潘 凡,朱凱輝,涂雄兵,張澤華
(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室,北京 100193)
苜蓿斑蚜TherioaphistrifoliiMonel 作為紫花苜蓿MedicagosativaL.的主要害蟲之一,具有世代重疊、繁殖速度快、對環(huán)境適應(yīng)性強等特點[1,2]。其通過口器刺吸汁液,不僅可造成苜蓿發(fā)育不良,而且會傳播大量的植物病毒,其唾液對植物的防御反應(yīng)還會起到抑制作用[3]。苜蓿斑蚜的防治一直依賴于化學(xué)農(nóng)藥,但是長期使用化學(xué)農(nóng)藥帶來的環(huán)境污染、抗藥性等問題也不容忽視[4,5]。相較于化學(xué)農(nóng)藥,生物農(nóng)藥具有低毒、無污染、對非靶標(biāo)生物安全等特點,生物農(nóng)藥的開發(fā)和利用逐漸在害蟲防治領(lǐng)域中起到了不可替代的作用[6,7]。因此,篩選對苜蓿斑蚜起控制作用的生物農(nóng)藥對苜蓿斑蚜的防控具有重要意義。
植物源殺蟲劑作為生物農(nóng)藥的重要一類,可通過植物化學(xué)信號引誘、忌避、毒殺、拒食等方式起作用[8,9]。十字花科植物作為小菜蛾P(guān)lutellaxylostellaL.的主要寄主,被小菜蛾為害后,其釋放的揮發(fā)物可引誘菜粉蝶絨繭蜂Apantelesglomeratus[10]。從黃杜鵑花Rhododendronmolle中分離出來的四環(huán)二萜化合物對甜菜夜蛾Amaranthusmangostanus、馬鈴薯甲蟲Leptinotarsadecemlineata等具有強烈的拒食、毒殺及生長發(fā)育抑制作用[11]。苯并噁嗪類化合物是一類廣泛存在于禾本科植物中的次生代謝產(chǎn)物,與植物抗蟲性密切相關(guān)。該類物質(zhì)以丁布為代表,目前關(guān)于丁布抗蟲活性的研究主要集中于歐洲玉米螟OstrinianubilalisHübner、玉米蚜RhopalosiphummaidisFitch、禾谷縊管蚜RhopalosiphumpadiL.、麥無網(wǎng)蚜Metopolophium dirhodumWalker、麥長管蚜SitobionavenaeF.等[12]。許多文獻(xiàn)表明,丁布對昆蟲具有拒食效應(yīng),通過影響昆蟲體內(nèi)酶的活性對昆蟲生長造成影響。對蚜蟲中腸消化酶的研究表明,蚜蟲體內(nèi)的氨肽酶(APs)、胰蛋白酶(Tr)、胰凝乳蛋白酶(CTP)為主要的消化酶。
據(jù)測定,丁布對于禾谷縊管蚜、麥長管蚜等均有較好的毒殺作用,但是關(guān)于丁布對苜蓿斑蚜的作用還需要研究。為此,本研究以苜蓿斑蚜為研究對象,詳細(xì)研究了以不同濃度丁布人工飼喂苜蓿斑蚜對其存活率、繁殖率以及體內(nèi)酶活性的影響,為揭示丁布對苜蓿斑蚜的控制作用提供數(shù)據(jù)支撐,為防治苜蓿害蟲植物源農(nóng)藥的研發(fā)提供理論依據(jù)。
苜蓿斑蚜采集于國家牧草產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系滄州試驗站,位于河北省滄州市獻(xiàn)縣韓村鎮(zhèn)北張白村日昇現(xiàn)代農(nóng)業(yè)園區(qū)(38°18′ N,116°21′ E)。并于室內(nèi)智能人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)飼養(yǎng)數(shù)代,培養(yǎng)條件為:溫度(25±2)℃,相對濕度約65%,光周期16L∶8D。從已繁殖數(shù)代的苜蓿斑蚜中挑取健康的4 日齡蚜蟲250 頭,放入滅菌培養(yǎng)皿中并置于人工氣候培養(yǎng)箱中黑暗饑餓處理5 h。
蚜蟲飼料采用純?nèi)斯わ暳?,飼料按照趙海龍等[13]的人工飼料配方配制,將配好的人工飼料混勻后經(jīng)細(xì)菌過濾器過濾,分裝保存至-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>
蚜蟲飼育器采用高約4 cm,直徑約2 cm 的透明玻璃管,雙層泊拉膜夾液態(tài)人工飼料構(gòu)成,設(shè)有飼料儲存室和蚜蟲活動室。上面為雙層泊拉膜飼料儲藏室,下端用海綿或紗布封口通風(fēng)。制作前,玻璃管及泊拉膜在紫外燈下殺菌數(shù)分鐘,在無菌的條件下進(jìn)行操作,雙手避免接觸泊拉膜的中間位置,防止飼料污染變質(zhì)。
丁布為標(biāo)準(zhǔn)品,購買于北京威知生物技術(shù)有限公司,為固體粉末狀試劑,于4 ℃保存?zhèn)溆谩1驹囼灩苍O(shè)置4 個處理組和1 個對照組,每個處理組和對照組均設(shè)有5 次重復(fù),每次重復(fù)采用1 個裝有10 頭苜蓿斑蚜的飼育器。首先用第一層拉薄的泊拉膜封閉飼育器,在上面滴加200 μL 混合不同濃度丁布(200 μg/mL、400 μg/mL、600 μg/mL 和800 μg/mL)的人工飼料,再用第二層泊拉膜封閉。將蚜蟲飼育器放入人工氣候培養(yǎng)箱中,飼養(yǎng)條件為溫度(25±2)℃,相對濕度約35%,光周期16L∶8D,光照強度9230 lx。每24 h觀察記錄苜蓿斑蚜成蚜的成活數(shù),繁殖率,若蚜的成活數(shù),72 h 后停止觀察。
本試驗共設(shè)置4 個處理組和1 個對照組,每個處理組和對照組均設(shè)有5 次重復(fù),每次重復(fù)采用1 個裝有10 頭苜蓿斑蚜的飼育器。72 h 后取樣。加入一定比例(緩沖比例2 μL/頭)的PBS 緩沖液,采用液氮低溫冰浴研缽將樣品研磨成粉末狀,離心10 min 左右(12000 r/min,4 ℃)取上清液,制成總蛋白粗提液,于-20 ℃保存?zhèn)溆?。采用Elisa 試劑盒檢測氨肽酶(APs)、胰凝乳蛋白酶(CTP)、胰蛋白酶(Tr)和總蛋白酶(Pr)活性
成蚜存活率、繁殖率及若蚜存活率計算方法:成蚜存活率(%)=成蚜存活數(shù)/成蚜總數(shù)×100%;繁殖率(%)=若蚜繁殖總數(shù)/成蚜總數(shù)×100%;若蚜存活率(%)=若蚜存活數(shù)/若蚜繁殖總數(shù)×100%。
結(jié)果使用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析,采用多元線性回歸方法進(jìn)行顯著性分析,分析結(jié)果采用Excel 2003 軟件進(jìn)行圖表制作。
苜蓿斑蚜成蚜取食含不同丁布濃度的混合飼料后72 h 內(nèi)存活率呈逐漸降低的趨勢,在取食飼料72 h后存活率最低,且存活率隨丁布濃度的升高而降低。72 h 后,取食丁布濃度為800 μg/mL 成蚜的存活率為30.7%,顯著低于其他處理(P<0.05)(圖1)。
圖1 不同濃度丁布對苜蓿斑蚜成蚜存活率的影響Fig.1 Effect of different DIMBOA’s concentrations on survivalrate of adult spotted alfalfa aphid
苜蓿斑蚜取食含不同濃度丁布的混合飼料72 h 內(nèi)繁殖率逐漸下降。72 h 后取食丁布含量為600 μg/mL、800 μg/mL 的蚜蟲繁殖率顯著低于其他濃度(P<0.05),分別為241.3%,174.8%(圖2)。
圖2 不同濃度丁布對苜蓿斑蚜成蚜繁殖率的影響Fig.2 Effect of different DIMBOA’s concentrations on reproduction rate of adult spotted alfalfa aphid
不同濃度的丁布對苜蓿斑蚜若蚜存活率均有一定的控制作用。高濃度的丁布混合飼料對苜蓿斑蚜若蚜的存活率影響最大,丁布含量為800 μg/mL 時,蚜蟲取食72 h 后若蚜存活率最低,為35.8%。在丁布含量為200 μg/mL、400 μg/mL 時,處理組苜蓿斑蚜的若蚜存活率與對照組無顯著差異(P>0.05)(圖3)。
圖3 不同濃度丁布對苜蓿斑蚜若蚜存活率的影響Fig.3 Effect of different DIMBOA’s concentrations on survival rate of the larvae spotted alfalfa aphid
苜蓿斑蚜取食含有不同濃度丁布的混合飼料后體內(nèi)的氨肽酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、總蛋白酶均受到了不同程度的抑制,活力降低。其中低濃度時,酶活力降低均不明顯,高濃度時,酶活力均顯著降低(P<0.05)。在濃度為800 μg/mL 時,相較于對照組,氨肽酶活力降低了61.5%,胰凝乳蛋白酶活力降低了67%,胰蛋白酶活力降低了65.1%,總蛋白酶活力降低了55.9%(圖4)。
圖4 不同濃度丁布對苜蓿斑蚜體內(nèi)酶活性的影響Fig.4 Effect of different DIMBOA’s concentrations on enzyme activity in alfalfa aphid
植物源殺蟲劑是利用具有殺蟲活性成分的植物進(jìn)行加工或提取其有效成分而制成的殺蟲制劑,主要在于對植物次生代謝物質(zhì)的利用[14,15]。20 世紀(jì)70 年代以來,國內(nèi)外學(xué)者對具有殺蟲作用的植物及其作用機(jī)制開展了廣泛的研究和探索。植物中殺蟲活性成分主要包括生物堿、萜烯類、精油類、光活化毒物以及黃酮類等,作用方式主要為拒食、觸殺、胃毒、忌避、抑制生長發(fā)育等[16-18]。苯并噁嗪類物質(zhì)作為殺蟲活性成分的一種,許多學(xué)者對其抗蟲性和作用特性也進(jìn)行了研究。歐洲玉米螟在丁布的作用下化蛹和羽化平均時間顯著延長,蛹和成蟲體質(zhì)量隨丁布濃度增高而降低[19]。劉保川等[20]在麥長管蚜人工飼料中加入0.6 mg/g 的丁布,麥長管蚜幾乎全部死亡。
許多研究表明丁布對于蚜蟲的抑制機(jī)制主要是引起拒食作用。例如,麥二叉蚜和麥無網(wǎng)蚜取食混有丁布的人工飼料后成活率降低,麥二叉蚜的繁殖率也有所降低[21],這與本試驗的結(jié)果一致。有研究表明丁布對昆蟲具有胃毒作用,主要是由于昆蟲胰蛋白酶活性位點上絲氨酸殘基的失活。α-胰凝乳蛋白酶中賴氨酸殘基位于酶的表面,結(jié)合丁布以后,位于活性位點內(nèi)部的絲氨酸殘基提高了酶對丁布的親和性,并與之反應(yīng)而失活[22]。此外,許多研究顯示丁布可通過影響蚜蟲體內(nèi)酶的活性來控制蚜蟲。Leszczyaski 等[23]的研究認(rèn)為,丁布能夠顯著降低麥長管蚜體內(nèi)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶和尿苷二磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)移酶的活性。本文發(fā)現(xiàn)苜蓿斑蚜取食含有不同濃度丁布飼料后,胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶的活性得到了不同程度的抑制,酶活性隨丁布濃度的增高而降低,也證明了丁布可通過影響蚜蟲體內(nèi)酶的活性對蚜蟲起到抑制作用。還有研究表明,丁布能與昆蟲蛋白酶結(jié)合后發(fā)生不可逆性抑制作用,活性位點上含有巰基的游離半胱氨酸殘基的蛋白酶能夠被丁布不可逆性抑制[24]。但是,本文僅發(fā)現(xiàn)了丁布可顯著抑制害蟲氨肽酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、總蛋白酶活性,但對苜蓿斑蚜起作用的具體劑量以及具體作用機(jī)制尚需更深入研究。