楊玉

（福清市產(chǎn)品質量檢驗所，福建 福清 350300）

0 引言

小球藻作為一種綠藻，在微藻中有重要研究地位，其含有蛋白質、氨基酸、維生素、礦物質、β胡蘿卜素、葉綠素、脂肪酸以及其他促進健康的物質，它被認為是21世紀功能和治療效果的預防性營養(yǎng)素[1,2]。小球藻有抗炎癥、抗腫瘤、降血壓、抗菌、降血脂以及增強免疫力等藥理活性，但其在降血糖和抗氧化的活性方面卻很少被研究[3,4]。越來越多的研究顯示抗氧化是預防衰老死亡的重要步驟，如果能夠消除過多的氧化自由基，對于許多自由基引起的老化相關疾病都能夠預防[5]。魏文志通過清除羥自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基、烷基自由基、還原力等試驗，測定小球藻糖蛋白的抗氧化活性。結果顯示，不同濃度小球藻糖蛋白有一定的還原能力，且具有清除羥自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基、烷基自由基的能力，其還原能力和清除自由基的能力與劑量有一定的效應關系[6]。Jeong等研究表明小球藻粉末的攝入可能可以改善T2DM和正常Wistar大鼠的胰島素敏感性[7]。Wang等[8]研究發(fā)現(xiàn)，蛋白核小球藻多肽能夠抑制人肝癌HepG2細胞活性。

近年來患有糖和脂質代謝紊亂的人數(shù)呈指數(shù)增長，逐漸成為人們擔心的問題。糖脂代謝紊亂是導致肥胖、高血壓、炎癥、高血脂、冠心病等疾病的關鍵因素，因此，如何預防和治療由糖脂代謝紊亂導致的一系列的慢性代謝綜合征是人們迫切需要解決的問題。小球藻中含有的豐富的多不飽和脂肪酸，奠定了其調血壓、降血脂的基礎，因此能夠預防動脈粥樣硬化、高血脂和冠心病等多種慢性疾病[9]。之前的研究主要是圍繞小球藻多糖、多肽等活性物質進行研究，本實驗主要研究小球藻醇提物（CAE）的體外抗氧化、降血糖活性，為充分利用小球藻資源，開發(fā)小球藻功能性食品或醫(yī)藥保健品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料

DPPH購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；ABTS、α-葡萄糖苷酶、p-NPG購于上海源葉生物科技有限公司；阿卡波糖購于上海安耐吉化學有限公司；蛋白定量測試盒購于南京建成生物工程公司，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器與設備

電子天平（BSA423S）北京賽多利斯科學儀器有限公司；酶標儀（SpectraMax i3x）上海美谷分子儀器有限公司；低速臺式離心機（TD5A-WS）湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9203A）上海精宏實驗設備有限公司；旋轉蒸發(fā)儀（SENCO W2-100SP）上海申生科技有限公司；雙頻數(shù)控超聲波清洗器（KQ-500VDE）昆山市超聲儀器有限公司；低溫恒溫槽（DC-M-0506）上海衡平儀器儀表廠；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-6）常州國華電器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 CAE的制備

將100 g小球藻粉末按料液比 1∶10（g/mL）溶于70%乙醇，攪拌混勻，45～50 ℃水浴超聲輔助提取1 h，然后過濾，離心，取上清液，將上清液置于旋轉蒸發(fā)儀在60 ℃進行減壓濃縮后凍干，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 CAE成分分析

⑴ 總糖含量的測定

將烘干的葡萄糖作為對照品，準確稱取0.02 g并加純水定容至10 mL（2 mg/mL），取上述溶液1 mL加9 mL純水使對照品溶液終濃度為0.2 mg/mL，而后按照不同稀釋比配制0、10、20、50、100、200 μg/mL的葡萄糖標液。精確稱取待測樣品0.002 g配置成200 μg/mL的樣品溶液。

上述溶液準備完畢后，分別取0.5 mL溶液于15 mL玻璃管中，加入0.5%苯酚溶液0.5 mL，再加入2.5 mL濃硫酸，混勻后置于100 ℃水浴鍋中煮沸10 min，并冷卻至室溫。取200 μL混勻的溶液于96孔板中，在490 nm波長下測定吸光度值。以吸光度值為縱坐標，葡萄糖標液濃度為橫坐標（μg/mL）繪制標準曲線，并根據(jù)樣品吸光度值得到糖含量，最終計算出總糖含量。

⑵ 蛋白含量的測定

按試劑盒說明書操作，在96孔板中加入10 μL待測樣品與250 μL工作液混勻，標準孔以10μL 濃度為524 μg/mL蛋白標準液代替樣品，空白孔以10 μL雙蒸水代替樣品，置于水浴鍋37 ℃水浴30 min。酶標儀562 nm波長處測定吸光值，每組設置3個平行。

總蛋白濃度（μg/mL）=[(A樣品-A空白)/(A標準-A空白)]×標準品濃度×樣品稀釋倍數(shù)

⑶ 多酚含量的測定

參照吳曉青的方法[10]準確稱取0.l g沒食子酸，用50 mL蒸餾水溶解，定容至100 mL，得到質量濃度為1000 mg/L的沒食子酸標準儲備液，分別取標準儲備液0、1.25、2.5、5、10、20、40 mL于100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，配制質量濃度為0、12.5、25、50、100、200、400 mg/L的系列標準溶液。

稱取2 g樣品，與20 mL蒸餾水混合均勻。置于離心機3000 r/min轉速離心10 min后，取其上清液，稀釋50倍。吸取1 mL樣品液于15 mL的試管中，分別加入1 mL福林酚顯色劑及3 mL 20% 的Na2CO3，混合均勻。在50 ℃水浴條件下水浴30 min，設定酶標儀波長765 nm測定吸光度。各項濃度做3個平行測定，計算平均值，根據(jù)平均值繪制標準曲線，得出吸光度值A與沒食子酸標準溶液濃度之間的回歸方程，計算總酚含量。

1.3.3 CAE體外活性的研究

⑴ DPPH自由基清除率

參考李倩茹的方法[11]。配制濃度分別為0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL的CAE水溶液，樣品組在離心管中分別加入100 μL不同濃度的多糖待測液與100 μL DPPH（0.1 mmol/L，無水乙醇溶液）混合?？瞻捉M以100 μL無水乙醇代替DPPH，對照組以100 μL蒸餾水代替樣品溶液作對照，混合均勻后于室溫下避光30 min后，使用酶標儀在517 nm波長下測吸光度。

DPPH自由基清除能力的計算公式為：DPPH自由基清除率（%）=[1-(A樣品-A空白)/A對照]×100%

⑵ ABTS自由基清除率

參考孟慶煥的方法[12]。將ABTS溶液用PBS(pH值7.4）稀釋至在734 nm處吸光度為0.70±0.02。在離心管中分別加入50 μL不同濃度（0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL)CAE與150 μL ABTS工作液混勻，在30 ℃下水浴3 min，于酶標儀734 nm處測量其吸光度。以150 μL PBS代替ABTS工作液作為空白組，以50 μL蒸餾水代替樣品作對照組。

ABTS自由基清除能力的計算公式為：

⑶ 羥自由基清除率

根據(jù)Pu的方法[13]配制濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的CAE水溶液，樣品組在離心管中分別加入500 μL不同濃度樣品、500 μL FeSO4溶液（18 mmol/L）與500 μL水楊酸（10 mmol/L）混勻。在37 ℃下孵育10 min后，加入500 μL H2O2溶液（6 mmol/L）混勻，再次置于水浴鍋37 ℃水浴30 min，以510 nm波長測定吸光度?？瞻捉M以1500 μL蒸餾水代替水楊酸、FeSO4溶液以及H2O2溶液，對照組以500 μL蒸餾水代替樣品。

羥基自由基清除能力的計算公式為：

⑷ α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定

配制濃度分別為6.25、12.5、25、37.5 μg/mL的多糖水溶液，CAE各取不同濃度的樣品液30 μL，在37 ℃下保溫5 min后，分別加入α-葡萄糖苷酶液30 μL，在37 ℃下保溫10 min，然后加入30 μL p-NPG溶液反應15 min，再加入100 μL 0.1 mol/L的Na2CO3終止反應，在405 nm處測定吸光度?？瞻捉M以60 μL PBS代替酶液與p-NPG溶液，對照組以30 μL PBS代替樣品。試驗以相同濃度梯度的阿卡波糖作為陽性對照，重復上述操作，并設置平行。

α-葡萄糖苷酶抑制率的計算公式為：

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel進行統(tǒng)計分析，結果用Mean±SD表示，采用Graphpad prism 7.0.對相關數(shù)據(jù)進行作圖。

2 結果與分析

2.1 總糖、蛋白、多酚含量

根據(jù)所測數(shù)據(jù)繪制CAE總糖含量標準曲線，以沒食子酸濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，進行線性回歸，得標準曲線方程：y=0.0013x+0.0059,R2=0.9963。將數(shù)據(jù)代入公式計算CAE的總糖含量，得到總糖占比為9.6 %。根據(jù)所測數(shù)據(jù)繪制CAE多酚含量標準曲線，得標準曲線方程：y=0.0099x+0.0981,R2=0.9921。

將數(shù)據(jù)代入公式計算CAE的多酚含量，得到多酚占比為1.68%。將所得OD平均值代入總蛋白濃度公式，計算CAE的蛋白質含量，得到CAE的蛋白質含量為26.96%。

2.2 CAE對DPPH自由基的清除作用

DPPH自由基是一種穩(wěn)定的有機自由基，常用來測定樣品是否具有抗氧化活性[14]。以Vc為對照測定CAE對DPPH自由基的清除率結果如圖1所示。由圖1可知，CAE在3～5 mg/mL時，對DPPH自由基的清除率與提取物濃度呈劑量關系，當 CAE濃度達到5 mg/mL時，清除率達到81.86%；相同濃度Vc的清除率為94.50%。實驗結果顯示，在實驗質量濃度范圍內CAE對DPPH自由基顯示出良好的清除活性。

圖1 CAE和Vc的DPPH自由基清除率

2.3 CAE對ABTS自由基的清除作用

ABTS自由基經(jīng)氧化會形成較為穩(wěn)定的藍綠色自由基，被普遍用于測定樣品的抗氧化能力。以Vc為對照測定CAE對ABTS自由基的清除率結果如圖2所示。由圖2可知，CAE在3～5 mg/mL時，其對ABTS自由基的清除率與提取物濃度呈劑量關系，當 CAE濃度達到5 mg/mL時，清除率達到97.78%。實驗結果顯示：在實驗質量濃度范圍內CAE對ABTS自由基顯示出良好的清除活性。

圖2 CAE和Vc的ABTS自由基清除率

2.4 CAE對羥自由基的清除作用

以Vc為對照測定CAE對羥自由基的清除率結果如圖3所示。由圖3可知，在3～5 mg/mL時，Vc對羥自由基的清除率遠遠大于CAE的清除率，濃度為4.5 mg/mL時Vc最大清除率為110.83%，而小球藻提取物清除率最大值僅有12.49%。CAE對羥自由基的清除率較不理想，且與濃度無明顯劑量依賴關系。

圖3 CAE和Vc的羥自由基清除率

2.5 CAE抑制α-葡萄糖苷酶活性的結果

α-葡萄糖苷酶是一種糖苷水解酶，具有抑制作用靶點，可被作用于調節(jié)體內糖代謝水平，目前，阿卡波糖等α-葡萄糖苷酶抑制劑已經(jīng)成為一種成熟的治療糖尿病的藥物。α-葡萄糖苷酶對碳水化合物具有消化作用，可以有效減緩人體消化過程中對碳水化合物的降解，減緩其吸收速度，從而達到降低餐后高血糖水平的目的[15]。以阿卡波糖為對照測定CAE對α-葡萄糖苷酶的抑制率結果如圖4所示。由圖4可知，CAE在0～25 μg/mL時，其對α-葡萄糖苷酶的抑制率與提取物濃度呈劑量關系，當 CAE濃度達到25 μg/mL時，清除率達到最大91.24%。

圖4 CAE和阿卡波糖的α-葡萄糖苷酶抑制率

3 結論

本研究以蛋白核小球藻為原料用乙醇進行提取，結果表明小球藻醇提物（CAE）中總糖含量為38.27%，蛋白含量為26.96%，多酚含量為1.68%。當 CAE濃度為5 mg/mL時，DPPH自由基與ABTS自由基清除率分別為81.86%、97.78%；CAE對α-葡萄糖苷酶的活性有抑制作用，在0～25 μg/mL濃度范圍內，其抑制率最大為91.24%。

綜上所述，選用小球藻的活性物質進行提取分離，具有較高的經(jīng)濟效益，后續(xù)可開展CAE的體內降糖與抗衰老研究，并對CAE進行分離純化，為CAE開發(fā)出具有抗氧化及降糖作用的功能性產(chǎn)品提供基礎。