柯振華

[福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院 國家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（福州），福建 福州 350002]

0 引言

冷鏈?zhǔn)称肥侵感枰谡麄€(gè)供應(yīng)鏈過程中保持低溫環(huán)境的食品，這種供應(yīng)鏈包括從生產(chǎn)、加工、運(yùn)輸?shù)戒N售的各個(gè)環(huán)節(jié)。冷鏈?zhǔn)称吠ǔ０ㄉr食品（如肉類、海鮮、蔬菜、水果等）和冷凍食品（如冷凍肉類、冷凍水餃等）[1,2]。為了保持食品的低溫狀態(tài)，冷鏈?zhǔn)称吠ǔＰ枰褂脤ｉT的冷藏設(shè)備、保鮮包裝和運(yùn)輸工具，這樣可以延長食品的保質(zhì)期，減少食品損耗，并確保消費(fèi)者能夠購買到新鮮和安全的食品[3]。

食源性病毒是指通過食物傳播的病毒感染，這些病毒通常通過被病毒污染的食物或飲水進(jìn)入人體，引發(fā)消化系統(tǒng)的疾病，常見的食源性病毒包括諾如病毒、輪狀病毒、腸炎病毒、腺病毒等[4-7]。食源性病毒可以通過多種途徑傳播，如不潔食物處理、食品交叉污染、生食食品、未充分烹飪的食物等。一旦食物被病毒污染，食用后就有可能感染病毒。食源性病毒感染的癥狀通常包括腹瀉、嘔吐、發(fā)熱、腹痛等消化系統(tǒng)問題，癥狀通常在感染后幾個(gè)小時(shí)到幾天內(nèi)出現(xiàn)，持續(xù)時(shí)間也會有所不同[8-11]。

目前，常用的食品中諾如病毒的檢測方法包括：

⑴ PCR檢測。利用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)，通過檢測食品中諾如病毒的核酸，快速準(zhǔn)確地確定食品是否受到病毒污染。這種方法需要特定的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備和專業(yè)人員進(jìn)行操作，通常用于食品安全監(jiān)測機(jī)構(gòu)或?qū)嶒?yàn)室進(jìn)行檢測。

⑵ ELISA檢測。酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）是一種常用的食品中病毒檢測方法，通過檢測食品中諾如病毒的蛋白質(zhì)，可以快速準(zhǔn)確地確定食品是否受到病毒污染。這種方法相對簡單，可以在一般實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行。

⑶ 快速檢測試紙。市場上也有一些便攜式的快速檢測試紙，可以用于快速檢測食品中的諾如病毒。這種方法操作簡單，但準(zhǔn)確性可能相對較低，通常用于初步篩查或在沒有實(shí)驗(yàn)室設(shè)備的場合。

諾如病毒（Norovirus）是一類常見的RNA病毒，屬于科爾沁病毒科（Caliciviridae）下的諾如病毒屬（Norovirus genus），是引起全球急性胃腸炎的主要致病源，全年均可感染，主要感染兒童、老人和免疫力低下人群[12,13]。諾如病毒主要通過食物和水傳播，特別是生鮮食品、冷凍食品和海鮮等容易受到病毒污染的食品，又被稱作食源性病毒和水源性病毒。食源性病毒和水源性病毒主要通過糞-口途徑傳播，因其傳染性強(qiáng)和傳播速度快等特征，成為嚴(yán)重威脅人民群眾的健康和生命安全的重大因素。在食源性病毒和水源性病毒引起的食品安全事故或突發(fā)公共衛(wèi)生事件中，諾如病毒占據(jù)了重要地位[14,15]。

由于食品品種和水源的種類繁多，成分復(fù)雜，污染的病毒含量低，病毒分布不均一，且含有各種抑制病毒檢測的因子等因素，使得食源性病毒和水源性病毒檢測成為全球公共衛(wèi)生面臨的重點(diǎn)和難點(diǎn)。我國已建立了全國病毒性腹瀉監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)，具備了完整的引起腹瀉病毒病相關(guān)病毒的檢測技術(shù)體系[16-18]。但我國建立食源性病毒和水源性病毒檢測體系起步晚，體系還不完善。目前，我國僅發(fā)布了食品（貝類，生食蔬菜，胡蘿卜、瓜、堅(jiān)果等硬質(zhì)表面食品，草莓、番茄、葡萄等軟質(zhì)水果等食品）中諾如病毒檢測的食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.42—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 諾如病毒檢驗(yàn)》，但是該標(biāo)準(zhǔn)不包括冷鏈?zhǔn)称分兄Z如病毒檢測方法。

目前大部分食源性病毒的暴發(fā)均與冷鏈?zhǔn)称?，如冷凍水產(chǎn)品和冷藏食品等有關(guān)，為了能檢測到冷鏈?zhǔn)称分械蜐舛群头植疾痪牟《玖Ｗ樱枰⒏舆m宜的方法來開展冷鏈?zhǔn)称番F(xiàn)場采樣和提高冷鏈?zhǔn)称分胁《緳z測的靈敏度。

本研究旨在開發(fā)冷鏈?zhǔn)称分兄Z如病毒核酸檢測方法并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室評價(jià)和應(yīng)用，通過建立冷鏈?zhǔn)称分兄Z如病毒檢測方法并形成操作規(guī)范，為我國冷鏈?zhǔn)称分腥缰Z如病毒的檢測、監(jiān)測和應(yīng)對提供可借鑒的標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

熒光PCR檢測系統(tǒng)（ABI 7500）；恒溫?fù)u床；高速冷凍低溫離心機(jī)；均質(zhì)器；小型離心機(jī)；制冰機(jī)；電子天平；生物安全柜；高壓滅菌鍋；-20 ℃低溫冰箱；-80 ℃超低溫冷凍冰箱；純水儀；制冰機(jī)等

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

無水乙醇；氯化鈉；三氯甲烷；聚乙二醇PEG8000；正丁醇；蛋白酶K；DEPC水；磷酸鹽緩沖液；Tris等。

病毒RNA提取試劑盒（QIAGEN）；逆轉(zhuǎn)錄-PCR試劑盒。

諾如病毒陽性質(zhì)控樣品購自中國食品藥品鑒定研究院。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 冷鏈?zhǔn)称窐颖臼占?/p>

本研究從市場中采集了冷鏈水產(chǎn)品如貝類、冷凍帶魚等，共采集冷鏈?zhǔn)称饭?83份。所有樣品采購后送至實(shí)驗(yàn)室，立即進(jìn)行樣本處理。

1.2.2 貝類樣本處理

生物安全柜紫外消毒30 min，準(zhǔn)備無菌的手術(shù)刀片，離心管、培養(yǎng)皿和冰盒等。對于冷鏈?zhǔn)称啡缲愵惖热ぃ谂囵B(yǎng)皿上收集消化腺和腸道組織，并將其置于50 mL離心管中，向組織中加入諾如病毒陽性對照以及過程對照病毒，再將離心管置于冰盒內(nèi)，用均質(zhì)器將樣本研磨打碎成糊狀。將均質(zhì)后的樣品稱取3.0 g轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，加入PBS磷酸鹽緩沖液3 mL，混勻，加30μL的20 mg/mL蛋白酶K消化蛋白質(zhì)，使用恒溫?fù)u床在37 ℃、300 r/min轉(zhuǎn)速下，孵育消化45 min。將離心管65 ℃水浴10 min后，3500 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移到新離心管中。

1.2.3 冷鏈?zhǔn)称分胁《镜姆蛛x

取1 mL經(jīng)前處理后的貝類樣本分別經(jīng)過0.45 μm和0.22 μm孔徑的濾器過濾，以除去細(xì)菌等非病毒物，采用DNA酶消化無病毒衣殼保護(hù)的游離的基因組以降低宿主基因組的干擾。酶解處理后參照Qiagen RNA提取試劑盒說明書提取病毒核酸。

1.2.4 引物與探針的設(shè)計(jì)與合成

本研究依據(jù)常見的諾如病毒GⅠ型和GⅡ型目標(biāo)基因序列設(shè)計(jì)特異性引物和探針，具體引物探針信息見表1。

表1 引物和探針序列

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)參數(shù)

PCR反應(yīng)體系：總體積30 μL，預(yù)混液15 μL，上游與下游引物各2 μL，熒光探針1.0 μL，模板DNA 5.0 μL，無菌水補(bǔ)足PCR反應(yīng)體系體積至30 μL。

使用實(shí)時(shí)熒光PCR儀器對諾如病毒樣本進(jìn)行擴(kuò)增，具體反應(yīng)條件：60 ℃逆轉(zhuǎn)錄3 min；95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性 15 s，57 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 諾如病毒熒光PCR擴(kuò)增結(jié)果（圖1）

圖1 諾如病毒熒光PCR擴(kuò)增結(jié)果圖

2.2 冷鏈?zhǔn)称分兄Z如病毒的檢測情況

為了驗(yàn)證本研究所建立研究方法的適用性與可靠性，掌握冷鏈?zhǔn)称分兄Z如病毒污染情況，本研究共從市場中隨機(jī)抽取了383份冷鏈?zhǔn)称窐悠烽_展檢驗(yàn)工作，其中有27份樣本檢出諾如病毒，總體檢出率為7.0%，具體檢驗(yàn)數(shù)據(jù)見表2。

表2 不同類別冷鏈?zhǔn)称分兄Z如病毒檢測情況

通過分析比較可以看出，冷鮮水產(chǎn)品如牡蠣以及貽貝等諾如病毒檢出率較高，這可能與這些水產(chǎn)貝類腮腺和生殖腺可以富集諾如病毒有關(guān)。

2.3 諾如病毒分型結(jié)果

本研究從冷鏈?zhǔn)称分袡z測到的27株諾如病毒，其中有25份為諾如病毒GⅡ型，2份為諾如病毒GⅠ型。

3 討論

本研究共從市場中抽取383份冷鏈?zhǔn)称窐悠?，主要涉及冷鮮蔬菜，冷鮮水果，冷鮮水產(chǎn)品，速凍水產(chǎn)制品，速凍肉制品等類別，共有27份陽性樣品，總檢出率為7.0%。

目前國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，對于諾如病毒感染者排泄物中諾如病毒檢測主要采取熒光定量PCR方法[19,20]，但對于食品中諾如病毒的檢測報(bào)道不多。由于冷鏈?zhǔn)称坊|(zhì)比較復(fù)雜，干擾因素很多，目前對于冷鏈?zhǔn)称分兄Z如病毒的檢測報(bào)道較少。同時(shí)，我們在樣品加標(biāo)試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，諾如病毒在冷鏈?zhǔn)称分谢厥章瘦^低，有可能會導(dǎo)致假陰性結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)在試驗(yàn)過程中添加諾如病毒陽性質(zhì)控球作為質(zhì)量控制的有效手段，通過反復(fù)優(yōu)化樣本前處理方法，優(yōu)化蛋白酶K的濃度與添加量，添加陰性對照病毒質(zhì)控球作為陰性對照，添加空白對照等控制假陽性或者假陰性結(jié)果，充分保證檢驗(yàn)方法準(zhǔn)確可靠。

在本研究抽樣檢測的冷鏈?zhǔn)称分?，牡蠣、貽貝等冷鮮水產(chǎn)品，草莓等冷鮮水果，速凍扇貝等速凍水產(chǎn)制品中均檢測出諾如病毒。冷鮮水產(chǎn)品中檢出率較高，達(dá)到12.5%，冷鮮水果中檢出率為6.0%，速凍水產(chǎn)制品的檢出率為2.5%，總體檢出率為7.0%，該檢出率水平與國內(nèi)相關(guān)研究報(bào)道相吻合。

本次諾如病毒檢測針對的主要是冷鏈?zhǔn)称?，發(fā)現(xiàn)檢出陽性的樣品主要是以水產(chǎn)品，如貝類等為主，檢出的諾如病毒以GⅡ型為主。貝類食品是造成諾如病毒感染的高風(fēng)險(xiǎn)食品，這和貝類對于近海水域諾如病毒的富集等有關(guān)。對于公眾消費(fèi)者而言，我們應(yīng)該盡量選擇潔凈水域生產(chǎn)的水產(chǎn)品，同時(shí)需要將水產(chǎn)品徹底加工煮熟后再食用，同時(shí)還需要將生熟食品分區(qū)存放，避免交叉污染，保障食品安全。

本研究優(yōu)化了冷鏈?zhǔn)称分兄Z如病毒的富集方法，通過陽性質(zhì)控以及陰性質(zhì)控毒株加標(biāo)的方法建立了冷鏈?zhǔn)称分兄Z如病毒的檢測方法，分析統(tǒng)計(jì)了不同類別冷鏈?zhǔn)称分兄Z如病毒的檢出率和檢測情況，方法可廣泛應(yīng)用于冷鏈?zhǔn)称分兄Z如病毒等相關(guān)病原體的快速篩查檢測與溯源分析。