞購自普諾賽公司,Balb/c裸鼠購自斯貝福公司。實驗的實施得到溫州醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會的批準(批號:xmsq2023-1361)。
SiO2@Fe3O4復合納米顆粒的制備分為兩步(圖1)。(1)將1.5 g FeCl3、1 g PVP和2 g乙酸鈉加入乙二醇中,攪拌至完全溶解并加熱,洗滌烘干后得Fe3O4微球。(2)稱取0.2 g Fe3O4分散于無水乙醇∶水(5∶1)溶液中,隨后滴加TEOS與氨水的溶液,洗滌烘干后得SiO2@Fe3O4微球。透射電鏡(transmission electron microscopy,TEM)照片由美國FEI Talos F200S型高分辨透射電子顯微鏡測得;采用布魯克Tensor Ⅱ型傅立葉紅外光譜儀測試樣品的特征吸收峰及表面基團的變化,掃描范圍為4 000~400 cm-1進行分析。
圖1 SiO2@Fe3O4復合納米顆粒制備流程示意圖
取SiO2@Fe3O4復合納米顆粒分散于無水乙醇中,加入GEM,避光磁力攪拌。得到產(chǎn)物裝于透析袋中透析24 h。精密稱定GEM對照品,配制成1.0 mg/mL貯備液,用超純水稀釋成一系列標準溶液。將GEM-SiO2@Fe3O4溶液置于透析袋中透析24 h。取標準品溶液過濾后注入HPLC系統(tǒng)中進行測定,測得GEM標準工作曲線。取透析介質(zhì)過濾后進行測定,測得游離GEM含量,計算包封率、載藥率。
稱定GEM對照品適量,配制成1.0 mg/mL貯備液,用超純水稀釋成一系列標準溶液。精密稱定1.0 mg GEM-SiO2@Fe3O4和0.1 mg GEM干燥粉末,分別溶于1 mL PBS緩沖液中。以恒定速率振蕩,分別在1、2、4、6、8、12、18、24、36、48 h時取出1 mL緩沖溶液,并補加相對應體積的緩沖溶液。取10 μL緩沖溶液通過0.22 μm過濾器過濾后注入HPLC系統(tǒng)中進行測定。測得緩沖溶液的峰面積,結(jié)合GEM標準曲線,計算出各個時間點的藥物釋放量,繪制體外藥物釋放曲線。體外藥物釋放曲線計算公式如下:
式中Q,累積釋藥百分率;Ct,各時間點緩沖溶液中的藥物濃度(μg/mL);V0,緩沖溶液總體積(mL);V,取出的緩沖溶液的體積(mL);W,透析袋中的藥物含量(mg)。
取SiO2@Fe3O4復合納米顆粒適量,分別用PBS(pH=7.4)緩沖液和RPMI-1640 培養(yǎng)基稀釋至0.1 mg/mL,使用Malvern Zetasizer納米粒度儀在1、2、3、4、5、6和7 d的時間內(nèi)測量粒徑,取3個讀數(shù)的平均值作為結(jié)果。
采用CCK-8 法。將PANC02 小鼠胰腺癌細胞和PaEC小鼠胰腺上皮細胞進行細胞培養(yǎng)及傳代并制備細胞懸液。在計數(shù)板每孔加入100 μL 5 000個細胞。過夜貼壁后,分別給予不同濃度的SiO2@Fe3O4復合納米顆粒溶液,并設定僅加細胞不加任何刺激的空白對照組和僅加培養(yǎng)液的溶劑對照組,每組設6 個復孔,分別避光培養(yǎng)48 和72 h。培養(yǎng)結(jié)束,棄去原培養(yǎng)液,加入100 μL含10% CCK8試劑的無血清培養(yǎng)液。1 h后在450 nm波長下測量吸光度值。
PANC02 細胞用胰酶消化后洗去胰酶并制備細胞懸液。選擇Balb/c雄性裸鼠皮下接種PANC02細胞。將24 只裸鼠隨機分為4 組,前三組分別經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水(空白對照組/NS組)、5 mg/kg的GEM(GEM組)和以5 mg/kg GEM計的GEM-SiO2@Fe3O4(GEM-SiO2@Fe3O4組)。最后一組注射以5 mg/kg GEM計GEM-SiO2@Fe3O4后麻醉并在體外接近靶區(qū)腫瘤部位施加磁場2 h(GEM-SiO2@Fe3O4-M組)。每次間隔3 d給藥一次并用游標卡尺測量腫瘤大小,計算相對腫瘤體積。實驗終點將動物處死,測量并計算腫瘤體積。將腫瘤制作組織切片,進行病理分析。游標卡尺測量腫瘤最長(a)和最短(b)部位。腫瘤體積(V)按以下公式計算:
PANC02 細胞接種于裸鼠皮下。將36 只裸鼠按照體質(zhì)量均分為3 組:尾靜脈注射5 mg/kg GEM(GEM組),以5 mg/kg GEM計的GEM-SiO2@Fe3O4(GEM-SiO2@Fe3O4組)和以5 mg/kg GEM計的GEMSiO2@Fe3O4,麻醉后在體外接近靶區(qū)部位施加磁場(GEM-SiO2@Fe3O4-M組)。于給藥或外加磁場處理后0.5、1、2、4 h各取3只裸鼠解剖并取心、肝、脾、肺、腎及腫瘤組織,稱定質(zhì)量。
將GEM貯備液稀釋制備得到的對照品溶液用于計算校準曲線。吸取裸鼠各組織勻漿200 μL,加入GEM標準溶液適量,制成一系列濃度組織勻漿樣品。離心后,將有機相蒸發(fā)干燥,殘渣溶解后混合離心。取10 μL上清過濾后進行測定。各組織加入3倍量生理鹽水,用勻漿器制備組織勻漿液,用相同的方法得到上清液。利用校準曲線計算各樣品中GEM的濃度。
用生理鹽水沖洗組織后,干燥后放入10%甲醛固定。觀察形態(tài)學變化后,石蠟包埋,連續(xù)切片??酒蠼?jīng)過脫蠟-蒸餾水沖洗-蘇木素和2%伊紅染色-梯度酒精脫水-二甲苯透明-中性樹膠封片等過程,得到組織切片。最后在光學顯微鏡下觀察組織切片。
采用傅里葉變換紅外光譜法(FT-IR)對Fe3O4、SiO2和Fe3O4@SiO2納米顆粒進行了鑒定,得到的FTIR如圖2A所示。FT-IR結(jié)果顯示Fe3O4中570 cm-1處有鐵氧鍵的伸縮振動峰[8]。SiO2中807 cm-1處是Si-OSi的伸縮振動峰,1 047cm-1處是Si-OH的不對稱振動峰,SiO2@Fe3O4復合納顆米粒中既有鐵氧鍵特征峰又有Si-O-Si和Si-OH特征峰,這說明SiO2成功包覆在Fe3O4納米顆粒上[9]。
圖2 Fe3O4、SiO2及SiO2@Fe3O4復合納米顆粒的FT-IR(A)和Fe3O4納米顆粒及SiO2@Fe3O4復合納米顆粒TEM結(jié)果(B)
從TEM中可見制得的Fe3O4顆粒為球形,粒徑大小均勻(200 nm)。此外,TEM示SiO2@Fe3O4粒徑220~260 nm,中間部分顏色較深,證明Fe3O4被包覆在里面,外層相對明亮的部分具有介孔SiO2結(jié)構(gòu),說明Fe3O4與SiO2復合顆粒制備成功(圖2B)。
載藥率是指單位質(zhì)量或單位體積微球/納米顆粒所負載的藥量,其中能釋放的藥量為有效載藥量。除藥物與基質(zhì)發(fā)生不可逆結(jié)合外,載藥量可看成是微球/納米顆粒的含藥量。包封率是指被包裹物質(zhì)在納米顆粒懸液中占藥物總量的百分量。它是納米顆粒質(zhì)量控制的一個重要的指標,反映了藥物被載體包封的程度。因此我們計算了SiO2@Fe3O4復合納米顆粒對GEM的載藥量和包封率。我們利用HPLC法,測定不同濃度的GEM標曲溶液,記錄峰面積,建立的回歸方程為:
結(jié)合相應標準曲線計算得出(圖3),GEM的包封率為84.8%,載藥率為7.8%。
圖3 GEM標準溶液在HPLC系統(tǒng)中測定的標準工作曲線
與游離GEM相比,GEM-SiO2@Fe3O4復合納米顆粒12 h內(nèi)的GEM釋放率達到30%,24 h左右達到50%左右,隨后維持在60%左右,而游離GEM在12 h內(nèi)釋放率即達約75%(圖4)。
圖4 GEM-SiO2@Fe3O4復合納米顆粒和GEM的藥物體外釋放曲線
SiO2@Fe3O4復合納米顆粒穩(wěn)定性實驗顯示,隨著時間的變化,該納米材料的徑粒在PBS 或RPMI-1640 培養(yǎng)基中均無明顯變化,說明制備的納米顆粒具有一定的穩(wěn)定性(圖5A)。為了進一步評估空載體SiO2@Fe3O4復合納米顆粒對PANC02胰腺癌細胞和PaEC小鼠胰腺上皮細胞的增殖影響,我們使用CCK8 檢測了細胞活性。結(jié)果顯示,兩種細胞的活性均高于80%(圖5B)。這表明細胞的生長狀態(tài)和數(shù)量未受到SiO2@Fe3O4復合納米顆粒本身材料的影響。這表明制備的納米復合顆粒無明顯的細胞毒性,生物相容性良好。
圖5 SiO2@Fe3O4復合納米顆粒的穩(wěn)定性及生物相容性
從裸鼠胰腺癌移植瘤組織大體標本上看,GEM組和GEM-SiO2@Fe3O4組的裸鼠胰腺癌移植瘤體積均小于NS組,但與GEM組相比,GEM-SiO2@Fe3O4組的胰腺癌腫瘤體積更?。▓D6A)。此外,比較裸鼠胰腺癌組織質(zhì)量和體積時,GEM組和GEM-SiO2@Fe3O4組之間差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05,圖6B、6C)。外加磁場作用下的GEM-SiO2@Fe3O4與GEM組相比,顯示GEM-SiO2@Fe3O4組的胰腺癌腫瘤組織的質(zhì)量和體積更少(均P<0.05)。這表明,SiO2@Fe3O4能將GEM富集在附加磁場附近釋放,并產(chǎn)生顯著療效。各組心、肝、脾、肺和腎HE染色沒有顯示明顯的器官損傷跡象,表明該材料具有良好的生物相容性。與NS組相比,GEM組和GEM-SiO2@Fe3O4組腫瘤組織出現(xiàn)局部壞死,而GEM-SiO2@Fe3O4-M組的腫瘤組織壞死更廣泛(圖7)。
圖6 不同實驗條件下的裸鼠胰腺癌移植瘤的大小、生長曲線及質(zhì)量
圖7 不同實驗條件下裸鼠心、肝、脾、肺、腎和腫瘤組織病理圖片(HE,×200)
GEM-SiO2@Fe3O4的從0時到最終可定量時間點的血藥濃度-時間曲線下面積(AUC0-t)、從0到無窮大時間的血藥濃度-時間曲線下面積(AUC0-∞)升高(均P<0.01),平均駐留時間(MRT0-∞)、末端消除半衰期(t1/2β)延長(均P<0.05),清除率(CL)顯著降低(P<0.001),表明該材料可延長GEM的半衰期并延長其在體內(nèi)的作用時間。表觀分布容積(Vd)顯著升高(P<0.01),說明藥物在全身分布且有可能在某臟器濃集(表1)。游離GEM在裸鼠肝、腎組織內(nèi)分布較多,GEM-SiO2@Fe3O4除在肝腎中分布外,在腫瘤組織中的分布有增加,且消除較慢(圖8)。在外加磁場的作用下,GEM在腫瘤組織中富集更明顯。
表1 GEM組、GEM-SiO2@Fe3O4組和GEM-SiO2@Fe3O4-M組的藥代動力學結(jié)果
圖8 GEM組、GEM-SiO2@Fe3O4組和GEM-SiO2@Fe3O4-M組中的GEM在不同時間下心、肝、脾、肺、腎和腫瘤中的分布濃度
在本研究中,我們通過TEM和FT-IR對SiO2@Fe3O4的結(jié)構(gòu)進行表征,結(jié)果顯示SiO2成功實現(xiàn)了對Fe3O4顆粒的包被。既往研究已表明裸露的Fe3O4顆粒結(jié)構(gòu)在有氧環(huán)境中極不穩(wěn)定,而SiO2具有低毒性、高親水性等特點[10-11]?;赟iO2包被的Fe3O4納米顆粒具有較好的水溶性,并且部分彌補了Fe3O4較不穩(wěn)定的缺點,為改善GEM的化療耐藥提供了實踐基礎[12]。
此前研究表明,SiO2@Fe3O4可與藥物聯(lián)合治療腫瘤。Shahabadi等[9]的研究表明,F(xiàn)e3O4@SiO2復合納米顆粒可作為一種有效載體,提高阿糖胞苷的生物利用度,增強其對早幼粒細胞白血病的療效。此外,GEM-SiO2@Fe3O4復合納米顆粒的維持時間較游離GEM長。這表明我們設計的GEM-SiO2@Fe3O4可以持久地釋放。這可以減少突釋效應的同時起到藥物緩釋的作用。為了降低GEM的毒性,提高其治療效果,其中一種方法是通過納米載體包載GEM,提高其遞送效率和選擇性[7]。本研究初步證明SiO2@Fe3O4納米顆粒在體外具有一定的穩(wěn)定性及組織相容性。并且相較于游離GEM,有附加磁場下的GEMSiO2@Fe3O4有更好的抗腫瘤效果,并且不會損傷正常組織。但附加磁場下的GEM-SiO2@Fe3O4抗腫瘤效果與游離GEM相比未顯示出統(tǒng)計學意義上的差異。部分原因可能是由于納米顆粒粒度小,使得納米顆粒易穿出血管而滯留于腫瘤組織,因此藥物相對富集,但被動靶向的作用有限。此外,藥代動力學結(jié)果顯示,SiO2@Fe3O4可延長GEM在體內(nèi)的作用時間,并增加GEM在腫瘤組織中的濃度。但關于SiO2@Fe3O4納米材料在體內(nèi)的副反應和毒性仍需后續(xù)實驗進一步驗證。此外,搭載GEM的SiO2@Fe3O4在裸鼠內(nèi)的毒副反應也需進一步實驗明確。本研究中,我們依據(jù)SiO2@Fe3O4復合納米顆粒設計了一種全新的GEM藥物遞送材料,初步證實其在胰腺癌移植瘤裸鼠中發(fā)揮GEM的治療效果的同時,也展示了良好的生物安全性。本研究結(jié)果為后續(xù)胰腺癌的治療提供一定的實驗基礎,也為將來胰腺癌治療的策略提供借鑒。