趙衛(wèi)松，李社增*，趙明珠，郭慶港，鹿秀云，勾建軍，馬 平

（1.河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所/河北省農(nóng)業(yè)有害生物綜合防治工程技術(shù)研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北北部作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，保定 071000；2.河北省植保植檢總站，石家莊 050031）

棉花黃萎?。╟otton verticillium wilt）是由大麗輪枝菌VerticilliumdahliaeKleb.引起的土傳病害。由于該病原菌能夠以微菌核形式在土壤中長(zhǎng)期存活達(dá)20 年之久，以及病原菌致病力分化多樣，導(dǎo)致強(qiáng)致病力菌株上升為優(yōu)勢(shì)菌群，加之棉花品種抗病性存在不穩(wěn)定的情況，生產(chǎn)上難以對(duì)其進(jìn)行有效防治[1-3]。同時(shí)，在生產(chǎn)上棉花種植單一（尤其是在冀南植棉區(qū)），缺乏有效的輪作栽培模式，致使棉花黃萎病發(fā)展蔓延速度較快，嚴(yán)重影響了棉花的產(chǎn)量和品質(zhì)。因此，針對(duì)性地開(kāi)展棉花黃萎病的防治已成為生產(chǎn)上的迫切需求。

利用植物輪作及其殘?bào)w還田是有效防治作物土傳病害的途徑之一[4,5]。已有研究表明，土壤添加西蘭花殘?bào)w能夠有效降低大麗輪枝菌數(shù)量并延緩病原菌的侵染過(guò)程[6,7]、釋放具有抑菌功能的次生代謝物質(zhì)[8]、改變土壤微生物多樣性和增加土壤中有益微生物菌群豐度[9-12]，最終有效降低作物黃萎病的發(fā)生。然而，西蘭花種植受耕作制度的制約，其直接還田受到限制。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018 年我國(guó)蔬菜總產(chǎn)量8.17 億噸，其產(chǎn)生的尾菜（新鮮蔬菜去掉的殘葉，俗稱為爛菜葉子）約占蔬菜總產(chǎn)量的51%，其在堆積腐爛過(guò)程中造成了環(huán)境的污染，為病菌和病蟲(chóng)害提供了繁衍生息的場(chǎng)所，直接對(duì)下茬和來(lái)年的蔬菜產(chǎn)量和品質(zhì)造成影響。

利用活體微生物菌劑是有效防治作物土傳病害的措施之一，但傳統(tǒng)微生物菌劑防治作物土傳病害效果不穩(wěn)定成為限制其廣泛應(yīng)用的瓶頸問(wèn)題之一。將微生物菌劑與植物殘?bào)w聯(lián)合施用不僅能促進(jìn)作物生長(zhǎng)，而且能提高防病效果[11]。因此，以西蘭花尾菜為填料的新型微生物菌劑創(chuàng)制是棉花土傳病害綠色防控發(fā)展的重要措施。芽胞桿菌Bacillusspp.作為重要的生防資源，具有廣闊的應(yīng)用前景。解淀粉芽胞桿菌Bacillus amyloliquefaciensPHODG36 是河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病害生物防治實(shí)驗(yàn)室篩選到的對(duì)土傳病害具有很好防治效果的生防菌株，該菌株已獲得國(guó)家發(fā)明專利（專利號(hào)：ZL 201610876803.2），且以該菌株為有效成分研制的微生物菌劑對(duì)馬鈴薯黃萎病和瘡痂病具有很好的防治效果[13,14]。因此，本研究以西蘭花尾菜干粉為主要載體、菌株P(guān)HODG36 為有效成分，研制出微生物顆粒劑。對(duì)該菌劑在棉花上的應(yīng)用安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)，并初步探索該菌劑用于防治棉花黃萎病的田間使用技術(shù)，為進(jìn)一步推廣應(yīng)用該顆粒劑防控棉花黃萎病、制定田間使用技術(shù)規(guī)程提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株解淀粉芽胞桿菌BacillusamyloliquefaciensPHODG36，現(xiàn)保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.13041；病原菌為大麗輪枝菌VerticilliumdahliaeWX-1，由河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病害生物防治實(shí)驗(yàn)室分離、純化保存。供試作物為棉花，品種鄂荊1 號(hào)，屬于感黃萎病棉花品種，用于溫室盆栽試驗(yàn)；農(nóng)大棉36 號(hào)，屬于耐黃萎病棉花品種，用于田間小區(qū)試驗(yàn)。培養(yǎng)基質(zhì)：從河北省保定市高陽(yáng)縣連續(xù)多年種植棉花地塊，收集耕作層土壤，與泥炭土有機(jī)基質(zhì)按照2:1 比例充分混勻，用于溫室盆栽試驗(yàn)。

1.2 菌株活化與種子液制備

將-40 ℃保存的PHODG36 菌株轉(zhuǎn)接于LB 平板培養(yǎng)基上，并在（30±1）℃下過(guò)夜培養(yǎng)，然后分別挑取單菌落接種于LB 斜面培養(yǎng)基上，并在上述條件下培養(yǎng)，之后用無(wú)菌水洗滌培養(yǎng)基表面，其菌懸液即為種子液（OD600=1.5）；按照體積百分比0.5%向LB 液體培養(yǎng)基中接入種子液，（30±1）℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h，得到的培養(yǎng)液作為制備微生物顆粒劑的PHOG36 菌株發(fā)酵液。

1.3 西蘭花尾菜的收集及其加工

西蘭花收獲后，收集其剩余的植物組織（包括葉片和根），在自然條件下晾曬、風(fēng)干，之后采用萬(wàn)能粉碎機(jī)（型號(hào)WF-20B，江陰市江拓機(jī)械設(shè)備有限公司）對(duì)收集的干物質(zhì)進(jìn)行粉碎，得到初步干物質(zhì)粉末，進(jìn)一步利用電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（型號(hào)DHG-9243BS-III，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）烘干，通過(guò)球磨粉碎機(jī)（型號(hào)JCWF-100B，濟(jì)南駿程機(jī)械設(shè)備有限公司）進(jìn)行粉碎。通過(guò)圓形驗(yàn)粉篩（型號(hào)YYFS30，杭州大吉光電儀器有限公司）根據(jù)剩余在篩上的樣品量計(jì)算出粉碎細(xì)度[15]。

1.4 微生物顆粒劑的加工工藝

將上述制備的西蘭花尾菜干粉與草炭粉末（細(xì)度為300 目）按照1:0.3 比例（w/w）在SYH 三維混合機(jī)（上海塵鑫粉體設(shè)備有限公司）中充分混合均勻作為制備菌劑的填料。在攪拌狀態(tài)下，分批、多次加入PHODG36 菌株發(fā)酵液，直至手握成團(tuán)、不松散（填料:發(fā)酵液為1:0.8，w/v），然后將其加入至臥室造粒機(jī)進(jìn)行顆粒劑的制備，制備的微生物菌劑顆粒在通風(fēng)干燥條件下風(fēng)干。利用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定顆粒劑的芽胞含量。

1.5 溫室盆栽評(píng)價(jià)微生物顆粒劑對(duì)棉花生長(zhǎng)的安全性評(píng)價(jià)及促生作用

挑選均勻一致的供試棉花種子，先用75%的乙醇處理3 min，再用1%（v/v）的次氯酸鈉消毒10 min，無(wú)菌水沖洗3 次，然后播種于含有顆粒劑不同濃度的花盆中（高14 cm、盆口直徑17 cm、盆底直徑12 cm，1 kg 基質(zhì)/盆），每個(gè)花盆播種10 粒種子，作為1 個(gè)處理，每個(gè)處理3 次重復(fù)。試驗(yàn)設(shè)置6 個(gè)處理。處理1，培養(yǎng)基質(zhì)中不添加顆粒劑處理，為空白對(duì)照；處理2，培養(yǎng)基質(zhì)中添加顆粒劑質(zhì)量濃度0.1%；處理3，培養(yǎng)基質(zhì)中添加顆粒劑質(zhì)量濃度0.3%；處理4，培養(yǎng)基質(zhì)中添加顆粒劑質(zhì)量濃度0.5%；處理5，培養(yǎng)基質(zhì)中添加顆粒劑質(zhì)量濃度1.0%；處理6，培養(yǎng)基質(zhì)中添加顆粒劑質(zhì)量濃度2.0%。試驗(yàn)期間加強(qiáng)棉花蟲(chóng)害管理，適時(shí)補(bǔ)充水分，每次200 mL/盆。播種15 d 后，調(diào)查不同處理的出苗情況，計(jì)算校正出苗率[7]；播種后50 和70 d 調(diào)查植株株高。播種70 d 后調(diào)查棉花植株鮮重和干重。

1.6 溫室盆栽評(píng)價(jià)微生物顆粒劑對(duì)棉花黃萎病的防治效果

在1.5 明確菌劑適宜用量的基礎(chǔ)上，通過(guò)溫室試驗(yàn)評(píng)價(jià)菌劑對(duì)棉花黃萎病防治效果。按照趙衛(wèi)松等[7]方法進(jìn)行大麗輪枝菌孢子懸浮液的制備，將培養(yǎng)好的大麗輪枝菌分生孢子懸浮液與培養(yǎng)基質(zhì)混合，制成分生孢子含量為106CFU/g 的基質(zhì)。將顆粒劑與培養(yǎng)基質(zhì)按照0.3:100（w/w）的比例混勻，然后將準(zhǔn)備好的種子按照1.5 方法播種于花盆中，以不加顆粒劑的處理作為空白對(duì)照。試驗(yàn)期間加強(qiáng)棉花蟲(chóng)害管理，適時(shí)補(bǔ)充水分。播種70 d 后，參考李社增等[16]方法調(diào)查棉花黃萎病發(fā)生情況、計(jì)算病情指數(shù)和防病效果。

1.7 田間試驗(yàn)評(píng)價(jià)微生物顆粒劑對(duì)棉花黃萎病的防治效果

2022 年5—9 月在河北省保定市高陽(yáng)縣北于八村棉花黃萎病人工病圃進(jìn)行田間試驗(yàn)，評(píng)價(jià)微生物顆粒劑對(duì)棉花黃萎病的防治效果。試驗(yàn)田土壤均為壤土，地勢(shì)平整，水肥條件較好。播種前撒施微生物顆粒劑，試驗(yàn)設(shè)置4 個(gè)用量處理，分別為0、500、1000、1500 kg/667 m2，撒施后通過(guò)旋耕機(jī)整地，深翻20～25 cm，之后播種棉花（品種為農(nóng)大棉36）。每個(gè)處理面積300 m2（長(zhǎng)20 m，寬15 m），行距75 cm，株距35 cm，每個(gè)處理3 次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)以隨機(jī)選擇1 m 行長(zhǎng)的出苗總數(shù)進(jìn)行調(diào)查評(píng)價(jià)出苗情況（5 月20 日），在花鈴期調(diào)查棉花黃萎病的發(fā)生情況（8 月17 日），按照1.6 方法計(jì)算病情指數(shù)和防病效果，評(píng)價(jià)微生物顆粒劑對(duì)棉花黃萎病的防治效果。

1.8 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)

利用SPSS17.0 軟件，采用獨(dú)立樣本T 檢驗(yàn)對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和Origin 8.0 進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 西蘭花尾菜干粉的制備工藝

研究結(jié)果表明，B30 萬(wàn)能粉碎吸塵機(jī)粉碎速度為30 kg/h，得到的初步粉狀干物質(zhì)的細(xì)度100%通過(guò)40目，進(jìn)一步烘干并通過(guò)球磨粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，粉碎時(shí)間15 min，其粉碎細(xì)度95%以上的干粉≥80 目，滿足了本試驗(yàn)要求。

2.2 微生物顆粒劑的基本性狀

將西蘭花尾菜干粉與草炭制備的填料在攪拌狀態(tài)下分批加入PHODG36 菌株發(fā)酵液，直至手握成團(tuán)、不松散，確定填料:發(fā)酵液為1:0.8（w/v），制備的顆粒劑經(jīng)陰涼風(fēng)干后，外觀為黑色、短柱狀，平均直徑為2 mm，長(zhǎng)度為8 mm，含水量為4.8%，芽胞含量為1.5×109CFU/g。

2.3 解淀粉芽胞桿菌PHODG36 顆粒劑用量對(duì)棉花出苗的影響

溫室盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng)基質(zhì)中添加不同用量的顆粒劑處理對(duì)棉花出苗表現(xiàn)出不同程度的影響（圖1）。顆粒劑用量0.1%、0.3%、0.5%、1.0%和2.0%處理的校正出苗率分別為100%、103.23%、93.55%、90.32%和80.65%，單因素方差分析表明，低用量（0.1%和0.3%）的顆粒劑處理出苗率與空白對(duì)照處理差異不顯著，而隨著用量增加（0.5%～2%），出苗率呈顯著下降趨勢(shì)。該結(jié)果表明解淀粉芽胞桿菌PHODG36 顆粒劑的在棉花上適宜用量范圍為0.1%～0.3%。

圖1 不同粒徑的西蘭花尾菜干粉Fig.1 Different particle sizes of dried broccoli residues powder

圖2 基于西蘭花尾菜為載體的解淀粉芽胞桿菌PHODG36顆粒劑的形態(tài)Fig.2 Morphology of B.amyloliquefaciens PHODG36 granules based on broccoli residues as carrier

圖3 解淀粉芽胞桿菌PHODG36 顆粒劑不同用量對(duì)棉花出苗的影響Fig.3 Effect of different dosages of B.amyloliquefaciens PHODG36 granules on cotton emergence

2.4 解淀粉芽胞桿菌PHODG36 顆粒劑不同用量對(duì)棉花植株株高的影響

溫室盆栽試驗(yàn)評(píng)價(jià)了顆粒劑不同用量對(duì)棉花植株株高的影響。結(jié)果表明，顆粒劑的使用對(duì)棉花植株株高表現(xiàn)不同程度的促生作用。在培養(yǎng)50 d 時(shí)，在研究濃度范圍內(nèi)，不同用量對(duì)株高的促生率分別為-3.88%、14.53%、3.27%、7.74%和27.42%，其中0.3%和2%處理顯著提高了棉花植株株高（圖4）。在培養(yǎng)70 d時(shí)，不同用量對(duì)株高的促生率分別為-6.46%、5.90%、21.49%、11.88%和27.35%，其中0.5%和2%處理顯著提高了棉花株高（圖4）。

圖4 解淀粉芽胞桿菌PHODG36 顆粒劑不同用量對(duì)棉花株高的影響Fig.4 Effect of different dosages of B.amyloliquefaciens PHODG36 granules on plant height

圖5 解淀粉芽胞桿菌PHODG36 顆粒劑不同用量對(duì)棉花生物量的影響Fig.5 Effect of different dosages of B.amyloliquefaciens PHODG36 granules on plant biomass

2.5 解淀粉芽胞桿菌PHODG36 顆粒劑不同用量對(duì)棉花生物量的影響

以植株鮮重和干重為評(píng)價(jià)指標(biāo)，系統(tǒng)研究了顆粒劑不同用量對(duì)棉花植株生物量的影響。結(jié)果表明，在鮮重方面，顆粒劑不同用量對(duì)其促生率分別為-4.44%、16.38%、6.15%、-6.87%和67.03%；在干重方面，顆粒劑不同用量對(duì)其促生率分別為-12.98%、17.05%、-0.05%、-3.57%和90.99%。顯著性差異分析表明，除了2%菌劑用量顯著提高了植株鮮重和干重外，其他菌劑使用量處理后植株的鮮重和干重，與空白對(duì)照差異不顯著。

2.6 溫室盆栽評(píng)價(jià)解淀粉芽胞桿菌PHODG36 顆粒劑對(duì)棉花黃萎病防治效果

研究了培養(yǎng)基質(zhì)中添加解淀粉芽胞桿菌PHODG36 顆粒劑（比例為0.3%）與未添加菌劑處理（空白對(duì)照）的黃萎病發(fā)生情況。結(jié)果表明，空白對(duì)照的病情指數(shù)為34.72，添加解淀粉芽胞桿菌PHODG36 顆粒劑處理后的病情指數(shù)為13.33，對(duì)棉花黃萎病的防治效果為61.60%（表1）。

表1 解淀粉芽胞桿菌PHODG36 顆粒劑對(duì)棉花黃萎病的盆栽防治效果Table 1 Control effect of B.amyloliquefaciens PHODG36 granules on verticillium wilt of cotton in pot experiment

2.7 田間小區(qū)試驗(yàn)評(píng)價(jià)

田間試驗(yàn)結(jié)果表明，在研究濃度范圍內(nèi)解淀粉芽胞桿菌PHODG36 顆粒劑對(duì)棉花出苗不存在影響（數(shù)據(jù)未列出）。在黃萎病方面，空白對(duì)照處理發(fā)病最重，病情指數(shù)為51.14；解淀粉芽胞桿菌PHODG36顆粒劑500 kg/667 m2處理的發(fā)病最輕，病情指數(shù)為16.71；解淀粉芽胞桿菌PHODG36 顆粒劑1000 kg/667 m2處理的發(fā)病病情指數(shù)為30.96；解淀粉芽胞桿菌PHODG36 顆粒劑1500 kg/667 m2處理的發(fā)病病情指數(shù)為34.63。解淀粉芽胞桿菌PHODG36 顆粒劑500 kg/667 m2對(duì)棉花黃萎病的防治效果最佳，防治效果為67.28%。

3 討論

化學(xué)肥料和化學(xué)農(nóng)藥是保障糧食增產(chǎn)的重要因素，長(zhǎng)期以來(lái)過(guò)量施用化學(xué)肥料和化學(xué)農(nóng)藥帶來(lái)的負(fù)面影響，與我國(guó)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略相違背[17]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究表明，通過(guò)微生物的防病功能和肥效功能為農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供了物質(zhì)基礎(chǔ)和技術(shù)支撐，而得到廣泛的關(guān)注[18]。利用生防微生物能夠有效預(yù)防和控制植物病害的發(fā)生，其具有資源豐富、環(huán)保安全和不易產(chǎn)生抗性的特點(diǎn)。目前，芽胞桿菌Bacillusspp.用于防治棉花黃萎病開(kāi)展了大量的研究，如李社增等[16]田間小區(qū)試驗(yàn)表明枯草芽胞桿菌B.subtilisNCD-2 對(duì)棉花黃萎病的平均防效為85.4%；Zabihullah 等[19]通過(guò)溫室盆栽表明分離到的解淀粉芽胞桿菌B.amyloliquefaciens對(duì)棉花黃萎病的平均防效為60.31%；白紅燕等[20]溫室試驗(yàn)研究表明貝萊斯芽胞桿菌B.velezensisEBV02對(duì)棉花黃萎病的最高防效為68.33%，而田間防效為37.25%。周京龍等[21]盆栽試驗(yàn)表明蠟狀芽胞桿菌B.cereusYUPP-10 對(duì)棉花黃萎病的最高防效達(dá)到80.60%。

目前，微生物菌劑固著載體材料主要為有機(jī)高分子材料，包括天然高分子載體和合成高分子載體，但其制備步驟復(fù)雜，成本較高，載體機(jī)械強(qiáng)度較差，存在一定的生物毒性[22,23]。利用農(nóng)業(yè)廢棄物生產(chǎn)的有機(jī)肥作為微生物菌劑的載體已有研究報(bào)道[24]。已有證據(jù)研究表明，農(nóng)作物殘?bào)w中的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，是聚合在一起的多糖分子鏈，其能夠形成“氮化合物和芳香族化合物的縮聚物”的特點(diǎn)，具有一定的生理活性，其自身富含植物生長(zhǎng)所需的氨基酸等營(yíng)養(yǎng)成分，能夠被植物吸收利用，可改善農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量和品質(zhì)。將微生物菌劑與植物殘?bào)w聯(lián)合施用不僅能促進(jìn)作物生長(zhǎng)，而且能提高防病效果[11]。目前，已有報(bào)道將植物殘?bào)w簡(jiǎn)單腐熟后直接利用，而沒(méi)有開(kāi)展進(jìn)一步深加工的研究。因此，開(kāi)發(fā)基于植物殘?bào)w干粉的微生物農(nóng)藥或菌劑研制是一個(gè)前景廣闊的發(fā)展方向，有助于農(nóng)業(yè)綠色高質(zhì)量發(fā)展。范騰飛等[25]首次將植物孢粉作為載體加入農(nóng)藥控制釋放系統(tǒng)中，開(kāi)發(fā)了一種新型的綠色高效農(nóng)藥。本研究首次將西蘭花尾菜干粉和草炭為載體，以解淀粉芽胞桿菌B.amyloliquefaciens為活性成分研制的微生物顆粒劑，在溫室條件下培養(yǎng)基質(zhì)中添加顆粒劑（用量比例為0.3%）對(duì)棉花出苗率不存在顯著影響，且對(duì)黃萎病的平均防效為61.6%。李艷等[26]溫室試驗(yàn)表明施用球毛殼菌ChaetomiumglobosumCEF-082 菌劑的最適宜用量為0.5%，該濃度對(duì)棉花黃萎病的防效為43.08%。趙沛等[27]研究結(jié)果表明腐皮鐮孢菌FusariumsolaniCEF373 固體菌劑按照質(zhì)量濃度3%拌土后，對(duì)棉花黃萎病的溫室防效為62.74%。蒲丹丹等[28]田間試驗(yàn)表明，簡(jiǎn)青霉Penicillium simplicissimumCEF-818 菌劑對(duì)棉花黃萎病的防效為63.73%。本研究田間試驗(yàn)結(jié)果表明，PHODG36 菌劑不同用量處理后均降低了黃萎病的發(fā)生，其中菌劑用量為500 kg/667 m2對(duì)棉花黃萎病的防效為67.3%，隨著用量的增加并不能夠提高病害防治效果。因此，綜合考慮使用成本因素，明確顆粒劑用量為500 kg/667 m2。

綜合分析表明，本研究研制的解淀粉芽胞桿菌顆粒劑在棉花上表現(xiàn)出較好的防病效果，但在推廣應(yīng)用過(guò)程中應(yīng)綜合考慮外界環(huán)境因素、防治對(duì)象的發(fā)病規(guī)律、棉花品種特性、土壤類型，尤其是微生物菌劑的使用成本及其可操作性等因素，從而開(kāi)發(fā)出簡(jiǎn)單實(shí)用的田間應(yīng)用技術(shù)。此外，該菌劑使用后是否改變了棉花根系分泌物的組成和含量，從而影響了土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和棉花抵御病原菌侵染的能力尚需進(jìn)一步研究。