付楠霞，羅宗秀，李兆群，邊 磊，修春麗，陳宗懋，蔡曉明

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，杭州 310008）

茶麗紋象甲MyllocerinusaurolineatusVoss 屬鞘翅目Coleptera 象甲科Curculionidae，是我國(guó)茶園重要的食葉害蟲(chóng)。該蟲(chóng)主要以成蟲(chóng)嚼食茶枝嫩葉使形成不規(guī)則弧形缺刻，造成茶葉減產(chǎn)降質(zhì)，嚴(yán)重時(shí)僅留葉脈[1]。茶麗紋象甲成蟲(chóng)為害時(shí)期集中，防治難度大，且其為害時(shí)期與我國(guó)烏龍茶區(qū)的春茶和綠茶區(qū)的夏茶采摘季重疊，因此給我國(guó)茶產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。目前生產(chǎn)上，噴施化學(xué)農(nóng)藥是防治茶麗紋象甲的主要手段。但長(zhǎng)期使用化學(xué)農(nóng)藥防治不僅會(huì)造成我國(guó)茶葉及茶制品的農(nóng)藥殘留問(wèn)題，還易誤殺茶園的非靶標(biāo)有益生物，引發(fā)茶園生物多樣性下降、生態(tài)環(huán)境失衡等負(fù)面問(wèn)題，不利于茶產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展[3-6]。因此，亟需研發(fā)對(duì)該蟲(chóng)綠色無(wú)公害的防控措施。

球孢白僵菌Beauveriabassiana(Bals.)Vuill 是世界上目前研究和應(yīng)用最多的蟲(chóng)生真菌之一，由于其在自然界分布廣泛，寄主范圍廣且對(duì)人、畜、作物、害蟲(chóng)天敵及自然環(huán)境相對(duì)安全，球孢白僵菌已成為多種農(nóng)林害蟲(chóng)種群控制及生物防治的重要生防資源[7,8]。據(jù)Inglis[9]和李亦菲等[10]報(bào)道，球孢白僵菌能以15 個(gè)目149 科中的750 多種昆蟲(chóng)為寄主。目前，美國(guó)、歐洲、日本及印度等許多國(guó)家用球孢白僵菌生防產(chǎn)品防治農(nóng)林害蟲(chóng)及重要檢疫性害蟲(chóng)，并取得顯著成果[11,12]。我國(guó)對(duì)球孢白僵菌的研究始于20 世紀(jì)50 年代，據(jù)周哲宇等[13]報(bào)道，目前為止，我國(guó)已登記注冊(cè)了20 余種白僵菌產(chǎn)品，主要用于防治亞洲玉米螟Ostrinia furnacalisGuenée、馬尾松毛蟲(chóng)DendrolimuspunctatusWalker、松褐天牛MonochamusalternatusHope、光肩星天牛AnoplophoraglabripennisMotschulsky、東亞飛蝗LocustamigratoriamanilensisMeyen、稻縱卷葉螟CnaphalocrocismedinalisGuenée、美國(guó)白蛾HyphantriacuneaDrury、斜紋夜蛾SpodopteralituraFabricius 及地下害蟲(chóng)日本弧麗金龜PopilliajaponicaNewman 等多種農(nóng)林害蟲(chóng)。其中，用球孢白僵菌防治亞洲玉米螟和馬尾松毛蟲(chóng)的案例最為成功，用于防治二者的應(yīng)用面積曾達(dá)上百萬(wàn)公頃，堪稱世界之最[14-17]。

雖然球孢白僵菌已經(jīng)成為多種農(nóng)林害蟲(chóng)生物防治手段的重要組成部分，但利用生防真菌防治茶麗紋象甲的研究報(bào)道相對(duì)較少，特別是缺乏對(duì)幼蟲(chóng)毒力高的菌株資源。如王定峰等[18,19]分別從廣東英德茶園和12株原寄主為鞘翅目昆蟲(chóng)的白僵菌中篩選出對(duì)茶麗紋象甲成蟲(chóng)具有高毒力的菌株Bb1-1 和Bbr1552，但二者均以成蟲(chóng)為試驗(yàn)對(duì)象，對(duì)幼蟲(chóng)的致病效率如何尚不明確。此外，茶麗紋象甲成蟲(chóng)取食量大且為害期集中，利用球孢白僵菌防治成蟲(chóng)時(shí)常存在成蟲(chóng)感病致死前已對(duì)茶園造成嚴(yán)重為害的弊端。筆者近兩年研究發(fā)現(xiàn)，茶麗紋象甲以幼蟲(chóng)在茶園土壤中越冬，每年四月中下旬會(huì)集中遷移到1～5 cm 土壤表層化蛹羽化。若在此時(shí)期對(duì)幼蟲(chóng)進(jìn)行集中防治，則可在源頭上避免茶麗紋象甲成蟲(chóng)的為害。因此，迫切需要篩選出適用于防治茶麗紋象甲老熟幼蟲(chóng)的生防菌株。本研究報(bào)道了從自然罹病的茶麗紋象甲幼蟲(chóng)分離得到的1 株球孢白僵菌，并研究了其對(duì)茶麗紋象甲老熟幼蟲(chóng)的室內(nèi)毒力，旨在為茶麗紋象甲的生物防治提供新的殺蟲(chóng)微生物資源。

1 材料與方法

1.1 材料

供試甲蟲(chóng)：自然罹病的茶麗紋象甲幼蟲(chóng)僵蟲(chóng)于2021 年4 月12 日采自浙江省紹興市柯橋區(qū)平水鎮(zhèn)平陽(yáng)村有機(jī)茶園（東經(jīng)120.61122°北緯29.84760°），致病力測(cè)定所需老熟幼蟲(chóng)于2022―2023 年3―4 月采集于同一茶園。

培養(yǎng)基：含0.1 g/L 氯霉素的馬鈴薯葡萄糖（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基（馬鈴薯300.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，瓊脂15.0 g/L，氯霉素0.1 g/L）購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

試劑：真菌基因組DNA 抽提試劑盒Ezup Column Fungi Genomic DNA Purification Kit 購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit、2×Taq Master Mix 購(gòu)自南京諾維贊生物科技有限公司；pEASY Blunt Zero Cloning Kit 購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；普通瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 供試菌株的分離純化

將自然罹病的茶麗紋象甲僵蟲(chóng)在超凈臺(tái)中用75%酒精表面消毒5 min，之后用無(wú)菌水反復(fù)清洗3 次以去除所粘連的土塊，然后用高溫滅菌的剪刀將僵蟲(chóng)剪碎成小塊。隨后每3 個(gè)尸塊一組，呈等邊三角形狀接種到含0.1 g/L 氯霉素的馬鈴薯葡萄糖PDA 培養(yǎng)基上。置于27 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d 后，用接種環(huán)挑取邊緣菌絲于PDA 培養(yǎng)基上劃線純化；待長(zhǎng)出菌落后挑取不同形態(tài)、顏色、大小的菌落用平板劃線法轉(zhuǎn)接到新的PDA 培養(yǎng)基上。重復(fù)上述操作直至得到純菌落，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 致病菌株的分類鑒定

1.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定 在超凈工作臺(tái)中，用無(wú)菌接種環(huán)通過(guò)劃線法，將分離純化后的菌株接種到滅菌的含有0.1 g/L 氯霉素的PDA 培養(yǎng)基上。然后沿接種劃線部位分別斜插入2～3 片無(wú)菌蓋玻片，并將PDA 培養(yǎng)基平板置于27 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在接菌后第5～10 d 取出長(zhǎng)有菌絲的蓋玻片，采用光學(xué)顯微鏡（基恩士，VHX-7000），觀察菌株菌絲、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和分生孢子形態(tài)的顯微結(jié)構(gòu)。

用上述PDA 培養(yǎng)基平板制備濃度為20～30 個(gè)孢子/mL 的孢子懸浮液，無(wú)菌條件下，用移液槍吸取500 μL接種到含0.1 g/L 氯霉素的PDA 培養(yǎng)基中，用滅菌玻璃棒輕輕涂布，使其均勻分布培養(yǎng)基表面，封口膜封邊。然后于27 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并在培養(yǎng)后第9 d 拍照記錄菌落正反面形態(tài)和顏色。根據(jù)菌株形態(tài)學(xué)特征，參考蒲蟄龍和李增智[20]的方法初步鑒定蟲(chóng)生真菌的分類地位。

1.3.2 分子生物學(xué)鑒定 將分離的致病菌株接種在含0.1 g/L 氯霉素的PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d 后，刮下孢子和菌絲，利用真菌基因組DNA 抽提試劑盒提取基因組DNA。參照 Chaithra 和Castrillo 等[21,22]的方法，PCR 擴(kuò)增該菌株的ITS 和B locus 基因間隔區(qū)序列。其中，ITS 序列的擴(kuò)增引物為真菌核糖體rDNA 區(qū)通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）/ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），B locus基因間隔區(qū)序列的擴(kuò)增引物為B5.1F（5′-CGACCCGGCCAACTACTTTGA-3′）/B3.1R（5′-GTCTTCCAGTA CCACTACGCC-3′）。PCR 反應(yīng)體系：2×Taq Master Mix 25 μL、基因組DNA 模板30～60 ng、10 μmol/L上下游引物各1μL，ddH2O 補(bǔ)足至50 μL。ITS 序列的PCR 反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃預(yù)變性15 s，51 ℃退火15 s，72 ℃延伸40 s，共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。B locus 基因間隔區(qū)序列的PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃預(yù)變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。ITS PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用普通PCR 產(chǎn)物回收試劑盒（天根）回收純化目的片段，并送至浙江尚亞生物技術(shù)有限公司測(cè)序。B locus 基因間隔區(qū)序列PCR 產(chǎn)物則連接到pEASY?-Blunt Zero 載體上，挑選陽(yáng)性克隆后測(cè)序。在NCBI 對(duì)測(cè)序所得基因片段進(jìn)行Blast 同源性分析，并下載近緣物種的ITS 和B locus 基因間隔區(qū)序列。用MEGA 5.0 軟件的ClustalW 將分離所得菌株的ITS和B locus 基因間隔區(qū)序列與近緣物種序列進(jìn)行多序列比對(duì)，然后用鄰近法（Neigbor-joining method）構(gòu)建分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)并對(duì)其進(jìn)行檢驗(yàn)，Bootstrap 值為1000。

1.4 孢子懸浮液配制

取培養(yǎng)13 d 的菌株在超凈工作臺(tái)內(nèi)加入含0.5‰ 吐溫-80 的蒸餾水（即2000 倍吐溫-80 稀釋液）刮除菌落，洗出平皿內(nèi)的孢子，轉(zhuǎn)移到滅菌的三角瓶中，使用磁力攪拌器中速攪拌 20 min，使其均勻分散，配制成母液。然后采用10 倍稀釋法稀釋母液，并在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，每個(gè)濃度孢子懸浮液重復(fù)計(jì)數(shù)3 次。將孢子懸浮液濃度分別稀釋至1×108個(gè)孢子/mL、1×107個(gè)孢子/mL、1×106個(gè)孢子/mL 和1×105個(gè)孢子/mL，備用。

1.5 對(duì)茶麗紋象甲幼蟲(chóng)致病力測(cè)定

挑選蟲(chóng)態(tài)一致健康的茶麗紋象甲老熟幼蟲(chóng)為試驗(yàn)試蟲(chóng)，參考陳春艷等[23]和段玉林等[24]的試驗(yàn)方案，分別運(yùn)用浸蟲(chóng)法和拌土法兩種方式接種球孢白僵菌懸浮液。浸蟲(chóng)法的具體操作：將茶麗紋象甲幼蟲(chóng)置于2 mL濃度為1.0×105個(gè)孢子/mL～1.0×108個(gè)孢子/mL 的球孢白僵菌Maure 1.1 孢子懸浮液中，浸漬20 s，然后轉(zhuǎn)移至含有20 g 土壤（RH 22%）的小培養(yǎng)杯中（高和寬：4 cm×4.5 cm）。拌土法則將拌有2 mL 濃度為1.0×105個(gè)孢子/mL～1.0×108個(gè)孢子/mL 的球孢白僵菌Maure 1.1 孢子懸浮液的20 g 土壤（RH 22%）轉(zhuǎn)移到小培養(yǎng)杯中，然后將健康的茶麗紋象甲老熟幼蟲(chóng)轉(zhuǎn)移到該培養(yǎng)杯（高和寬：4 cm×4.5 cm）中。

每個(gè)濃度梯度3 次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10 頭試蟲(chóng)，浸蟲(chóng)法和拌土法的對(duì)照組均采用0.5‰吐溫-80 的無(wú)菌水溶液處理。所有的試蟲(chóng)均置于22 ℃、光周期16L∶8D、濕度為70%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 d 噴施無(wú)菌水以保持土壤的濕度，處理后第3 d 開(kāi)始，每天觀測(cè)1 次，記錄試蟲(chóng)的死亡數(shù)。死蟲(chóng)保濕培養(yǎng)觀察菌絲生長(zhǎng)情況（蟲(chóng)尸上長(zhǎng)出肉眼可見(jiàn)的菌絲），并拍照記錄染病僵蟲(chóng)的蟲(chóng)態(tài)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

根據(jù)統(tǒng)計(jì)的試蟲(chóng)死亡數(shù)，用Excel 計(jì)算出各處理的死亡率和校正死亡率。死亡率＝（處理總數(shù)－存活數(shù)）/處理總數(shù)×100%；累計(jì)校正死亡率＝（處理組累計(jì)死亡率－對(duì)照組累計(jì)死亡率）/（1－對(duì)照組累計(jì)死亡率）×100%；利用Graphpad Prism 5.0 軟件繪制球孢白僵菌致病力曲線。以孢子懸浮液濃度（孢子/mL）的對(duì)數(shù)值和死亡率的機(jī)率值，計(jì)算Probit 毒力回歸方程及致死中濃度LC50。根據(jù)各濃度下侵染天數(shù)和累計(jì)死亡率的機(jī)率值，計(jì)算Probit 回歸方程和致死中時(shí)間LT50。

2 結(jié)果與分析

2.1 致病菌株的分類鑒定

2.1.1 形態(tài)學(xué)鑒定 從茶麗紋象甲幼蟲(chóng)僵尸中分離、純化得到一株致病菌株，在PDA 培養(yǎng)基上該菌株菌落呈圓扁平狀，正面為乳白色，背面淡黃色，菌落初期表面絨毛狀，邊緣有放射性毛狀菌絲，接種后第9 d菌落直徑達(dá)23 mm，表面長(zhǎng)出粉狀顆粒感孢子，菌落呈棉絮狀（圖1a,b）。光學(xué)顯微鏡鏡檢發(fā)現(xiàn)：菌絲無(wú)色細(xì)長(zhǎng)，表面光滑，粗約為1.4～3.3 μm（圖1c），分生孢子梗著生于營(yíng)養(yǎng)菌絲上，產(chǎn)孢細(xì)胞基部呈近球形或瓶狀（圖1d, e），分生孢子球形或近球形、透明、光滑，平均大小約為2.0～3.0 μm（圖1e, f）。結(jié)合致病菌株的菌絲、孢子及菌落形態(tài)特征，初步認(rèn)定該致病菌為白僵菌，菌株編號(hào)為Maure 1.1。

圖1 菌株Maure 1.1 的形態(tài)特征Fig.1 Morphology characteristics of strain Maure 1.1

2.1.2 分子生物學(xué)鑒定 PCR 分別擴(kuò)增菌株Maure 1.1 的ITS 和B locus 基因間隔區(qū)序列片段，瓊脂糖凝膠電泳顯示，ITS 的PCR 產(chǎn)物在略大于500 bp 獲得一條特異性條帶，而B(niǎo) locus 基因間隔區(qū)的PCR 產(chǎn)物的分子量在略大于1500 bp 處（圖2）。測(cè)序結(jié)果顯示，ITS 和B locus 基因間隔區(qū)序列片段PCR 產(chǎn)物大小分別為533 bp 和1582 bp。將ITS 序列在NCBI 中以rRNA/ITS 數(shù)據(jù)庫(kù)中來(lái)源于真菌和參照材料的ITS 序列為比對(duì)對(duì)象進(jìn)行Blast，比對(duì)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株Maure 1.1 與球孢白僵菌B.bassianaARSEF 1564 的ITS 序列相似度高達(dá)97.83%。運(yùn)用鄰接法構(gòu)建該菌株的ITS 序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖3），結(jié)果表明該菌株與球孢白僵菌B.bassianaARSEF 1564 以98%的置信度聚于同一分支，這表明Maure 1.1 與球孢白僵菌的同源性最高，親源關(guān)系最為接近。B locus 基因間隔區(qū)序列在NCBI 中以標(biāo)準(zhǔn)核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)結(jié)果表明，菌株Maure 1.1與球孢白僵菌B.bassiana菌株RCEF2614 的B locus 基因間隔區(qū)的相似度高達(dá)100%。運(yùn)用鄰接法構(gòu)建該菌株的B locus 基因間隔區(qū)序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖4），結(jié)果表明該菌株與球孢白僵菌B.bassianastrain RCEF2614 以100%的置信度聚于同一分支，這表明Maure 1.1 與該菌株的同源性最高，親源關(guān)系最為接近。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，將菌株Maure 1.1 鑒定為球孢白僵菌B.bassiana。

圖2 菌株Maure 1.1 ITS（A）和B locus（B）基因間隔區(qū)序列PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.2 ITS (A) and B locus intergenic region genomic sequence (B) PCR products amplified from the isolate Maure 1.1

圖3 基于ITS 序列運(yùn)用鄰近法構(gòu)建的菌株Maure 1.1 及其近源菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of the isolate Maure 1.1 and the other close related strains constructed with neighbor-joining method based on the ITS sequence

圖4 基于B locus 基因間隔區(qū)序列運(yùn)用鄰近法構(gòu)建的菌株Maure 1.1 及其近源菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of the isolate Maure 1.1 and the other close related strains constructed with Neighbor-joining method based on the B locus intergenic region genomic sequence

2.2 致病菌株Maure 1.1 對(duì)茶麗紋象甲幼蟲(chóng)的毒力測(cè)定

2.2.1 茶麗紋象甲幼蟲(chóng)染病狀態(tài) 對(duì)照組的茶麗紋象甲老熟幼蟲(chóng)蟲(chóng)體乳白色，體表干凈且遍布纖毛，在土壤中活躍蠕動(dòng)。球孢白僵菌孢子液處理組的茶麗紋象甲老熟幼蟲(chóng)，雖然在感染初期，其取食行為、蟲(chóng)體外部形態(tài)與健康幼蟲(chóng)無(wú)差別，在接種4～6 d 后，部分幼蟲(chóng)活動(dòng)性明顯降低，幼蟲(chóng)蟲(chóng)體開(kāi)始僵硬化。在侵染6～9 d 后，被感染死亡的茶麗紋象甲老熟幼蟲(chóng)大量死亡，呈僵蟲(chóng)狀，體表沾滿泥土，并遍布白色菌絲。對(duì)感染死亡僵蟲(chóng)蟲(chóng)體上的菌株再進(jìn)行分離純化和形態(tài)及分子鑒定，發(fā)現(xiàn)再分離菌株的形態(tài)特征、ITS 和B locus基因間隔區(qū)序列均與供試菌株一致，確定致病菌株為球孢白僵菌菌株Maure 1.1。這些結(jié)果表明，本試驗(yàn)分離所得的球孢白僵菌菌株Maure 1.1 可成功侵染茶麗紋象甲老熟幼蟲(chóng)。

2.2.2 不同處理方式下球孢白僵菌對(duì)茶麗紋象甲幼蟲(chóng)累計(jì)校正死亡率 在22 ℃的培養(yǎng)條件下，不同處理方式和不同孢子濃度下，球孢白僵菌Maure 1.1 對(duì)茶麗紋象甲老熟幼蟲(chóng)的致死率變化如圖5 所示。由圖5A可知，在浸蟲(chóng)法處理?xiàng)l件下，接種不同孢子濃度的茶麗紋象甲幼蟲(chóng)處理后的3～11 d 內(nèi)，其死亡率均隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。在處理第11 d 后，茶麗紋象甲幼蟲(chóng)的累計(jì)校正死亡率達(dá)到最大。其中，在孢子濃度為1.0×105個(gè)孢子/mL～1.0×108個(gè)孢子/mL 時(shí)，茶麗紋象甲幼蟲(chóng)的死亡率分別達(dá)到60%、66.67%、70%和76.67%。由此可見(jiàn)，在該處理方式下，茶麗紋象甲幼蟲(chóng)死亡率隨著接種孢子濃度的增加而增大。由圖5B可知，拌土法處理?xiàng)l件下，不同濃度的白僵菌Maure 1.1 孢子液對(duì)茶麗紋象甲的累計(jì)校正死亡率也隨接種時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，均在處理第11 d 時(shí)死亡率達(dá)到最大。其中在孢子濃度為1.0×107個(gè)孢子/mL 和1.0×108個(gè)孢子/mL 時(shí)，茶麗紋象甲幼蟲(chóng)的死亡率分別達(dá)到70.00%和73.33%；在孢子濃度為1.0×106個(gè)/mL 和1.0×105個(gè)/mL 時(shí)，茶麗紋象甲幼蟲(chóng)的死亡率均為63.33%。綜上，在茶麗紋象甲幼蟲(chóng)集中化蛹和羽化的土壤溫度條件下，無(wú)論是通過(guò)浸蟲(chóng)法還是拌土法施用球孢白僵菌Maure 1.1，均可對(duì)茶麗紋象甲幼蟲(chóng)表現(xiàn)出較好的致死率。

圖5 不同處理方式下不同濃度球孢白僵菌孢子溶液對(duì)茶麗紋象甲幼蟲(chóng)的累計(jì)校正死亡率Fig.5 The cumulative adjusted mortality of tea weevil M.aurolineatus larve treated with B.bassiana spores of different concentrations under different inoculation methods

2.3 致病菌株Maure 1.1 對(duì)茶麗紋象甲幼蟲(chóng)的劑量效應(yīng)（LC50）和時(shí)間效應(yīng)（LT50）

致病球孢白僵菌分離株Maure 1.1 對(duì)茶麗紋象甲幼蟲(chóng)的Probit 回歸方程和對(duì)應(yīng)的LC50如表1 所示。在接種后第8～11 d，隨著接種后時(shí)間的延長(zhǎng)，LC50呈現(xiàn)遞減模式。其中在接種后第8 d，浸蟲(chóng)法和拌土法的LC50分別為3.82×108和9.89×107個(gè)孢子/mL；在接種后第11 d，浸蟲(chóng)法和拌土法的LC50分別為2.00×103和1.11×103個(gè)孢子/mL。在所有測(cè)試中，拌土法所需的LC50均稍小于浸蟲(chóng)法的LC50值，表明通過(guò)拌土法施用致病球孢白僵菌分離株Maure 1.1 對(duì)茶麗紋象甲幼蟲(chóng)有較強(qiáng)的毒力效應(yīng)。

表1 球孢白僵菌菌株Maure 1.1 對(duì)茶麗紋象甲老熟幼蟲(chóng)的Probit 回歸方程和LC50Table 1 The Probit regression equations and LC50 values of mature M.aurolineatus larvae infected with the isolated B.bassiana Maure 1.1 strain

隨著接種濃度的增加，菌株Maure 1.1 對(duì)茶麗紋象甲老熟幼蟲(chóng)的LT50逐步遞減。當(dāng)接種的孢子濃度為1×108個(gè)/mL 時(shí)，菌株Maure 1.1 對(duì)茶麗紋象甲老熟幼蟲(chóng)的LT50最小，其中浸蟲(chóng)法和拌土法兩種處理方式的LT50分別為7.87 d 和7.60 d。當(dāng)接種的孢子濃度為1×105個(gè)/mL 時(shí)，菌株Maure 1.1 對(duì)茶麗紋象甲老熟幼蟲(chóng)的LT50最大，其中浸蟲(chóng)法和拌土法兩種處理方式的LT50分別為10.06 d 和9.12 d。在相同的接種濃度下，浸蟲(chóng)法所對(duì)應(yīng)的LT50值均稍高于拌土法（表2）。

表2 球孢白僵菌菌株Maure 1.1 對(duì)茶麗紋象甲老熟幼蟲(chóng)的Probit 回歸方程和LT50Table 2 The Probit regression equations and LT50 values of mature M.aurolineatus larvae infected with the isolated B.bassiana Maure 1.1 strain

3 討論

昆蟲(chóng)病原真菌是一種重要的農(nóng)林害蟲(chóng)生防資源，具有對(duì)人畜和生態(tài)環(huán)境綠色安全的特點(diǎn)。為開(kāi)發(fā)出可防治茶麗紋象甲的生防菌株，本研究從田間自然罹病致死的茶麗紋象甲幼蟲(chóng)僵蟲(chóng)蟲(chóng)體上分離了一株蟲(chóng)生真菌菌株，形態(tài)學(xué)特征和分子系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析結(jié)果表明該菌株為球孢白僵菌，命名為Maure 1.1。室內(nèi)毒力測(cè)定顯示，在茶麗紋象甲幼蟲(chóng)化蛹羽化溫度條件下，處理11 d 后，不同濃度下的Maure 1.1 孢子懸浮液對(duì)老熟幼蟲(chóng)的致病力均可達(dá)到50%以上，表明該菌株具有進(jìn)一步研究的價(jià)值，可作為防治茶麗紋象甲幼蟲(chóng)的候選菌株，豐富了茶麗紋象甲生防微生物資源。

茶麗紋象甲以成蟲(chóng)嚼食葉片為害茶樹(shù)，目前化學(xué)防治是其主要防治手段。與成蟲(chóng)不同，茶麗紋象甲的幼蟲(chóng)和蛹均生活在土壤中，且無(wú)成蟲(chóng)的堅(jiān)硬鞘翅保護(hù)，更易受到致病菌株的侵染，以幼蟲(chóng)和蛹為防治對(duì)象可為防治茶麗紋象甲提供一種新思路。筆者近兩年對(duì)茶棚地面下70 cm×35 cm 區(qū)域內(nèi)1～10 cm 深度土壤茶麗紋象甲幼蟲(chóng)的分布調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，四月中下旬，當(dāng)表層土壤溫度達(dá)到20 ℃左右時(shí)，約有75.8%的幼蟲(chóng)已遷移到1～5 cm 的土壤層，并在此土壤層化蛹羽化（未發(fā)表數(shù)據(jù)）。若能抓住該時(shí)期利用昆蟲(chóng)病原真菌對(duì)其進(jìn)行集中防治，則可在源頭上避免茶麗紋象甲成蟲(chóng)的危害。本研究利用茶麗紋象甲化蛹羽化出土前在土壤中向上遷移的特性，測(cè)定了浸蟲(chóng)法和拌土法兩種處理方式下Maure 1.1 對(duì)茶麗紋象甲老熟幼蟲(chóng)的致病力。在所有測(cè)試中，相同試驗(yàn)條件下，拌土法的LC50和LT50均稍小于浸蟲(chóng)法對(duì)應(yīng)的數(shù)值，推測(cè)茶麗紋象甲在土壤中遷移的過(guò)程中增加了與Maure 1.1 孢子的接觸機(jī)率，因而更易感病。本試驗(yàn)中致病力測(cè)定的培養(yǎng)溫度和土壤濕度條件均基于此時(shí)期田間的測(cè)報(bào)數(shù)據(jù)而設(shè)置，試驗(yàn)結(jié)果表明在此土壤溫濕度條件下，運(yùn)用Maure 1.1 菌株防治茶麗紋象甲幼蟲(chóng)是可行的，為該菌株的實(shí)際田間應(yīng)用提供了重要的理論依據(jù)。

筆者調(diào)查發(fā)現(xiàn)4 月底茶園1～5 cm 的土壤層中常有茶麗紋象甲幼蟲(chóng)、蛹和初羽化成蟲(chóng)共存的現(xiàn)象，這表明，茶麗紋象甲幼蟲(chóng)在田間的實(shí)際化蛹時(shí)間雖然相對(duì)集中，但并不完全一致。本研究雖明確了Maure 1.1菌株對(duì)茶麗紋象甲老熟幼蟲(chóng)的致病力，但其對(duì)蛹和初羽化茶麗紋象甲成蟲(chóng)的毒力效應(yīng)如何也需進(jìn)一步研究。此外，孢子的成功萌發(fā)是昆蟲(chóng)病原真菌發(fā)揮致病效力的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在實(shí)際田間應(yīng)用過(guò)程中常受到環(huán)境溫度、濕度和紫外線強(qiáng)度等多個(gè)環(huán)境因子的影響[25-29]。Mann 和Davis[30]的研究表明，球孢白僵菌孢子的萌發(fā)和生長(zhǎng)受溫度影響較大，其最適的致病溫度為23～25 ℃。葛銀銀等[25]研究發(fā)現(xiàn)，增加環(huán)境相對(duì)濕度可顯著提升球孢白僵菌的田間防治效率。本報(bào)道只測(cè)定了單一溫濕度條件下（22 ℃，20%～24%），球孢白僵菌Maure 1.1 對(duì)老熟幼蟲(chóng)的室內(nèi)毒力效應(yīng)，其在茶園復(fù)雜環(huán)境條件下的實(shí)際防治效果尚不明確。王成樹(shù)等[31]的研究證明球孢白僵菌種群中約有20%的野生菌株以異核體的形式存在，約35%的異核體球孢白僵菌在繼代培養(yǎng)中會(huì)發(fā)生性狀分離，進(jìn)而導(dǎo)致致病力的快速退化或變異。本研究所鑒定的野生菌株球孢白僵菌Maure 1.1 是否以異核體存在，其在繼代培養(yǎng)中是否會(huì)發(fā)生性狀分離有待進(jìn)一步明確。因此，為了將分離所得的Maure 1.1 菌株制成微生物殺蟲(chóng)劑，并在自然環(huán)境條件下大規(guī)模防治茶麗紋象甲，后續(xù)我們還需探究Maure 1.1 菌株對(duì)蛹和初孵成蟲(chóng)的毒力大小、田間防治效果及其繼代培養(yǎng)等一系列問(wèn)題。