王浩宇，張弘弢，張 瑩，趙 宇,7，王傳珍，張麗霞，王 琦，吳 迪，于翠芳，李海勇，王 爽*，牛 犇*

（1.北京市頤和園管理處，北京 100091；2.東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040；3.東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150040；4.煙臺(tái)市森林資源監(jiān)測(cè)保護(hù)服務(wù)中心，煙臺(tái) 264000；5.中農(nóng)綠康（北京）生物技術(shù)有限公司，北京 102101；6.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)系，北京 100193；7.牡丹江師范學(xué)院，牡丹江 157000；8.青州市云駝風(fēng)景區(qū)運(yùn)行服務(wù)中心，青州 262500）

松材線蟲(chóng)病，又稱松樹(shù)枯萎病，是由松材線蟲(chóng)Bursaphelenchusxylophilus（pine wood nematode，PWN）引起的毀滅性森林病害，至今為止，江蘇、浙江、遼寧等18 個(gè)省份666 個(gè)縣級(jí)行政區(qū)已被列入疫區(qū)名單[1]，對(duì)我國(guó)的林業(yè)經(jīng)濟(jì)及生態(tài)環(huán)境造成了極大的破壞。對(duì)于松材線蟲(chóng)病的防治，傳統(tǒng)方法采用煙熏、焚燒、砍伐、殺蟲(chóng)劑噴灑、樹(shù)干注射化學(xué)農(nóng)藥等[2,3]。這些方法存在成本高、環(huán)境友好性差等問(wèn)題，同時(shí)也會(huì)增加松材線蟲(chóng)的耐藥性。利用環(huán)境友好型微生物制劑是控制松材線蟲(chóng)病的重要方向[4]，但是利用生防微生物對(duì)松材線蟲(chóng)抑殺機(jī)制的相關(guān)研究還不完善。本研究通過(guò)構(gòu)建路德維希腸桿菌EnterobacterludwigiiAA4β-半乳糖苷酶基因ganA的突變體，對(duì)其抑殺松材線蟲(chóng)作用機(jī)制進(jìn)行解析，以期為松材線蟲(chóng)病有效防控以及生防菌劑應(yīng)用技術(shù)的建立提供理論依據(jù)。

具有殺線活性的細(xì)菌主要來(lái)源于芽胞桿菌屬、鏈霉菌屬、沙門(mén)氏菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、假單胞菌屬以及腸桿菌屬等[4]。生防菌通過(guò)產(chǎn)生毒素、競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)、消解線蟲(chóng)體表組織、干擾線蟲(chóng)行為模式以及動(dòng)員真菌捕食線蟲(chóng)等作用方式殺死線蟲(chóng)[4]。蘇云金芽胞桿菌Bacillusthuringiensis（Bt）可產(chǎn)生多種具有殺蟲(chóng)作用的伴胞晶體蛋白毒素，主要包括α-外毒素、β-外毒素、γ-外毒素和δ-內(nèi)毒素，其中β-外毒素和δ-內(nèi)毒素具有線蟲(chóng)致死活性[5,6]；穿刺芽胞桿菌Pasteuriapenetrans的孢子能夠附著在線蟲(chóng)幼蟲(chóng)的表皮表面，通過(guò)爭(zhēng)奪環(huán)境中的硒（Se）元素，使線蟲(chóng)表皮缺乏硒結(jié)合蛋白（SeBPs）[7]；側(cè)胞短芽胞桿菌Brevibacilluslaterosporus和熒光假單胞菌Pseudomonasfluorescens等分泌的細(xì)胞外蛋白酶，能在線蟲(chóng)的體表形成孔洞，并由表皮細(xì)胞向內(nèi)連續(xù)降解并消化內(nèi)部組織[8-10]；銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa生物膜中含有的胞外多糖Psl能夠抑制線蟲(chóng)的運(yùn)動(dòng)，Psl 通過(guò)降低線蟲(chóng)的爬行速度來(lái)降低線蟲(chóng)的定殖能力，從而阻止線蟲(chóng)逃脫，降低線蟲(chóng)在植物上的定殖和種群數(shù)量[11]；當(dāng)環(huán)境中無(wú)毒的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌Stenotrophomonasmaltophilia感受到線蟲(chóng)分泌的信號(hào)后，通過(guò)釋放尿素激活真菌的生存策略轉(zhuǎn)化開(kāi)關(guān)，產(chǎn)生捕食器官幫助其消滅線蟲(chóng)[12]。

腸桿菌屬Enterobactersp.細(xì)菌廣泛存在于土壤，植物和動(dòng)物，包括人類(lèi)等環(huán)境中，許多腸桿菌菌株為植物有益菌[13]。腸桿菌菌株可以通過(guò)產(chǎn)生吲哚乙酸（IAA）、水楊酸、鐵載體、胞外多糖以及固氮作用等方式促進(jìn)其植物宿主生長(zhǎng)[14,15]。目前已有報(bào)道證實(shí)腸桿菌能夠抑制串珠鐮刀菌Fusariummoniliforme、黑曲霉Aspergillusniger、青枯菌Ralstoniasolanacearum等植物病原菌，起到保護(hù)植物的作用。少數(shù)腸桿菌株對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)表現(xiàn)出顯著的殺線蟲(chóng)活性，如阿氏腸桿菌EnterobacterasburiaeHK169 對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)卵囊產(chǎn)生的抑制率達(dá)到66%，并在48 h 內(nèi)殺死2 齡幼蟲(chóng)[16]。番茄根部分離的內(nèi)生菌中腸桿菌EnterobacterintermediusMK-42 可顯著減少感染根結(jié)線蟲(chóng)植物的根部卵囊形成[17]。然而對(duì)于腸桿菌菌株抑制植物寄生線蟲(chóng)的分子機(jī)制目前尚不清楚。

β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，GAL）廣泛存在于植物以及微生物中，此酶由500 kDa 的四聚體構(gòu)成，該水解酶可以水解氨基多糖與核心蛋白連接區(qū)的糖苷鍵，使氨基多糖側(cè)鏈與核心蛋白解離，從而使大分子多糖解體，進(jìn)而破壞基底膜和細(xì)胞外間質(zhì)屏障，使得細(xì)菌易于粘附與侵襲宿主細(xì)胞[18]。在 2 型豬鏈球菌Streptococcussuisserotype2 中，β-半乳糖苷酶可以通過(guò)水解作用抑制或破壞細(xì)菌和宿主上皮細(xì)胞間的連接，水解宿主細(xì)胞表面半乳糖基團(tuán)，從而改變肺炎鏈球菌對(duì)宿主細(xì)胞的粘附及其在鼻咽部的侵襲定殖能力[19]。熒光假單胞菌菌株CHA0 處理爪哇根結(jié)線蟲(chóng)Meloidogynejavanica幼蟲(chóng)的死亡率與其β-半乳糖苷酶的活性強(qiáng)弱呈正相關(guān)[20]。

在前期工作中，從玉米根際分離的路德維希腸桿菌AA4[21]，在與松材線蟲(chóng)互作的模型中，松材線蟲(chóng)校正死亡率達(dá)到85%以上，在溫室盆栽試驗(yàn)中菌株AA4 可將3 年生樟子松幼苗的松材線蟲(chóng)病病情指數(shù)由86.9降至19.5，具有成為生防菌的潛力[22,23]。為了探究其β-半乳糖苷酶對(duì)菌株AA4 殺松材線蟲(chóng)活性的影響，本研究采用同源重組法敲除路德維希腸桿菌AA4 中β-半乳糖苷酶編碼基因ganA，探究基因ganA在菌株AA4 抑殺松材線蟲(chóng)中的作用與功能，解析路德維希腸桿菌AA4 殺松材線蟲(chóng)的作用機(jī)制，為揭示細(xì)菌抑殺松材線蟲(chóng)作用機(jī)制及生防菌開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株 路德維希腸桿菌AA4 由玉米根際中分離獲得[21]。細(xì)菌菌株與50%的甘油等體積混合后在-80℃中冷凍保存。在LB 固體培養(yǎng)基上活化菌株，30 ℃，培養(yǎng)16 h。挑取單克隆于5 mL LB 液體培養(yǎng)基，30 ℃，200 r/min，培養(yǎng)16 h，獲得待測(cè)菌液。在必要時(shí)補(bǔ)充抗生素卡那霉素50 μg/mL，氯霉素50 μg/mL（表1）。

表1 菌株與質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids

1.1.2 供試線蟲(chóng)及培養(yǎng) 松材線蟲(chóng)由河北省農(nóng)林科學(xué)院遺傳生理研究所惠贈(zèng)；灰葡萄孢Botrytiscinerca購(gòu)買(mǎi)自上海保藏生物技術(shù)中心，菌株編號(hào)AS3.3789。將濃度為2500 頭/mL 的松材線蟲(chóng)懸浮液接到新鮮的灰葡萄孢平板上，于25 ℃生長(zhǎng)至線蟲(chóng)擴(kuò)散達(dá)培養(yǎng)皿面積的2/3（約培養(yǎng)5 d）。

向含線蟲(chóng)的真菌平板中加入10 mL 無(wú)菌水，浸泡1 h。將線蟲(chóng)懸浮液轉(zhuǎn)入15 mL 離心管，靜置沉淀，棄上清。加入5 mL 含有2%硫酸鏈霉素的無(wú)菌水，輕輕混勻，對(duì)線蟲(chóng)進(jìn)行消毒，處理5 min 后，靜置，棄上清，用無(wú)菌水重復(fù)洗滌3 次。

取1 支50 mL 酸式滴定管，豎直固定在鐵架臺(tái)上，裝入49 mL 0.3%的羧甲基纖維素鈉鹽（CMC）溶液，再?gòu)墓芸诰徛尤? mL 松材線蟲(chóng)懸浮液（約7000 條線蟲(chóng)），靜置12 h。取滴定管上端25 mL 懸浮液，離心5 min（2000 r/min），除去上清液，獲得2 齡松材線蟲(chóng)幼蟲(chóng)。將2 齡松材線蟲(chóng)幼蟲(chóng)滴加到新鮮的真菌平板上，48 h 后，獲得4 齡松材線蟲(chóng)。

1.2 基因ganA 敲除與回補(bǔ)菌株的構(gòu)建

1.2.1 基因ganA的敲除 根據(jù)Red（λ，β，exo）介導(dǎo)的同源重組原理設(shè)計(jì)引物[24]。利用引物ganA- h1up和ganA- h1down 從菌株AA4 基因組中擴(kuò)增出ganA基因上游同源臂，利用引物ganA- h2up 和ganA- h2down擴(kuò)增出ganA基因下游同源臂。利用引物Kana up 和Kana down，從質(zhì)粒pKD4 中擴(kuò)增出一個(gè)兩側(cè)與ganA基因23 bp 相同序列的卡那霉素片段。利用引物pUC19up 和pUC19down，從pUC19 質(zhì)粒中擴(kuò)增出另一個(gè)與ganA基因同源的22 bp 長(zhǎng)的片段。將純化的PCR 產(chǎn)物按照Gibson DNA 連接酶（sosomix，Tsingke）的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行組裝，轉(zhuǎn)入大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中。在添加了卡那霉素的LB 固體平板上篩選含有重組pUC19ΔganA載體的克隆。提取重組質(zhì)粒pUC19ΔganA，以其為模板，引物ganA-H1up 和ganA-H2down 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。純化后的PCR 產(chǎn)物經(jīng)2.5 KV/0.2 cm 電擊轉(zhuǎn)化（BIO-RAD，411BR11661）進(jìn)入攜帶Red（λ，β，exo）重組酶質(zhì)粒pKD46 的AA4 感受態(tài)細(xì)胞，30 ℃下孵育24 h 后在加卡那霉素的LB 固體平板上篩選得到的轉(zhuǎn)化子。利用PCR 和測(cè)序驗(yàn)證同源重組。在42 ℃，200 r/min 的條件下?lián)u床培養(yǎng)正確的轉(zhuǎn)化子，消除pKD46 質(zhì)粒，獲得基因敲除株[25]（表2）。

表2 文中所用引物Table 2 Primers used in this study

1.2.2 基因ganA回補(bǔ) 利用引物ganA-up 和ganA-down 從菌株AA4 基因組中擴(kuò)增出基因ganA片段，以質(zhì)粒pBBRI 為模板，利用引物ganA-PBBR1-up 和ganA-PBBR1-down 擴(kuò)增出于ganA基因具有22 bp 相同序列的片段。利用Gibson DNA 連接技術(shù)連接兩個(gè)基因片段構(gòu)成回補(bǔ)質(zhì)粒。用2.5 KV 電擊轉(zhuǎn)化法將回補(bǔ)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到ΔganA的感態(tài)細(xì)胞中，在30 ℃加卡那霉素和四環(huán)素的LB 固體平板培養(yǎng)24 h，通過(guò)PCR 和測(cè)序確認(rèn)回補(bǔ)菌株[26]（表2）。

1.3 殺松材線蟲(chóng)活性檢測(cè)

將待測(cè)菌液濃度調(diào)為OD600值為1.0（含菌量1012CFU/mL），在96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入20 μL（約含50 頭）松材線蟲(chóng)懸浮液，40 μL 待測(cè)菌懸液，對(duì)照組（CK）加入40 μL LB 培養(yǎng)基，黑暗條件下在25 ℃培養(yǎng)24 h 后除去菌液，停止共培養(yǎng)[27,28]。

采用4’6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）對(duì)與細(xì)菌共培養(yǎng)后的松材線蟲(chóng)進(jìn)行染色[29]，DAPI 溶液最終濃度為5.0 μg/mL。染色1 h 后，用無(wú)菌水清洗3 次，除去染料。當(dāng)線蟲(chóng)死亡后，線蟲(chóng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整，細(xì)胞膜的通透性增加，DAPI 可以進(jìn)入線蟲(chóng)細(xì)胞核與雙鏈DNA 結(jié)合，發(fā)揮標(biāo)記作用。使用激光共聚焦顯微鏡（Zeiss，LSM 800），激發(fā)光波長(zhǎng)353 nm，吸收光波長(zhǎng)465 nm 處可觀察到死亡線蟲(chóng)因被染色而產(chǎn)生的熒光，而活線蟲(chóng)不被染色，不產(chǎn)生熒光。死亡率（%）＝（死亡蟲(chóng)數(shù)量/供試蟲(chóng)數(shù)量）×100；校正死亡率（%）＝（處理死亡率―對(duì)照死亡率）/（1―對(duì)照死亡率）×100。

1.4 松材線蟲(chóng)病防治效果檢測(cè)

用5%的高錳酸鉀溶液浸泡樟子松種子1 h，對(duì)種子進(jìn)行表面滅菌。用無(wú)菌水清洗至無(wú)色，除去種子表面的高錳酸鉀溶液。將滅菌后的種子用無(wú)菌紗布包裹，用無(wú)菌水潤(rùn)濕紗布，置于30 ℃進(jìn)行催芽。48 h 后挑選出芽的種子，種植到滅菌土中，25 ℃溫室培養(yǎng)30 d，每3 d 給幼苗澆水一次[30,31]。

種子萌發(fā)1 月后，樟子松幼苗苗高4～6 cm，具有針葉50～70 片，向該時(shí)期的樟子松幼苗噴淋5 mL OD600＝1.0 的待測(cè)菌液。用注射針頭在距離根部2～3 cm 處，將松樹(shù)幼苗主干部位的韌皮部割開(kāi)傷口，在傷口處安裝1 mL 的注射器針頭，用10 cm 左右的小木棒和封口膜固定針頭和包扎傷口，在注射器槍頭內(nèi)注入100 μL 30 頭/μL 的松材線蟲(chóng)懸浮液。

每組處理10 棵樟子松幼苗。接種9 d 后，根據(jù)病級(jí)分類(lèi)（圖1）獲得相應(yīng)病情指數(shù)。0 級(jí)，樹(shù)苗生長(zhǎng)正常，莖部飽滿呈綠色、淺綠色，分支飽滿較舒展呈深綠色，除有針頭戳傷外無(wú)其他異樣；1 級(jí)，樹(shù)苗輕微畸形，莖部仍較飽滿但開(kāi)始泛黃，分支失水彎曲，分支尖端變黃，整株樹(shù)苗失水呈現(xiàn)分支蜷縮現(xiàn)象；2級(jí)，樹(shù)苗畸形，莖部失水輕微干癟泛黃，分支蜷縮出現(xiàn)干癟皺縮現(xiàn)象且尖端枯黃，整株樹(shù)苗失水明顯，出現(xiàn)輕微干枯現(xiàn)象；3 級(jí)，莖部枯黃干癟，分支彎曲低垂失水嚴(yán)重且皺縮現(xiàn)象明顯，整株樹(shù)苗嚴(yán)重失水，瀕臨枯萎；4 級(jí)，莖部枯黃，分支彎曲干癟枯黃，整株樹(shù)苗完全失水，樹(shù)苗枯萎死亡。病情指數(shù)（DI）＝Σ（病級(jí)數(shù)×該病級(jí)株數(shù)）/（試驗(yàn)幼苗總數(shù)×最高病級(jí)數(shù)）×100。

圖1 樟子松幼苗松材線蟲(chóng)病病級(jí)分類(lèi)（比例尺：2 cm）Fig.1 Severity ranks of the PWD on Pinus sylvestris seedlings caused by B.xylophilus (Scale bars: 2 cm)

1.5 細(xì)菌的松材線蟲(chóng)定殖檢測(cè)

將待測(cè)菌液濃度調(diào)為OD600值為1.0（含菌量1012CFU/mL），取400 μL 菌懸液涂布在LB 固體平板培養(yǎng)基上，黑暗條件，25 ℃培養(yǎng)24 h。將消毒好的線蟲(chóng)懸浮液滴加至該平板上，共培養(yǎng)到測(cè)試時(shí)間后，挑取20 頭存活線蟲(chóng)，用無(wú)菌的PBS 緩沖液清洗3 次，然后加入1 mm 鋯10 顆和500 μL 的PBS 緩沖液，使用中通量組織研磨儀破碎蟲(chóng)體30 s 后置于冰上，按1:10 比例稀釋涂布，菌落計(jì)數(shù)[32]。

1.6 細(xì)菌限制松材線蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)能力檢測(cè)

將待測(cè)菌液濃度調(diào)為OD600值為1.0（含菌量1012CFU/mL），取400 μL 菌懸液涂布在LB 固體平板（半徑45 mm）培養(yǎng)基上，對(duì)照組（CK）LB 固體平板不涂布菌懸液，黑暗條件，25 ℃培養(yǎng)24 h。松材線蟲(chóng)4齡幼蟲(chóng)對(duì)藍(lán)光照有明顯的避光性[11]，挑取20 頭具有運(yùn)動(dòng)能力的4 齡松材線蟲(chóng)幼蟲(chóng)，放置在鋪有細(xì)菌的平板中央，用藍(lán)光照射線蟲(chóng)，分別在10、20 和30 min 觀察記錄線蟲(chóng)分別在存在野生型AA4 和基因敲出ΔganA的細(xì)菌平板上的運(yùn)動(dòng)距離。

1.7 細(xì)菌生物膜形成檢測(cè)

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的待測(cè)菌液（OD600＝0.6），用新鮮LB 培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋至OD600＝0.17, 取2 μL 滴加在胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）的表面，30 ℃靜置培養(yǎng)72 h，對(duì)形成的菌膜拍照。移除培養(yǎng)基，用蒸餾水清洗3 次。吸出蒸餾水后，加入200 μL 2%結(jié)晶紫溶液染色30 min，移除結(jié)晶紫溶液，用蒸餾水清洗3 次，晾干，加入100 μL 10%醋酸溶解30 min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)并記錄孔中液體于OD570處的吸光值[33,34]。

1.8 細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性檢測(cè)

將待測(cè)菌液調(diào)整吸光度至OD600＝0.17。用牙簽蘸取菌液，穿刺接種于含有0.2%的瓊脂的LB 平板（半徑45 mm）培養(yǎng)基。黑暗條件下，30 ℃，靜置14 h 后，測(cè)量待測(cè)菌株運(yùn)動(dòng)半徑[34]。

1.9 β-半乳糖苷酶純品殺線活性檢測(cè)

將β-半乳糖苷酶純品溶于無(wú)菌水中，調(diào)節(jié)濃度至400 μg/mL，在96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入20 μL（約含50 頭）松材線蟲(chóng)懸浮液，40 μLβ-半乳糖苷酶溶液，對(duì)照組（CK）加入40 μL 無(wú)菌水，黑暗條件下在25 ℃培養(yǎng)24 h 后除去菌液，停止共培養(yǎng)。用DAPI 染色1 h，無(wú)菌水清洗3 次除去染料，使用激光共聚焦顯微鏡觀察線蟲(chóng)染色情況，進(jìn)而計(jì)算死亡率[28]。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因ganA 與路德維希腸桿菌AA4 殺松材線蟲(chóng)活性的相關(guān)性

利用Red（λ，β，exo）介導(dǎo)DNA 同源重組系統(tǒng)敲除了菌株AA4 的β-半乳糖苷酶編碼基因ganA（圖2A），獲得ganA基因敲除菌株ΔganA。利用質(zhì)粒pBBR1，通過(guò)Gibson 連接構(gòu)建回補(bǔ)質(zhì)粒，獲得ganA基因回補(bǔ)菌株CΔganA。基因敲除菌株ΔganA和基因回補(bǔ)菌株CΔganA的生長(zhǎng)曲線與野生型菌株AA4 無(wú)顯著性差異（圖2B），即ganA基因的敲除與回補(bǔ)對(duì)路德維希腸桿菌AA4 的生長(zhǎng)沒(méi)有影響（圖2B）。為研究β-半乳糖苷酶純品是否具有殺松材線蟲(chóng)活性，將松材線蟲(chóng)置于400 μg/mL 的β-半乳糖苷酶溶液中培養(yǎng)24 h后，發(fā)現(xiàn)β-半乳糖苷酶溶液處理組與空白對(duì)照組無(wú)菌水處理組的殺線活性無(wú)顯著差異（圖2C），說(shuō)明β-半乳糖苷酶純品無(wú)殺線活性。

圖2 基因ganA 在AA4 基因組上的位置（A），野生型菌株AA4、基因敲除菌株ΔganA 和基因回補(bǔ)菌株CΔganA 的生長(zhǎng)曲線（B），β-半乳糖苷酶的殺松材線蟲(chóng)死亡率（C）Fig.2 The location of gene ganA on the genome sequence of E.ludwigii AA4 (A), growth curves of AA4, ΔganA and CΔganA (B),mortality rate of the PWNs treated with GAL (C)

分別將AA4、ΔganA及CΔganA菌液（OD600＝1.0）與松材線蟲(chóng)共培養(yǎng)24 h，統(tǒng)計(jì)松材線蟲(chóng)校正死亡率，比較殺松材線蟲(chóng)活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與AA4 共培養(yǎng)的松材線蟲(chóng)校正死亡率達(dá)到86.25%，而與ΔganA共培養(yǎng)的松材線蟲(chóng)校正死亡率為51.18%，與CΔganA共培養(yǎng)的松材線蟲(chóng)校正死亡率為80.76%。說(shuō)明當(dāng)基因ganA被敲除后AA4 的殺松材線蟲(chóng)活性顯著下降，但是當(dāng)基因ganA回補(bǔ)后，AA4 的殺松材線蟲(chóng)活性回升，與野生型菌株AA4 的殺松材線蟲(chóng)能力無(wú)顯著差異（圖3A）。為更直觀地觀察試驗(yàn)結(jié)果，將分別與AA4，ΔganA及CΔganA菌液（OD600＝1.0）共培養(yǎng)的松材線蟲(chóng)用DAPI 溶液染色。經(jīng)DAPI 溶液染色后發(fā)現(xiàn)，與AA4共培養(yǎng)的線蟲(chóng)幾乎全部死亡，而與ΔganA共培養(yǎng)的死亡線蟲(chóng)明顯減少，與CΔganA共培養(yǎng)的線蟲(chóng)死亡情況與AA4 相近（圖3B）。表明基因ganA對(duì)AA4 的殺松材線蟲(chóng)活性至關(guān)重要，是其殺松材線蟲(chóng)作用機(jī)制中的關(guān)鍵基因。

圖3 菌株AA4、ΔganA 及CΔganA 的殺松材線蟲(chóng)校正死亡率（A）及殺松材線蟲(chóng)效果DAPI 染色圖像分析（B）Fig.3 Mortality of the PWNs treated with AA4, ΔganA and CΔganA (A) and imaging analysis of the PWN-killing efficacy of AA4,ΔganA and CΔganA against B.xylophilus after being stained by DAPI (B)

2.2 基因ganA 與路德維希腸桿菌AA4 防治松材線蟲(chóng)病功能的相關(guān)性

接種松材線蟲(chóng)后，發(fā)現(xiàn)野生型AA4 處理組（AA4）和回補(bǔ)菌株（CΔganA）處理組癥狀較輕，部分幼苗未表現(xiàn)出松材線蟲(chóng)病癥狀（圖4A）。而僅接松材線蟲(chóng)處理組（PWN）和基因敲除菌株（ΔganA）處理組全部表現(xiàn)出松材線蟲(chóng)病癥狀，且病情較重，部分樟子松幼苗完全死亡。將AA4 噴淋在接種松材線蟲(chóng)的1月齡樟子松幼苗9 d 后，病情指數(shù)由91.4 降至41.2，與僅接松材線蟲(chóng)組差異顯著（P＜0.05）；而ΔganA處理組病情指數(shù)為79.8，與僅接松材線蟲(chóng)組沒(méi)有顯著性差異；CΔganA處理組病情指數(shù)為46.2，生防效果有所恢復(fù)（圖4B）?；騡anA敲除菌株ΔganA對(duì)松材線蟲(chóng)病的防治效果顯著下降（P＜0.05），而基因ganA的回補(bǔ)菌株CΔganA對(duì)松材線蟲(chóng)病的防治效果有明顯恢復(fù)，說(shuō)明基因ganA對(duì)路德維希腸桿菌AA4的松材線蟲(chóng)病防病效果的發(fā)揮有調(diào)控功能。

圖4 在1 月齡樟子松幼苗上AA4，ΔganA 及CΔganA 松材線蟲(chóng)病防病效果（A）及防松材線蟲(chóng)病病情指數(shù)（B）Fig.4 Disease-suppressing effect of AA4, ΔganA and CΔganA against PWD caused by B.xylophilus on one-month-old P.sylvestris seedlings(A) and disease index of PWD on one-month-old P.sylvestris seedlings treated by PWN with AA4, ΔganA and CΔganA (B)

2.3 基因ganA 對(duì)路德維希腸桿菌AA4 生物膜的形成及運(yùn)動(dòng)性的影響

細(xì)菌生物膜形成能力測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AA4 和ΔganA形成的生物膜表面平整，邊緣光滑，且有一定厚度（圖5A）。結(jié)晶紫染色后，AA4 生物膜OD570平均值為1.279，而ΔganA生物膜OD570平均值為1.205，無(wú)顯著性差異（圖5B）。

圖5 菌株AA4 與ΔganA 的生物膜（A），2%結(jié)晶紫染色后菌株AA4 與ΔganA 的生物膜的吸光值（B）Fig.5 The biofilm of AA4 and ΔganA (A), the absorbance values of the biofilm of AA4 and ΔganA after stained by 2% crystal violet (B)

菌株的swimming 能力檢測(cè)結(jié)果表明，菌株AA4 的swimming 運(yùn)動(dòng)半徑平均為4.20 cm，而突變體ΔganAswimming 運(yùn)動(dòng)半徑平均為3.44 cm（圖6A）。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，突變體ΔganA的swimming 能力顯著下降（圖6B）。

圖6 菌株AA4 與ΔganA 的swimming 運(yùn)動(dòng)性（A）, 菌株AA4 與ΔganA 的swimming 運(yùn)動(dòng)半徑（B）Fig.6 The motility of swimming by AA4 and ΔganA (A), the moving radius (cm) of swimming by AA4 and ΔganA (B)

2.4 基因ganA 對(duì)路德維希腸桿菌AA4 定殖松材線蟲(chóng)的影響

隨著AA4 與松材線蟲(chóng)共培養(yǎng)時(shí)間的增加，AA4 在松材線蟲(chóng)上共培養(yǎng)2 h 后的定殖量從7.4×103CFU/頭不斷增加，12 h 后達(dá)到1.3×104CFU/頭。在共培養(yǎng)前期定殖量平緩上升，在共培養(yǎng)10 h 后，定殖量陡然上升?？梢酝茢嘣诠才囵B(yǎng)前期，AA4 與松材線蟲(chóng)相互作用，處于黏附入侵階段，當(dāng)定殖穩(wěn)定后，AA4在松材線蟲(chóng)上大量繁殖，數(shù)量上升迅速，導(dǎo)致松材線蟲(chóng)死亡。ΔganA與松材線蟲(chóng)共培養(yǎng)2 h 后，定殖量?jī)H有2.1×103CFU/頭，與AA4 具有顯著性差異；共培養(yǎng)12 h 后，定殖量也僅有7.2×103CFU/頭；共培養(yǎng)10 h后，定殖量上升幅度減?。▓D7A）?；騡anA的缺失導(dǎo)致AA4 在松材線蟲(chóng)上的定殖量顯著降低，定殖量的下降將影響細(xì)菌入侵、產(chǎn)毒過(guò)程，導(dǎo)致ΔganA殺松材線蟲(chóng)活性降低。

圖7 菌株AA4 與ΔganA 在松材線蟲(chóng)體上的定殖量隨時(shí)間變化趨勢(shì)（A），菌株AA4 與ΔganA 限制線蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)情況（B）Fig.7 The colonization of AA4 and ΔganA on pine wood nematode varied with time (A), restriction of nematode move by AA4 and ΔganA (B)

2.5 基因ganA 對(duì)路德維希腸桿菌AA4 限制線蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)能力的影響

該試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10 min 后，在AA4 細(xì)菌平板上僅有1 頭線蟲(chóng)產(chǎn)生了移動(dòng)距離，而在ΔganA細(xì)菌平板上，有5 頭線蟲(chóng)產(chǎn)生了移動(dòng)距離；20 min 后，在AA4 細(xì)菌平板上有5 頭線蟲(chóng)產(chǎn)生了移動(dòng)距離，在ΔganA細(xì)菌平板上，大部分線蟲(chóng)產(chǎn)生了移動(dòng)距離，且最遠(yuǎn)移動(dòng)距離達(dá)到38 mm；30 min 后，雖然在AA4 細(xì)菌平板上大部分線蟲(chóng)產(chǎn)生了移動(dòng)距離，但最遠(yuǎn)距離僅有15 mm，而在ΔganA細(xì)菌平板上，所有線蟲(chóng)都移動(dòng)了20～43 mm（圖7B）。結(jié)果表明路德維希腸桿菌AA4 有限制松材線蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)的能力。

3 討論

細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)是由細(xì)菌鞭毛逆時(shí)針或順時(shí)針旋轉(zhuǎn)引起的，細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性在細(xì)菌入侵宿主的初始階段促進(jìn)了細(xì)菌與宿主細(xì)胞的接觸幾率，同時(shí)鞭毛可作為黏附素與宿主細(xì)胞上的鞭毛受體結(jié)合，參與促進(jìn)黏附過(guò)程[35]。Swimming 運(yùn)動(dòng)是單個(gè)細(xì)菌在液體環(huán)境中依靠鞭毛的旋轉(zhuǎn)來(lái)進(jìn)行的。鞭毛不僅僅是一個(gè)細(xì)胞器，通過(guò)調(diào)整旋轉(zhuǎn)功率，控制細(xì)菌運(yùn)動(dòng)方式，幫助細(xì)菌向最適環(huán)境移動(dòng)，還是一種能夠檢測(cè)和轉(zhuǎn)導(dǎo)環(huán)境信號(hào)的傳感器，調(diào)節(jié)基因表達(dá)和第二信使活性。Swimming 運(yùn)動(dòng)促進(jìn)細(xì)菌找到理想的定殖位置，在生物膜的形成、共生和致病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，β-半乳糖苷酶編碼基因ganA，對(duì)路德維希腸桿菌AA4 殺松材線蟲(chóng)活性和松材線蟲(chóng)病防病能力都有顯著影響，同時(shí)基因ganA能夠影響路德維希腸桿菌AA4 在松材線蟲(chóng)上的定殖與限制松材線蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)的能力。當(dāng)基因ganA缺失時(shí)，路德維希腸桿菌AA4 的運(yùn)動(dòng)性受到顯著抑制。鞭毛的運(yùn)動(dòng)可以促進(jìn)細(xì)菌找到理想的定殖位置，傳導(dǎo)生物學(xué)信號(hào)，細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性是細(xì)菌在環(huán)境中定殖的關(guān)鍵，所以基因ganA是路德維希腸桿菌AA4 在松材線蟲(chóng)上定殖的關(guān)鍵基因，在細(xì)菌與宿主相互作用過(guò)程中，穩(wěn)定快速的定殖對(duì)細(xì)菌入侵，產(chǎn)毒，占據(jù)優(yōu)勢(shì)至關(guān)重要。松材線蟲(chóng)入侵松樹(shù)之后，大量繁殖并隨松樹(shù)輸導(dǎo)組織迅速遍布整株樹(shù)木[36]，路德維希腸桿菌AA4 能夠減緩松材線蟲(chóng)的運(yùn)動(dòng)性，這可以減緩松材線蟲(chóng)在松樹(shù)上的移動(dòng)，利于AA4 在松材線蟲(chóng)上定殖，發(fā)揮殺松材線蟲(chóng)功能，起到防治松材線蟲(chóng)病的效果，而基因ganA的敲除后，AA4 的運(yùn)動(dòng)性減弱，使其在松材線蟲(chóng)上的定殖能力顯著下降，進(jìn)而限制松材線蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)的能力減弱，生防效果降低。

在已報(bào)道的研究中，基因ganA的功能僅限于編碼β-半乳糖苷酶。β-半乳糖苷酶是一種糖苷外切酶，廣泛存在于多種細(xì)菌中能夠促進(jìn)乳糖轉(zhuǎn)化和利用，供給細(xì)菌的生長(zhǎng)[37]；在鏈球菌中，β-半乳糖苷酶與定殖宿主相關(guān)，熒光假單胞菌菌株CHA0 處理爪哇根結(jié)線蟲(chóng)幼蟲(chóng)的死亡率與β-半乳糖苷酶的活性呈正相關(guān)[19]，然而基因ganA與殺松材線蟲(chóng)活性相關(guān)為首次報(bào)道，并且基因ganA與細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性的關(guān)系也未見(jiàn)報(bào)道。鑒于基因ganA與β-半乳糖苷酶的普遍存在性，本研究不僅拓寬了基因ganA與β-半乳糖苷酶的研究方向，也為松材線蟲(chóng)病的防治提供了新穎思路。

在植物寄生線蟲(chóng)與植物互作過(guò)程中，線蟲(chóng)能夠感應(yīng)植物或者根際微生物釋放的化學(xué)信號(hào)而尋找寄主或遠(yuǎn)離惡劣環(huán)境[38]。AA4 具有限制松材線蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)的能力，這種能力既限制了松材線蟲(chóng)的逃脫，也利于其在松材線蟲(chóng)上定殖，發(fā)揮殺松材線蟲(chóng)的功能。在防治松材線蟲(chóng)病的過(guò)程中，這種能力可以降低松材線蟲(chóng)在植物中擴(kuò)散繁殖，以減少松材線蟲(chóng)的種群數(shù)量，達(dá)到防治效果。而基因ganA的敲除減弱了AA4 限制松材線蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)的能力，使松材線蟲(chóng)更容易逃脫，這對(duì)于AA4 防治松材線蟲(chóng)病活性的發(fā)揮造成了顯著影響。