許瑤，李可心，趙連梅，張洪濤?

①杭州賽得康生物科技有限公司，杭州 310000；②河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院 研究中心，石家莊 050011

1 獲獎(jiǎng)情況

北京時(shí)間2023年10月2日，諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)揭曉?？ㄋ?卡里科(Katalin Karikó)博士和德魯?魏斯曼(Drew Weissman)博士平分了這一獎(jiǎng)項(xiàng)。諾貝爾獎(jiǎng)委員會(huì)表示，他們對(duì)核苷堿基修飾的發(fā)現(xiàn)，使研發(fā)出有效的新冠病毒mRNA疫苗成為可能。

德魯?魏斯曼博士是美國(guó)賓夕法尼亞大學(xué)Perelman醫(yī)學(xué)院教授，卡塔琳?卡里科博士之前也在賓夕法尼亞大學(xué)工作，是魏斯曼博士的合作者(圖1)。兩人的研究成果在2005年發(fā)表，2023年就獲得諾貝爾獎(jiǎng)，前后歷時(shí)18年，在諾貝爾獎(jiǎng)歷史上算是比較快的。相比之下，屠呦呦在1971年就用乙醚提取了能抗瘧疾的青蒿素，在2020年才獲獎(jiǎng)，前后等待了49年。

圖1 卡里科(左)和魏斯曼(右)(照片由魏斯曼教授提供)

如今mRNA技術(shù)獲諾貝爾獎(jiǎng)，既在預(yù)料之外，但也在預(yù)料之中。在2021年，卡里科和魏斯曼已因mRNA技術(shù)獲得拉斯克(Lasker)臨床醫(yī)學(xué)研究獎(jiǎng)，而拉斯克獎(jiǎng)一直被譽(yù)為“諾貝爾獎(jiǎng)風(fēng)向標(biāo)”，很大比例的拉斯克獎(jiǎng)獲得者后來(lái)獲得了諾貝爾獎(jiǎng)。

卡里科和魏斯曼獲獎(jiǎng)格外引人注目，不但因?yàn)閮晌豢茖W(xué)家的發(fā)現(xiàn)所帶來(lái)的mRNA疫苗是大多數(shù)國(guó)家主要接種的新冠疫苗，影響了數(shù)十億人的生活，同時(shí)，作為獲獎(jiǎng)?wù)咧坏目ɡ锟撇┦坑兄鄣慕?jīng)歷，在簡(jiǎn)歷中有“移民”“癌癥患者”“科研經(jīng)費(fèi)申請(qǐng)被拒”“被迫離開(kāi)賓大”等關(guān)鍵詞。

在這里，我們將對(duì)mRNA技術(shù)的前世、今生和未來(lái)進(jìn)行解讀。

2 mRNA研究的歷史

信使核糖核酸(mRNA)并不是一個(gè)新概念。在細(xì)胞中，遺傳信息存儲(chǔ)于基因之中，但最后發(fā)揮功能的分子，通常是基因所編碼的蛋白。從基因到蛋白，中間的關(guān)鍵成分就是mRNA。

20世紀(jì)60年代，多位科學(xué)家的研究導(dǎo)致了mRNA的發(fā)現(xiàn)。1961年，悉尼?布倫納(Sydney Brenner)、弗朗索瓦?雅各布(Fran?ois Jacob)和馬修?梅塞爾森(Matthew Meselson)三位科學(xué)家，用感染了噬菌體的細(xì)菌來(lái)證明mRNA的存在[1]。實(shí)驗(yàn)表明，mRNA非常不穩(wěn)定，而相對(duì)穩(wěn)定存在的核糖體，只是一個(gè)承載mRNA的結(jié)構(gòu)，自身并不攜帶特殊的遺傳信息。從基因到mRNA，被稱(chēng)為“轉(zhuǎn)錄”；從mRNA到蛋白，被稱(chēng)為“翻譯”。值得一提的是，布倫納之后專(zhuān)注于秀麗隱桿線蟲(chóng)的研究，并因發(fā)現(xiàn)器官發(fā)育和細(xì)胞程式化凋亡的遺傳調(diào)控機(jī)理于2002年獲得諾貝爾獎(jiǎng)。

1961年，通過(guò)一個(gè)源自細(xì)菌的體外翻譯系統(tǒng)，馬歇爾?尼倫伯格(Marshall Nirenberg)的實(shí)驗(yàn)室首先破譯了第一個(gè)密碼：編碼苯丙氨酸的密碼子UUU。這個(gè)無(wú)細(xì)胞的系統(tǒng)包含有各種游離的氨基酸，當(dāng)把一段由一連串尿嘧啶(U)組成的人工RNA模版添加到翻譯系統(tǒng)中之后，同位素標(biāo)記的苯丙氨酸就能被整合到所編碼的蛋白中[2]。尼倫伯格因遺傳密碼的破譯獲得1968年的諾貝爾獎(jiǎng)。

既然編碼蛋白的遺傳信息都由mRNA攜帶，是否可以將mRNA作為疫苗或者藥物的形式，直接注射到人體中，從而達(dá)到免疫或治療的目的呢？這是一個(gè)合理的想法，為實(shí)現(xiàn)這個(gè)想法，很多科學(xué)家做出了努力。但從理想到現(xiàn)實(shí)，其中有很多難關(guān)要過(guò)。

起初是mRNA合成問(wèn)題。1984年，哈佛大學(xué)的道格拉斯?梅爾頓(Douglas Melton)團(tuán)隊(duì)利用RNA合成酶在實(shí)驗(yàn)室合成得到具有生物活性的mRNA，并將其注射到青蛙卵子中，證明它與自然產(chǎn)生的mRNA有著一樣的功能[3]。1987年，梅爾頓參與創(chuàng)立了一家名為Oligogen的公司，該公司后更名為吉利德科學(xué)公司(Gilead Sciences)。但是，在此后的30年里，該公司也沒(méi)有成功研制出mRNA藥物。

3 卡里科和魏斯曼解決的關(guān)鍵問(wèn)題

1985年，卡里科從匈牙利到了美國(guó)，開(kāi)始了艱辛的科研和生活之路。1989年，卡里科來(lái)到賓夕法尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院埃利奧特?巴納森(Elliot Barnathan)實(shí)驗(yàn)室，身份是助理研究員。次年，巴納森離開(kāi)了賓夕法尼亞大學(xué)，卡里科要想在賓夕法尼亞大學(xué)留下，就必須成為獨(dú)立研究員，但過(guò)程非常不順利。

1990年，卡里科第一次為mRNA項(xiàng)目申請(qǐng)科研經(jīng)費(fèi)，很不幸，沒(méi)有成功。1995年，由于接連幾年申請(qǐng)不到科研基金，卡里科已經(jīng)很難繼續(xù)留在賓夕法尼亞大學(xué)。更加不幸的是，卡里科還被診斷出患有癌癥。

到了1997年，卡里科遇到剛剛加入賓夕法尼亞大學(xué)的魏斯曼教授，二人開(kāi)始合作，mRNA的科研得以繼續(xù)。

mRNA研究面對(duì)的一個(gè)大難題是mRNA不穩(wěn)定。注射入人體之后，免疫系統(tǒng)會(huì)將mRNA分子視為“異物”，對(duì)其實(shí)施攻擊，使其降解，mRNA所攜帶的信息根本無(wú)法有效地傳遞，導(dǎo)致體內(nèi)無(wú)法產(chǎn)生相應(yīng)的蛋白。

魏斯曼教授原來(lái)的研究方向是樹(shù)突細(xì)胞，這是一種在免疫監(jiān)視和免疫應(yīng)答中有著重要功能的免疫細(xì)胞?？ɡ锟婆c魏斯曼的合作，重點(diǎn)研究的是免疫系統(tǒng)對(duì)不同類(lèi)型RNA的識(shí)別?？ɡ锟婆c魏斯曼所做的工作，就是mRNA的“化妝師”，通過(guò)給mRNA進(jìn)行修飾或者“易容”，尋找一種可以逃避免疫系統(tǒng)監(jiān)視的方法。

經(jīng)過(guò)數(shù)年的努力，他們最終找到了一種“易容術(shù)”。RNA的組成為腺嘌呤(A)、尿嘧啶(U)、鳥(niǎo)嘌呤(G)和胞嘧啶(C)四種堿基，哺乳動(dòng)物細(xì)胞中RNA的核苷酸堿基經(jīng)常被化學(xué)修飾，而體外轉(zhuǎn)錄合成的mRNA則沒(méi)有。正是由于這個(gè)差別，才導(dǎo)致免疫系統(tǒng)能夠清晰地識(shí)別外源的mRNA。

2005年，他們發(fā)表的研究顯示(圖2)，將外源的mRNA進(jìn)行一些特殊的修飾(如m5C、m6A、m5U、s2U或使用假尿苷替代尿苷)之后，免疫系統(tǒng)就失去了監(jiān)視能力，即便面對(duì)這些外源的mRNA，也不會(huì)出現(xiàn)免疫反應(yīng)[4]。

圖2 卡里科與魏斯曼在2005年發(fā)表的論文[4]

4 卡里科和魏斯曼沒(méi)有解決的問(wèn)題：mRNA的遞送

“易容術(shù)”并不是mRNA藥物所面臨的唯一難題。除了免疫系統(tǒng)，環(huán)境中和人體內(nèi)都有很多可以降解mRNA的酶。如果僅僅是將裸露的mRNA注射入人體，會(huì)被這些酶所降解。

mRNA因?yàn)橛珊塑账針?gòu)成，帶有很強(qiáng)的負(fù)電荷，自身很難穿透細(xì)胞膜?？ɡ锟婆c魏斯曼的“易容”，也沒(méi)有改變mRNA攜帶負(fù)電荷的特質(zhì)。一個(gè)簡(jiǎn)單的思路，是使用帶有正電荷的載體分子包裹住mRNA的負(fù)電荷，在遞送穿過(guò)細(xì)胞膜之后，再將mRNA釋放出來(lái)。

20世紀(jì)80年代，菲利普?費(fèi)爾格納(Philip Felgner)教授(現(xiàn)任加州大學(xué)歐文分校疫苗研發(fā)中心主任)開(kāi)發(fā)出了一種帶正電荷的脂質(zhì)體。后來(lái)，Salk研究所一個(gè)叫作羅伯特?馬隆(Robert Malone)的研究生使用了費(fèi)爾格納教授的脂質(zhì)體，將體外合成的mRNA遞送到了細(xì)胞內(nèi)。

1989年，馬隆提前終止了學(xué)業(yè)，加入了一家初創(chuàng)公司Vical，繼續(xù)脂質(zhì)體遞送的研究。這些脂質(zhì)體早期的工作，雖然讓mRNA的遞送看到了曙光，但并沒(méi)有找到mRNA和脂質(zhì)體的理想配方，因此并沒(méi)有實(shí)現(xiàn)商業(yè)化。在與魏斯曼合作之前，卡里科也在做一些陽(yáng)離子脂質(zhì)包裹RNA或DNA的工作[5]。

其他核酸藥物也需要遞送體系，比如基因沉默療法(siRNA)。加拿大不列顛哥倫比亞大學(xué)的生物化學(xué)家彼得?庫(kù)利斯(Pieter Cullis)的實(shí)驗(yàn)室建立了一套可以遞送核酸藥物的脂質(zhì)納米粒(lipid nanoparticle, LNP)系統(tǒng)，基于該遞送系統(tǒng)的藥物patisiran，已被FDA批準(zhǔn)用于治療一種罕見(jiàn)的遺傳性多發(fā)神經(jīng)性疾病——遺傳性甲狀腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的淀粉樣變性病(hATTR淀粉樣變性病)。

庫(kù)利斯創(chuàng)建了兩家LNP公司，其中一家公司Acuitas Therapeutics與魏斯曼教授及其他的mRNA公司合作，測(cè)試mRNA-LNP的不同配比。BioNTech的新冠疫苗正是基于其中的一個(gè)配方，Moderna公司的新冠疫苗所用的配方也很相似。

這種LNP的配方含有4種脂質(zhì)分子：其中的1個(gè)正電荷的脂質(zhì)比較關(guān)鍵，其他3個(gè)分子有助于遞送系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。與早期的脂質(zhì)體相比，LNP有一個(gè)特點(diǎn)：在人體體液中變成中性，因此能減少對(duì)人體的毒性。

5 新冠疫情：mRNA技術(shù)的風(fēng)口

雖然卡里科和魏斯曼的mRNA “易容術(shù)”已經(jīng)建立，且?guī)炖沟腖NP技術(shù)已經(jīng)成熟，但二者的結(jié)合，并沒(méi)有及時(shí)催生一款mRNA藥物。這其中一個(gè)關(guān)鍵的因素，是現(xiàn)代藥物的研發(fā)一般需要經(jīng)歷比較長(zhǎng)的時(shí)間，要完成臨床試驗(yàn)的研究，通過(guò)臨床證據(jù)來(lái)申請(qǐng)藥物的上市許可。此前，mRNA技術(shù)公司的產(chǎn)品研發(fā)管線主要是與腫瘤相關(guān)的疫苗，因?yàn)楫吘鼓[瘤是人類(lèi)的長(zhǎng)期敵人。

新冠疫情的到來(lái)，改變了世界，也改變了mRNA技術(shù)的發(fā)展軌道，它像一場(chǎng)大風(fēng)，把mRNA技術(shù)吹到了風(fēng)口浪尖。BioNTech和Moderna兩個(gè)mRNA公司，都及時(shí)瞄準(zhǔn)了新冠疫苗賽道。

采用mRNA技術(shù)制造疫苗(圖3)，有這樣4個(gè)優(yōu)勢(shì)：

圖3 mRNA 疫苗原理(圖片使用Figdraw制作)：mRNA通過(guò)特定遞送系統(tǒng)(LNP)導(dǎo)入人體，表達(dá)相應(yīng)的抗原蛋白，從而激發(fā)體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，進(jìn)而能對(duì)入侵的病毒快速應(yīng)對(duì)

(1)研發(fā)周期短。只要知道病毒的基因序列，就可以在數(shù)天內(nèi)設(shè)計(jì)出新型候選mRNA疫苗，在幾周內(nèi)就可以生產(chǎn)出樣品進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

(2)雙重作用機(jī)制。不需要佐劑，mRNA疫苗就能夠激發(fā)人體的體液免疫及T細(xì)胞免疫，免疫原性強(qiáng)。相比之下，傳統(tǒng)疫苗主要激活體液免疫，對(duì)于細(xì)胞免疫的激活較弱。

(3)沒(méi)有病毒成分。mRNA疫苗只是使用了合成的mRNA，靠這個(gè)片段來(lái)編碼病毒的一個(gè)蛋白，沒(méi)有直接來(lái)自病毒的成分，沒(méi)有病毒帶來(lái)的安全隱患。

(4)生產(chǎn)工藝相對(duì)簡(jiǎn)單。雖然mRNA疫苗屬于高技術(shù)，有技術(shù)壁壘，但一旦投入生產(chǎn)，工藝相對(duì)簡(jiǎn)單，易于大批量生產(chǎn)，特別適用于應(yīng)對(duì)重大疫情所產(chǎn)生的疫苗緊缺狀況。

2020年12月2日，英國(guó)批準(zhǔn)了BioNTech新冠疫苗BNT162b2的緊急使用。同年12月11日，美國(guó)也批準(zhǔn)了該款疫苗的緊急使用授權(quán)(emergency-use-administration, EUA)。這是歐美第一款緊急使用的新冠疫苗，在三期臨床試驗(yàn)中，這款疫苗顯示出了95%的保護(hù)率。從2020年3月立項(xiàng)到12月緊急使用批準(zhǔn)，在不到8個(gè)月的時(shí)間里走完全流程，這是破紀(jì)錄的！

2020年12月18日，Moderna的mRNA疫苗也在美國(guó)獲得了緊急批準(zhǔn)?？梢哉f(shuō)，如果沒(méi)有新冠疫情，第一款采用mRNA技術(shù)的產(chǎn)品，還不會(huì)那么快到來(lái)。

需要指出的是，很多人覺(jué)得2023年的諾貝爾獎(jiǎng)給了mRNA疫苗，這個(gè)理解是不對(duì)的。除了遞送mRNA的LNP技術(shù)，病毒的基因序列也是制造mRNA的關(guān)鍵?！扒蓩D難為無(wú)米之炊”，如果說(shuō)mRNA “易容術(shù)”和LNP是“巧婦”，那么新冠病毒的基因序列就是“米”。中國(guó)科學(xué)家首先公布了新冠病毒的基因序列，疫苗公司才可以基于此序列進(jìn)入疫苗研發(fā)的快車(chē)道。所以說(shuō)，如果要給新冠mRNA疫苗一個(gè)獎(jiǎng)，那么LNP和病毒基因的最先公布者都應(yīng)該分享。

從技術(shù)的角度來(lái)看，新冠疫情確實(shí)是對(duì)卡里科和魏斯曼的mRNA “易容術(shù)”的大檢驗(yàn)。如果沒(méi)有“易容術(shù)”，mRNA疫苗是否會(huì)成功？

為了避免使用“易容術(shù)”，CureVac公司通過(guò)改變mRNA序列所使用的密碼子，將尿嘧啶(U)減至最少。但新冠疫苗的臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，CureVac的候選新冠疫苗在保護(hù)效力方面不如Moderna或BioNTech的疫苗。2021年10月，CureVac宣布放棄mRNA管線。

中國(guó)的一家mRNA公司，同樣沒(méi)有使用“易容術(shù)”，但早期的臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，受試者中出現(xiàn)了更高的發(fā)熱比例，意味著副作用會(huì)更高。這應(yīng)該與未“易容”的核苷酸所誘發(fā)的免疫反應(yīng)有關(guān)。雖然該疫苗在境外也開(kāi)展了三期臨床試驗(yàn)，但是疫苗最終還是沒(méi)有獲批上市。

卡里科和魏斯曼剛開(kāi)始合作時(shí)，還沒(méi)有使用“易容術(shù)”，結(jié)果在測(cè)試HIV/AIDS 疫苗時(shí)，發(fā)現(xiàn)mRNA在注射到小鼠體內(nèi)后產(chǎn)生很強(qiáng)的炎癥反應(yīng)。這也是促使二位科學(xué)家著重研究“易容術(shù)”的原因?？ɡ锟坪臀核孤吹搅薽RNA疫苗的“坑”，使用“易容術(shù)”避開(kāi)了；其他人不認(rèn)為這是一個(gè)“坑”，然后用臨床試驗(yàn)證明了這確實(shí)是一個(gè)“坑”。

6 疫情后mRNA技術(shù)發(fā)展前景

世界迎來(lái)了mRNA技術(shù)，中國(guó)也沒(méi)有缺席。

在疫情的早期，BioNTech與復(fù)星就建立商業(yè)合作，復(fù)星負(fù)責(zé)大中華區(qū)的商業(yè)化。

中國(guó)的企業(yè)也獲得大量投資，開(kāi)展mRNA疫苗的研發(fā)。2023年3月，石藥的新冠疫苗獲批，是中國(guó)內(nèi)地獲批的首款mRNA疫苗，只是疫情時(shí)代已經(jīng)結(jié)束。中國(guó)所接種的新冠疫苗，主要是滅活疫苗。根據(jù)公開(kāi)的信息，中國(guó)內(nèi)地公司目前研發(fā)中的mRNA疫苗產(chǎn)品管線有流感疫苗、猴痘疫苗、狂犬病疫苗等。

在國(guó)外，繼新冠病毒疫苗之后，Moderna還有呼吸道合胞病毒 (respiratory syncytial virus,RSV)的mRNA疫苗在等待FDA批準(zhǔn)，有流感和巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus, CMV)的mRNA疫苗在進(jìn)行臨床試驗(yàn)。

雖然新冠病毒并沒(méi)有消失，但疫情已經(jīng)過(guò)去，即便趕上了新冠mRNA疫苗風(fēng)口的企業(yè)，也在調(diào)整戰(zhàn)略，以應(yīng)對(duì)疫情后的新局面。

在大中華區(qū)以外地區(qū)，BioNTech與輝瑞合作，輝瑞負(fù)責(zé)新冠疫苗的商業(yè)化。根據(jù)輝瑞的報(bào)道，2022年新冠疫苗的銷(xiāo)售額為378億美元。但是，輝瑞預(yù)測(cè)2023年新冠疫苗的銷(xiāo)售額將比2022年下降64%。面對(duì)消失的新冠疫苗市場(chǎng)，BioNTech 除了積極開(kāi)發(fā)針對(duì)其他傳染病的疫苗，也更加側(cè)重與腫瘤相關(guān)的管線[6-7]。

在疫苗領(lǐng)域，因?yàn)檠邪l(fā)周期短、生產(chǎn)工藝相對(duì)簡(jiǎn)單的特性，mRNA技術(shù)也在獸用疫苗領(lǐng)域獲得了關(guān)注。在畜牧業(yè)中，因?yàn)轲B(yǎng)殖密度較高，病毒容易在動(dòng)物中傳播，也更容易發(fā)生突變，能夠及時(shí)升級(jí)疫苗就變得更為重要，這是傳統(tǒng)滅活疫苗的痛點(diǎn)，卻是mRNA疫苗的亮點(diǎn)。

更重要的是，mRNA技術(shù)的運(yùn)用，已經(jīng)不僅限于疫苗。比如說(shuō)，將編碼Cas9的mRNA和引導(dǎo)RNA一起遞送到細(xì)胞甚至活體中，就可以實(shí)現(xiàn)基因編輯[8]?？梢灶A(yù)見(jiàn)，未來(lái)mRNA技術(shù)將助力基因編輯，尤其是其在活體中的運(yùn)用。利用mRNA技術(shù)，魏斯曼等科學(xué)家將動(dòng)物體內(nèi)的常規(guī)T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為治療性CAR-T細(xì)胞，并在心力衰竭的動(dòng)物模型中顯示出了治療效果[9]。

當(dāng)然，這些技術(shù)都還沒(méi)有完全成熟，還需要臨床試驗(yàn)的驗(yàn)證。同時(shí)，針對(duì)活體特定器官的靶向遞送，也是未來(lái)治療的關(guān)鍵，所以是目前mRNA研發(fā)的重點(diǎn)[10-11]。

縱觀mRNA技術(shù)的諾貝爾獎(jiǎng)歷史，其實(shí)就是無(wú)數(shù)科研工作者的奮斗史。他們前仆后繼地站在巨人的肩膀上奮斗，絕大多數(shù)人跟諾貝爾獎(jiǎng)無(wú)緣，很多人也許還會(huì)失去工作，為了生活尋找新的出路。

諾貝爾獎(jiǎng)給卡里科博士的曲折故事一個(gè)完美的結(jié)局，卻沒(méi)有給mRNA技術(shù)畫(huà)上句號(hào)。疫情讓mRNA技術(shù)走到了歷史舞臺(tái)的聚光燈下，而這僅僅是個(gè)開(kāi)始。