李兆棟，陳銀瀟，李佳穎，于智先，徐喆，龔博煬，閻皓，彭雁飛，趙舒武

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，天津 301617；2.天津市人民醫(yī)院腫瘤診療中心腫瘤1 科，天津 300312；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，天津 301617）

化療性腸黏膜炎（CIM）是癌癥患者在接受化學(xué)藥物治療過程中，腸黏膜受到損傷，腸道屏障功能發(fā)生障礙所引起的主要的劑量限制性不良反應(yīng)，主要臨床表現(xiàn)為嘔吐、腹瀉、腹痛等[1]。5-氟尿嘧啶（5-FU）是最常用的化療藥物之一，用于多種癌癥的治療，但是其導(dǎo)致CIM 的幾率高達80%，并且這些不良反應(yīng)在治療后會持續(xù)很長時間[2-4]。CIM 也是癌癥患者被迫停止化療的一個重要原因，會導(dǎo)致患者的治療效果不理想，嚴重影響患者的生活和生存質(zhì)量[5]。目前臨床上并無預(yù)防或治療CIM 的有效手段，因此，探索和開發(fā)防治CIM 的藥物和策略，對提高癌癥患者的治療效果及改善生存質(zhì)量具有積極的意義。

越來越多的證據(jù)表明，中藥在減輕化療不良反應(yīng)，尤其是胃腸道反應(yīng)方面具有顯著療效[6]。生脈散首見于《醫(yī)學(xué)啟源》，是益氣養(yǎng)陰的著名古方，由人參、麥冬、五味子組成，臨床常用于多系統(tǒng)的氣陰兩虛證的治療?，F(xiàn)代藥理研究表明，生脈散具有保護胃腸道的作用[7]。臨床研究表明，生脈散加味與生脈注射液（成分同為紅參、麥冬和五味子）都能夠顯著改善化療導(dǎo)致的胃腸道反應(yīng)，緩解骨髓抑制，提高化療效果[8-10]。但生脈制劑對化療所致結(jié)腸黏膜損傷的保護作用和機制尚不明確，本研究采用5-FU 致小鼠CIM 模型，探討生脈膠囊對化療導(dǎo)致的結(jié)腸黏膜損傷的保護作用，為進一步研究相關(guān)機制及臨床應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實驗動物 20 只雄性Balb/c 小鼠，6～8 周齡，體質(zhì)量20～22 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，動物許可證編號：SCXK（京）2019-0008。飼養(yǎng)于天津中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，飼養(yǎng)環(huán)境：普通飼料，期間動物自由進食、飲水，溫度 22～26℃，濕度 40%～70%，光照12 h。本研究經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會審查批準(zhǔn)，批號：TCM-LAEC2022131。

1.2 實驗藥物 生脈膠囊藥物成分為紅參、麥冬、五味子，購買自正大青春寶藥業(yè)有限公司（國藥準(zhǔn)字Z33021036），用蒸餾水重懸至所需濃度后進行灌胃。5-FU 購買自上海生工生物工程股份有限公司，批號H202BA0024。用0.1 mol/L 氫氧化鈉和依地酸二鈉溶至蒸餾水中配制成pH 值為8.5～8.9 的溶劑，將其與5-FU 干粉配置所需濃度進行腹腔注射。

1.3 主要實驗試劑與儀器 二胺氧化酶（DAO）活性檢測試劑盒（北京盒子生工科技有限公司，批號為1012201071）；免疫組化試劑盒、ki67 抗體（均購于武漢三鷹有限公司，批號分別為30202104、27309-1-AP）；檸檬酸鈉抗原修復(fù)液、增強型二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒、糖原PAS 染色試劑盒（均購于北京索萊寶科技有限公司，批號分別為20191128、20220614、20221104）；電子天平（上海天平儀器廠，JA1003）；石蠟切片機（Leica，RM2235）；電動倒置研究型生物顯微鏡（奧林巴斯公司，Ⅸ81）；離心機（Thermo Scientific，Sorvall Legend Micro 17R）。

2 方法

2.1 動物造模與分組 20 只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后隨機分為3 組，正常組（CTRL）5 只、模型組（FU）7 只、生脈組（FU+SM）8 只。參考Zhang 等[11]造模方法制備小鼠化療性腸黏膜炎模型。除正常組外，其余兩組小鼠分別于第1～3 天和第6～8 天腹腔注射5-FU 溶液（25 mg/kg），每日1 次。以體質(zhì)量下降、腹瀉和組織病理學(xué)損傷程度作為造模成功標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 給藥方法 生脈組：以生脈膠囊懸液灌胃（350 mg/kg，參考說明書及《藥理實驗方法學(xué)》換算成小鼠給藥劑量），每日1 次，連續(xù)10 d；正常組和模型組灌胃等量蒸餾水，每日1 次，連續(xù)10 d。

2.3 觀察指標(biāo)與方法

2.3.1 小鼠體質(zhì)量和腹瀉情況觀察 每日給藥之前對各組小鼠體質(zhì)量進行記錄，每兩日對小鼠腹瀉情況進行一次評估，用干凈的濾紙收集每組小鼠1 h內(nèi)排出的糞便，以糞便周圍有明顯污跡定為稀便，每組稀便比例=稀便數(shù)/總糞便數(shù)。具體方法參考Yim 等[12]改進的糞便收集方法，對每組小鼠稀便情況進行比較分析。

2.3.2 樣本采集 小鼠末次給藥后禁食 12 h，不限飲水，摘取小鼠眼球收集血液，以4 000 r/min 離心10 min，離心半徑為8.3 cm，分離血清，置于-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆?。頸椎脫臼處死小鼠，剖腹收集從盲腸到肛門處的結(jié)腸，觀察形態(tài)并測量長度，取近盲腸端2 cm 結(jié)腸，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗干凈后放入4%多聚甲醛固定，24 h 更換固定液1 次，固定48 h。

2.3.3 結(jié)腸的組織病理學(xué)觀察 將4%多聚甲醛中固定的結(jié)腸進行梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，石蠟包埋塊切片厚度為5 μm，進行蘇木精-伊紅（HE）染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠結(jié)腸的組織病理改變。

2.3.4 血清中二胺氧化酶（DAO）活性的測定 血清中 DAO 的活性用DAO 活性檢測試劑盒進行測定，所有操作方法嚴格按照試劑盒說明書步驟進行。

2.3.5 免疫組織化學(xué)法檢測結(jié)腸黏膜中 ki67 的表達 取結(jié)腸石蠟切片，經(jīng)烤片、脫蠟；3%過氧化氫去除內(nèi)源性過氧化氫酶；檸檬酸鈉溶液進行抗原修復(fù)；5%山羊血清封閉；加入ki67 抗體（稀釋比1∶1 000）4 ℃孵育過夜；次日復(fù)溫，加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗室溫孵育30 min；DAB 顯色；蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封片。光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照，棕色為陽性表達。采用Image-Pro Plus 圖像分析軟件分析平均OD 值。

2.3.6 PAS 染色法檢測結(jié)腸黏膜中杯狀細胞的數(shù)量 取結(jié)腸石蠟切片，脫蠟入蒸餾水，后續(xù)所有操作方法嚴格按照糖原PAS 染色試劑盒說明書步驟進行，紅色或紫紅色為PAS 反應(yīng)陽性物質(zhì)。光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析與作圖，所有計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。多組間采用單因素方差分析進行比較，組間多重比較采用LSD 法，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 生脈膠囊改善5-FU 所致腸黏膜炎小鼠結(jié)腸縮短和腹瀉情況 與正常組小鼠比較，模型組小鼠體質(zhì)量從第3 天開始顯著下降，到第10 天一直呈持續(xù)下降的趨勢；稀便比例顯著升高。與模型組小鼠比較，生脈組小鼠體質(zhì)量下降情況有改善的趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），稀便比例則顯著降低（見圖1A、表1）。與正常組小鼠比較，模型組小鼠結(jié)腸明顯縮短（P＜0.05），而生脈膠囊能夠顯著改善結(jié)腸縮短，增加小鼠結(jié)腸長度（P＜0.05）（見圖1B、1C）。表明生脈膠囊對于5-FU 所致腸黏膜炎小鼠結(jié)腸縮短、腹瀉嚴重的情況有明顯的改善作用。

表1 生脈膠囊對5-FU 所致腸黏膜炎小鼠腹瀉比例的影響Tab.1 Effect of Shengmai capsule on the proportion of diarrhea in mice with 5-FU induced intestinal mucositis%

3.2 生脈膠囊減輕 5-FU 所致腸黏膜結(jié)構(gòu)和腸屏障損傷 光鏡下可見正常組小鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)完整，組織排列整齊，杯狀細胞豐富，無炎性細胞浸潤；模型組小鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)模糊，隱窩腺體缺損或消失，杯狀細胞減少，炎性細胞浸潤顯著；而生脈組小鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)較模型組顯著改善，隱窩腺體結(jié)構(gòu)明顯修復(fù)，可見增多的杯狀細胞，仍見明顯的炎細胞浸潤（見圖2A）。與正常組小鼠比較，模型組小鼠血清中 DAO 活性顯著升高（P＜0．01），而與模型組相比，生脈膠囊能夠顯著降低小鼠血清中的DAO活性（P＜0．01）（見圖2B）。表明生脈膠囊對5-FU 所致腸黏膜炎小鼠的結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)和腸屏障損傷具有明顯的改善作用。

圖2 生脈膠囊對5-FU 所致腸黏膜炎小鼠結(jié)腸病理形態(tài)及腸屏障損傷的影響Fig.2 Effect of Shengmai capsule on the pathological morphology and intestinal barrier damage of the colon in mice with 5-FU induced intestinal mucositis

3.3 生脈膠囊促進5-FU 所致結(jié)腸黏膜損傷后的腸上皮細胞增殖及分化 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，模型組小鼠結(jié)腸中的ki67 陽性細胞數(shù)較正常組小鼠顯著升高 （P＜0．000 1），而與模型組小鼠比較，生脈組小鼠結(jié)腸中 ki67 陽性細胞數(shù)進一步增高（P＜0．000 1）（見圖3A、3B）。PAS 染色結(jié)果顯示，與正常組小鼠比較，模型組小鼠結(jié)腸黏膜上皮中的杯狀細胞數(shù)量明顯減少，而與模型組小鼠比較，生脈組小鼠結(jié)腸黏膜上皮中杯狀細胞數(shù)量明顯增多（見圖3C）。表明生脈膠囊能夠促進5-FU 所致小鼠結(jié)腸黏膜損傷后的腸上皮細胞的增殖及分化。

圖3 生脈膠囊對5-FU 所致腸黏膜炎小鼠結(jié)腸黏膜中的細胞增殖及分化的影響Fig.3 Effect of Shengmai capsule on cell proliferation and differentiation in the colon mucosa of mice with 5-FU induced intestinal mucositis

4 討論

化療是臨床治療腫瘤的常用手段，但藥物在殺傷腫瘤細胞的同時，也會對正常組織和細胞造成損傷[11]。腸黏膜炎是化療患者最常見的不良反應(yīng)，其主要臨床癥狀表現(xiàn)為厭食、惡心、嘔吐、腹瀉和腹痛，還可能表現(xiàn)出感染性休克和多器官功能障礙等更嚴重的癥狀[1]。中醫(yī)認為，化療藥物在影響腫瘤細胞的同時也會使人體的正氣損耗，氣血不足，陰陽失調(diào)，引起五臟六腑的損傷，其主要病位在脾腎，早期的主要表現(xiàn)為胃腸道的損害，又因化療藥物屬于陽邪，具有“熱”的特性，傷津耗氣，因此中醫(yī)治療化療導(dǎo)致的腸黏膜炎多以益氣生津為主[13-15]。本研究所采用的生脈膠囊是在傳統(tǒng)名方“生脈散”基礎(chǔ)上應(yīng)用現(xiàn)代制劑技術(shù)制成的中成藥口服膠囊，藥物成分為紅參、麥冬、五味子，紅參作為主藥，發(fā)揮補氣、生津之效；麥冬作為輔藥，養(yǎng)陰生津，配伍紅參，共同發(fā)揮氣陰雙補之功效；五味子作為佐使藥，具有斂肺止汗、益氣生津的功效。三藥合用能起到養(yǎng)陰生津，益氣復(fù)脈之功效[7]。

作為最常用的化療藥物之一，5-FU 也被用來誘導(dǎo)CIM 小鼠模型，其特征為腹瀉、體質(zhì)量減輕、腸黏膜完整性和腸隱窩被破壞等，并且其嚴重程度與5-FU 的劑量呈現(xiàn)正相關(guān)性[11，16]。在本研究中，與正常組比較，5-FU 誘導(dǎo)的CIM 模型組小鼠體質(zhì)量顯著降低，腹瀉比例也顯著升高，結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)明顯被破壞，表明成功構(gòu)建CIM 模型。有研究[8-10]顯示，以生脈散為基礎(chǔ)的生脈類方能夠減少化療帶來的胃腸道反應(yīng)，改善患者生活質(zhì)量。一項臨床數(shù)據(jù)分析[17]表明，中醫(yī)在治療與化療性腸黏膜炎有著相同發(fā)病機制且同為化療患者常見的不良反應(yīng)化療性口腔黏膜炎時，使用最多的藥物就是麥冬等養(yǎng)陰生津之品。而五味子多糖也被證實能夠改善化療引起的腸道黏膜炎癥狀[18]。本研究結(jié)果還顯示，生脈膠囊能夠改善CIM 小鼠的腹瀉情況，增加結(jié)腸長度，減輕結(jié)腸的組織病理損傷，結(jié)合相關(guān)研究及數(shù)據(jù)分析，可以表明生脈膠囊對化療性腸黏膜炎具有保護作用。

腸道黏膜是抵御外界環(huán)境最重要的屏障之一，CIM 這類腸道炎癥可破壞腸屏障結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致腸屏障功能受損[19-21]。DAO 是存在于腸黏膜上皮細胞中的一種反映腸道機械屏障的完整性和受損傷程度的細胞內(nèi)酶，它能夠調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的離子平衡、影響傳導(dǎo)通路、促進細胞修復(fù)，對腸黏膜具有保護作用[22]。正常機體血清中 DAO 活性很低，當(dāng)腸黏膜受到損傷時，會導(dǎo)致血清中 DAO 活性增高，因此血清 DAO活性是反映腸黏膜損傷程度的理想指標(biāo)[22-24]。在5-FU 誘導(dǎo)的模型組小鼠中可以觀察到，結(jié)腸黏膜被破壞，血清中 DAO 活性顯著增加，而經(jīng)過生脈膠囊治療的小鼠其結(jié)腸黏膜損傷得到改善，血清中的DAO活性顯著降低，這表明生脈膠囊能夠在一定程度上減輕 5-FU 導(dǎo)致的腸道屏障損傷。

5-FU 等化療藥物引起的腸黏膜炎，損害胃腸道黏膜的過程可以概括為5 個階段，開始、初級損傷反應(yīng)、信號放大、潰瘍和愈合[25]。而最后1 個階段是通過上皮細胞的增殖和分化來實現(xiàn)腸屏障的重建和愈合[16，26]，促進腸屏障的愈合也是治療CIM 這類腸道炎癥的關(guān)鍵[20]。由上皮細胞分化的杯狀細胞已經(jīng)被證明對維持結(jié)腸黏液屏障功能至關(guān)重要，它的缺失也是結(jié)腸炎的標(biāo)志[27]。表達在細胞核中的蛋白ki67 是使用最廣泛的增殖標(biāo)志物之一，本研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠結(jié)腸ki67 表達高于正常組，表明5-FU 導(dǎo)致的結(jié)腸黏膜損傷激活了腸道修復(fù)，而與模型組相比，生脈膠囊組進一步提高了ki67 的表達，另外，與模型組比較，生脈膠囊可明顯提高結(jié)腸組織中杯狀細胞的數(shù)量，表明生脈膠囊可能進一步增強了5-FU 導(dǎo)致的結(jié)腸黏膜損傷后的修復(fù)能力。

綜上所述，生脈膠囊通過減輕結(jié)腸組織的損傷，促進結(jié)腸上皮細胞的增殖與分化來緩解小鼠腸道屏障損傷，加快損傷后腸黏膜的修復(fù)。證明生脈膠囊對5-FU 導(dǎo)致的結(jié)腸黏膜損傷具有較好的保護作用，但其機制尚不明確，還有待進一步研究。