張 揚(yáng),魏嵐菁,陳軍宏,黑雅婭,薛應(yīng)鈺
(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實(shí)驗(yàn)室,蘭州 730070)
黃瓜Cucumissativus又名胡瓜、青瓜,屬葫蘆科一年生草本植物,作為我國的主要蔬菜作物之一,我國生產(chǎn)規(guī)模位居世界第一。近年來,隨著栽培面積和產(chǎn)量需求逐年增加,土傳病害問題隨之而來[1,2],其中影響較為嚴(yán)重的是由立枯絲核菌Rhizoctoniasolani引起的黃瓜立枯病,嚴(yán)重影響黃瓜幼苗的生長甚至造成植株迅速死亡[3]。被害黃瓜莖基部病斑擴(kuò)大后,產(chǎn)生暗褐色橢圓形病斑,根頸部萎縮干枯,根部縊縮,最后幼苗逐漸枯死,但不呈猝倒伏。地下根部出現(xiàn)橢圓形褐色凹陷斑,死而不倒,根莖皮呈褐色,并逐漸腐爛[4]。目前生產(chǎn)上對該病害的防治主要采用化學(xué)防治措施,雖然效果顯著,但是長期施用容易造成環(huán)境污染,病原菌也容易產(chǎn)生抗藥性[5]。而生物防治因具有安全、高效、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn),被人們所重視和青睞[6],生物防治是未來農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中防治病蟲害的主要方法,也是未來推廣綠色農(nóng)業(yè)的安全保障[7]。目前針對黃瓜立枯病的生防真菌以木霉菌Trichodermaspp.為主[8,9]。生防細(xì)菌有枯草芽胞桿菌Bacillussubtilis、熒光假單胞菌Pseudomonasfluorescens和解淀粉芽胞桿菌Bacillusamyloliquefaciens等[10-12]。但是,有關(guān)放線菌防治黃瓜立枯病方面的研究報道較少。鏈霉菌作為革蘭氏陽性放線菌,能夠有效的防治植物病害和土傳病害,與化學(xué)藥劑相比具有高效低毒等特點(diǎn)[13,14]。近年來國內(nèi)外報道一些放線菌能夠有效防治立枯絲核菌引起的植物病害,如番茄立枯病、辣椒立枯病、玉米紋枯病、水稻紋枯病等[15-17]。顆粒劑是由原藥、載體和輔助劑加工而成的固體顆粒狀劑型農(nóng)藥,具有土壤撒施操作方便、持效期長以及安全性高等特點(diǎn),更適用于土傳病害的防治[18,19]。
婁徹氏鏈霉菌S.rocheiZZ-9 是甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病害生物防治實(shí)驗(yàn)室分離保存的一株具有自主知識產(chǎn)權(quán)的生防菌株(菌種保存號:CGMCC No.15245)。通過前期試驗(yàn)證明,放線菌ZZ-9 菌株對立枯絲核菌R.solani、辣椒葉斑病菌Phaeoramulariacapsicicol、荷蘭豆枯萎病菌Fusariumoxysporum和番茄灰霉病菌Botrytiscinerea等有良好的抑制作用,其中對立枯絲核菌R.solani抑制效果最好。因此,本研究以生防菌株婁徹氏鏈霉菌ZZ-9 菌株為研究對象,以立枯絲核菌為指示菌,篩選不同助劑和載體的最佳配比,確定最佳助劑濃度,對ZZ-9 顆粒劑進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢測,最后利用室內(nèi)盆栽試驗(yàn)測定該菌劑對黃瓜立枯病防治效果和促生作用,以其為黃瓜立枯病的防治提供參考,同時為將其商品化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。
供試生防菌株:婁徹氏鏈霉菌S.rocheiZZ-9;供試病原菌:立枯絲核菌R.solani,以上菌株均由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病害生物防治實(shí)驗(yàn)室提供。
載體:凹凸棒土、膨潤土、高嶺土、硅藻土。
穩(wěn)定劑:碳酸鈣、磷酸鉀、羧甲基纖維素鈉。
崩解劑:三氯化鋁、氯化鎂、尿素、氯化鈉。
粘結(jié)劑:淀粉、聚乙二醇、聚乙烯醇PVA、聚乙烯基吡咯烷酮PVP。
濕潤劑:十二烷基硫酸鈉、木質(zhì)素磺酸鈉、十二烷基苯磺酸鈉。
小米浸汁培養(yǎng)基:小米10.0 g、葡萄糖10.0 g、CaCO32.0 g、NaCl 2.5 g、蛋白胨3.0 g、蒸餾水1000 mL。
馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA):去皮馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂粉15 g,蒸餾水1000 mL
高氏一號培養(yǎng)基:可溶性淀粉20.0 g、KNO31.0 g、K2HPO40.5 g、NaCl 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO40.01 g、瓊脂粉15 g、蒸餾水1000 mL。
黃瓜品種:津優(yōu)35 號(天津科潤農(nóng)業(yè)科技股份有限公司);育苗栽培營養(yǎng)基質(zhì)土(甘肅綠能農(nóng)業(yè)科技股份有限公司出品);50%多菌靈可濕性粉劑(山東省泗水豐田農(nóng)藥有限公司)。
將ZZ-9 菌株在高氏一號培養(yǎng)基上28 ℃活化培養(yǎng)5 d 后,打取3 個5 mm 的菌餅接入裝有80 mL 的高氏一號液體培養(yǎng)基的150 mL 三角瓶中,180 r/min、28 ℃振蕩培養(yǎng)3 d 制成種子液,將種子液按6%接入小米浸汁培養(yǎng)基于180 r/min、28 ℃振蕩培養(yǎng)5 d 即為發(fā)酵液。
不同種類的供試載體按照一定比例(表1)加入6 mL 發(fā)酵液后,觀察制劑顏色及是否成型,將不同種類的制劑各取1 g 加入6 mL 無菌水,在180 r/min 的搖床振蕩30 min,取1 mL 加入到9 mL 無菌水中,采用10 倍梯度稀釋法,均勻涂布于高氏一號培養(yǎng)基上,對照為不加載體的活菌發(fā)酵液。每個處理重復(fù)3 次,28 ℃黑暗培養(yǎng)5 d 后統(tǒng)計ZZ-9 活菌數(shù)。
表1 ZZ-9 生防制劑供試載體Table 1 ZZ-9 biocontrol agent test carrier
將1.1 中不同種類的穩(wěn)定劑、崩解劑、粘結(jié)劑、濕潤劑按照0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%的濃度設(shè)置加入到6 mL 發(fā)酵液,充分震蕩均勻。將含有助劑的發(fā)酵液與PDA 混合均勻(兩者比列為1:9)制成含藥培養(yǎng)基,測定對立枯絲核菌的抑菌效果,以添加不含任何助劑發(fā)酵液的PDA 為對照。28 ℃黑暗培養(yǎng)5d 后計算抑制率。抑制率(%)=(對照病原菌直徑-處理病原菌直徑)/(對照病原菌直徑-5)×100。
將篩選合適的發(fā)酵液與載體比例制成混合物,加入篩選后不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的穩(wěn)定劑、崩解劑,濕潤劑,分散劑,制得ZZ-9 顆粒劑。
1.5.1 活菌數(shù)含量測定 取10 g 制劑置于6 mL 的無菌水錐形瓶中,1200 r/min 的搖床振蕩30 min,稀釋到105倍均勻涂布于高氏一號培養(yǎng)基上,測定ZZ-9 活菌數(shù)含量。
1.5.2 粒度測定 按國家標(biāo)準(zhǔn)“GB/T 15445.5-2011 顆粒劑粒度的測定”為本試驗(yàn)參考標(biāo)準(zhǔn)。選取上下限篩目數(shù)60~200 目篩范圍內(nèi)的雙篩,取10 g(A)的樣品放入篩中后拍打3 min,稱量通過大號篩的樣品(B),B/A 大于90%為合格。
1.5.3 含水率測定 按國家標(biāo)準(zhǔn)“GB/T 1600-2001 顆粒劑水分測定”。用共沸蒸餾法測定,含水率≤5%合格。
1.5.4 崩解性的測定 取0.5 g 試樣加入90 mL 硬水,以每次2 s 的速度顛倒混合,樣品顆粒在硬水中溶解時間小于180 s 為合格。
1.5.5 pH 的測定 按國家標(biāo)準(zhǔn)“GB/T 1601-1993 顆粒劑pH 值的測定”。pH 值在6.0~7.5 之間為合格。
1.5.6 硬度的測定 將10 g 的顆粒制劑,倒入有3 個玻璃珠的瓷制瓶中,以75 r/min 的速度顛倒混合15 min后過篩,稱量通過大號篩的樣品質(zhì)量W(g),計算硬度:硬度(崩壞率%)=W/試樣量×100。
1.5.7 放線菌ZZ-9 顆粒劑熱、冷貯藏性測定 參照GB/T 19136-2003 與GB/T 19137-2003,顆粒劑在(40±2)℃與(0±2)℃條件下水浴24 h 后,通過稀釋涂板法計算抑菌率和活菌數(shù)。
1.5.8 放線菌ZZ-9 顆粒劑雜菌數(shù)的測定 將制備好的顆粒劑置于常溫下,每隔30 d 取樣一次,吸取1 mL稀釋105的制劑,均勻的涂布于高氏一號固體培養(yǎng)基上,5 d 后統(tǒng)計雜菌數(shù)。
1.5.9 放線菌ZZ-9 顆粒劑貨架期測定 將制備好的顆粒劑置于常溫下,每隔30 d 取樣一次,測定其活菌數(shù)。
選取高度相同的黃瓜幼苗,采用撒施法在每盆黃瓜苗根部左右兩側(cè)施入1.0、2.0 和3.0 g ZZ-9 顆粒劑和3.0 g 多菌靈可濕性粉劑。以不施任何菌劑為空白對照。每個處理設(shè)15 盆,重復(fù)3 次。7 d 后用無菌刀割傷黃瓜主根一周的須根,用立枯絲核菌種子液灌根。1 個月后記錄黃瓜立枯病的發(fā)病情況,計算防治效果。
每個花盆(15 cm×15 cm)中栽植3 株黃瓜幼苗,當(dāng)幼苗長出2~4 片葉時,在黃瓜苗根際左右兩側(cè)撒施3 個不同量的菌劑(即1、2 和3 g ZZ-9 顆粒劑/盆);50%多菌靈處理組(3 g/盆)為藥劑對照,未做任何處理為空白對照。每個處理3 次重復(fù),每個重復(fù)15 株苗。30 d 后測定株高、根長、鮮重。
不同的載體對ZZ-9 活菌數(shù)的影響不同(表2),其中高嶺土與硅藻土對ZZ-9 活菌數(shù)的影響明顯高于凹凸棒土,且制劑酥軟,難成型,膨潤土對ZZ-9 活菌數(shù)的影響與對照相比,達(dá)到差異顯著性水平,但是制劑硬,難成型。而凹凸棒土對ZZ-9 活菌數(shù)基本影響不大,高于對照,且當(dāng)菌液與凹凸棒土的比例是2∶5時,制劑呈制劑呈磚紅色固體,易造粒。因此,選用凹凸棒土作為ZZ-9 顆粒劑的載體。
表2 供試載體對放線菌ZZ-9 生長的影響及混合固態(tài)觀察Table 2 The effect of the test carrier for the growth of the actinomycete ZZ-9 and observation of mixed solid state
2.2.1 穩(wěn)定劑對ZZ-9 抑菌活性的影響 由圖1 可知,不同濃度的3 種穩(wěn)定劑均對ZZ-9 殺病原菌活性有一定影響。其中不同濃度的磷酸鉀和羧甲基纖維素鈉不同程度的降低了ZZ-9 的抑菌活性。而當(dāng)碳酸鈣濃度為1%時抑菌率達(dá)到了83.71%。同對照相比增強(qiáng)了ZZ-9 的抑菌活性。且碳酸鈣化學(xué)純度高、惰性強(qiáng),有較好的熱穩(wěn)定性[20],因此選1%的碳酸鈣為ZZ-9 顆粒劑的穩(wěn)定劑。
圖1 不同濃度及類型穩(wěn)定劑對ZZ-9 抑菌活性的影響Fig.1 Effect of different concentrations and types of stabilizers on strain ZZ-9 antimicrobial activity
2.2.2 崩解劑對ZZ-9 抑菌活性的影響 通過圖2 可得知,不同濃度的4 種崩解劑對ZZ-9 的抑菌活性有一定的影響,其中不同濃度的三氯化鋁、尿素與氯化鈉對ZZ-9 抑菌活性抑制較為明顯且均低于對照。而當(dāng)加入2%的氯化鎂時,ZZ-9 的抑菌率高于對照為81%。因此,選用2%的氯化鎂為ZZ-9 顆粒劑的崩解劑。
圖2 不同濃度及類型崩解劑對ZZ-9 抑菌活性的影響Fig.2 Effect of different concentrations and types of disintegrants on strain ZZ-9 antimicrobial activity
2.2.3 黏結(jié)劑對ZZ-9 抑菌活性的影響 由圖3 可知,不同濃度的4 種粘結(jié)劑對ZZ-9 的抑菌效果均有一定的影響,其中加入不同濃度淀粉、聚乙二醇和PVP 時,抑菌率均顯著低于對照。加入不同濃度的PVA,ZZ-9 的抑菌率呈先增大后減小的趨勢,PVA 濃度為1%時ZZ-9 的抑菌率高于對照,為83.00%。說明PVA與ZZ-9 的生物相容性較好。此外,PVA 穩(wěn)定性好、成本低、具有良好的水溶性能且對藥物影響較小。因此,選用1%的PVA 為ZZ-9 顆粒劑的粘結(jié)劑。
2.2.4 濕潤劑對ZZ-9 抑菌活性的影響 通過圖4 可得知,不同濃度的3 種濕潤劑均對ZZ-9 抑菌效果有一定影響。隨著濕潤劑濃度的增加,ZZ-9 的抑菌率不斷降低,其中不同濃度的木質(zhì)素磺酸鈉和十二烷基硫酸鈉對ZZ-9 抑菌活性影響最為顯著均低于對照。但添加0.5%的十二烷基苯磺酸鈉時,與對照相比,ZZ-9 抑菌活性增強(qiáng)為82.33%。因此,選用0.5%的十二烷基苯磺酸鈉為ZZ-9 顆粒劑的濕潤劑。
圖4 不同濃度及類型濕潤劑對ZZ-9 抑菌活性的影響Fig.4 Effect of different concentrations and types of wetting agents on strain ZZ-9 antimicrobial activity
通過對載體與助劑的篩選,確定了ZZ-9 顆粒劑最佳配方為:菌液與凹凸棒土比例為2:5,碳酸鈣1%,氯化鎂2%,聚乙烯醇1%,十二烷基苯磺酸鈉0.5%。按照此配方研制出了一種磚紅色固體狀,易造粒,崩解性好,硬度適中的婁徹氏鏈霉菌ZZ-9 顆粒劑。
放線菌ZZ-9 顆粒劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)測定結(jié)果(表3)表明,活菌數(shù)為 1.19×108cfu/g,粒度、含水率、崩解性、pH 值、硬度5 項(xiàng)指標(biāo)均符合農(nóng)藥顆粒劑的國家標(biāo)準(zhǔn),說明該菌劑合格,可以用于病害的防治。
表3 ZZ-9 顆粒劑質(zhì)量檢測結(jié)果Table 3 Quality test results of ZZ-9 granules
通過對放線菌ZZ-9 顆粒劑進(jìn)行冷、熱貯藏性測定,結(jié)果表明(表4),經(jīng)冷、熱處理后,活菌數(shù)分別為1.02×108cfu/g、1.11×108cfu/g,接近于對照。其ZZ-9 顆粒劑對立枯絲核菌抑菌率分別為82.14%、83.33 %,與對照相比,分別低1.79%、0.6%。ZZ-9 顆粒劑有較好的冷、熱儲藏性,可在田間極端天氣下保持穩(wěn)定。
表4 冷、熱處理對ZZ-9 顆粒劑活菌數(shù)與抑菌活性的影響Table 4 Effect of cold and heat treatment on the colony count and antibacterial activity of ZZ-9 granules
通過不同時間對ZZ-9 顆粒劑雜菌數(shù)測定(表5),結(jié)果表明,隨著時間的增長,ZZ-9 顆粒劑的雜菌數(shù)基本保持穩(wěn)定,均低于0.30×106cfu/g。說明,ZZ-9 顆粒劑可以防止外界雜菌污染。
表5 ZZ-9 顆粒劑雜菌數(shù)的測定Table 5 Determination of the number of bacteria in ZZ-9 granules
通過對放線菌ZZ-9 顆粒劑進(jìn)行貨架期測定結(jié)果表明,0~120 d 中ZZ-9 顆粒劑活菌數(shù)基本保持不變,均高于1×108cfu/g,表明ZZ-9 顆粒劑在一定時間內(nèi)能保持較好的穩(wěn)定性(表6)。
表6 ZZ-9 顆粒劑貨架期測定Table 6 Determination of shelf life of ZZ-9 granules
菌劑對黃瓜立枯病的防治效果如表7 所示,1 個月后,對照組的黃瓜發(fā)病率最高86.67%,施用量ZZ-9顆粒劑處理的黃瓜大部分仍健康生長;不同的菌劑施用量對黃瓜立枯病都有較好的防治效果,其中ZZ-9顆粒劑施用量為3 g/盆時發(fā)病率在20.00%,防治效果最佳達(dá)到76.92%。
表7 不同量的ZZ-9 顆粒劑對黃瓜立枯病的防治效果Table 7 The effect of different amounts of ZZ-9 granules on cucumber Rhizoctonia rot
由表8 可知放線菌ZZ-9 顆粒劑對黃瓜具有明顯的促生作用,放線菌ZZ-9 顆粒劑在3 種不同處理下,種子發(fā)芽率,株高,根長以及鮮重均高于空白對照組,放線菌ZZ-9 顆粒劑施用量為3 g/盆時,種子發(fā)芽率從82.64%提高到90.36%,發(fā)芽率、株高、根長和鮮重分別較對照提高了9.34%、29.52%、27.54%、22.96%,促生作用與化學(xué)藥劑的多菌靈制劑相當(dāng)。
表8 ZZ-9 顆粒劑對黃瓜的形態(tài)學(xué)指標(biāo)的影響Table 8 Effect of ZZ-9 granules on morphological indicators of cucumbers
我國現(xiàn)有的農(nóng)用微生物殺菌劑劑型種類較為單一,主要為可濕性粉劑,對顆粒劑的研究開發(fā)較弱[21]。而顆粒劑具有持效期長、用量少、使用方便、易貯存和使用時無粉塵飄移等優(yōu)點(diǎn)。且顆粒劑組分中的載體、助劑能夠直接或間接地影響菌體活性[22]。因此尋找性能優(yōu)良,價格低廉,來源廣泛并使制劑有良好的生物相容性的載體材料是顆粒劑發(fā)展的重要方向[23]。本研究對不同的載體、助劑進(jìn)行初步篩選和配方優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)生防菌ZZ-9 顆粒劑最佳配方為:碳酸鈣(穩(wěn)定劑)1%,氯化鎂(崩解劑)2%,聚乙烯醇(PVA,粘結(jié)劑)1%,十二烷基苯磺酸鈉(濕潤劑)0.5%,菌液與凹凸棒土(載體)比例為2:5。鄭婷婷等[24]研究發(fā)現(xiàn),生防菌Ht-q6 乳懸劑的最佳潤濕劑為十二烷基硫酸鈉,穩(wěn)定劑為KH2PO4,這與本試驗(yàn)結(jié)果類似。耿琦等[25]研究發(fā)現(xiàn),淡紫灰鏈霉菌S3-5 的生防制劑,最佳穩(wěn)定劑為2.5%甲基纖維素,李鴻坤等[26]研究發(fā)現(xiàn)放線菌菌株HJG-5 生防劑型最佳載體為高領(lǐng)土。這與本試驗(yàn)所用的碳酸鈣、凹凸棒土結(jié)果存在差異,可能是因?yàn)椴煌觊g的差異性,同種助劑對不同菌株具有不同影響。微生物菌劑的貯存穩(wěn)定性直接影響產(chǎn)品質(zhì)量與應(yīng)用效果,選擇合適的載體和添加保護(hù)劑能夠有效提高微生物菌劑的貯存穩(wěn)定性[27]。對貯存穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn)ZZ-9 顆粒劑有較好的冷、熱儲藏性,0~120 d 的貯藏期間雜菌數(shù)基本保持穩(wěn)定并且活菌數(shù)基本保持不變。本研究對ZZ-9 顆粒劑主要性能檢測有效活菌數(shù)為1.19×108cfu/g,粒度為93.5%,水分含量2.5%,水中崩解時間96 s,pH 值6.35,硬度為10%。這些指標(biāo)在進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)中至關(guān)重要[28]。
放線菌作為一種重要的微生物資源能夠產(chǎn)生豐富的代謝產(chǎn)物抑制病原菌,誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性,增強(qiáng)植物的抗病性,在植物病害生物防治中有良好應(yīng)用前景[29]。關(guān)于婁徹氏鏈霉菌防治植物病害相關(guān)研究表明,利用婁徹氏鏈霉菌A-1 處理蘋果果實(shí)同對照相比能夠有效的降低蘋果輪紋病病斑面積和發(fā)病率[30]。婁徹氏鏈霉菌ACTA1551 能夠保護(hù)番茄種子免受尖孢鐮刀菌的侵染,促進(jìn)番茄植株的生長[31]。婁徹氏鏈霉菌發(fā)酵濾液對水稻稻瘟病和茄子青枯病具有良好的防治效果,并且對茄子幼苗具有明顯的促生作用[32,33]。該菌株ZZ-9 研究鑒定為婁徹氏鏈霉菌,其次生代謝產(chǎn)物有較強(qiáng)的穩(wěn)定性和廣譜的抑菌活性,發(fā)酵濾液對小麥幼苗具有促生作用[34-36]。牛鑫斌等[37]研究報道利用長枝木霉T6 水分散粒劑防治黃瓜立枯病,其防治效果達(dá)到54.8%,與化學(xué)農(nóng)藥多菌靈相比,相對防治效果提高了14.8%。黃大野等[38]研究報道利用枯草芽胞桿菌水分散粒劑防治黃瓜立枯病,其防效為71.48%,發(fā)芽率、株高、根長和鮮重分別較對照有明顯提高。本研究在室內(nèi)盆栽防效試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)菌株ZZ-9 顆粒劑不同的施用量對黃瓜立枯病都有較好的防治效果且對黃瓜具有明顯的促生作用。其中施用量3 g/盆時防治效果最佳達(dá)到76.92%,而施用量為3 g/盆多菌靈制劑防治效果達(dá)到92.31%,顯著低于藥劑對照。發(fā)芽率、株高、根長和鮮重分別較對照提高了9.34%、29.52%、27.54%、22.96%,促生作用與化學(xué)藥劑的多菌靈制劑相當(dāng)。可見婁徹氏鏈霉菌ZZ-9 顆粒劑成為微生物農(nóng)藥具有巨大的潛力,但大田防治試驗(yàn)是否具有高效的防治效果和促生作用還需要更進(jìn)一步的研究。