王明輝，鄭麗婷，李書宜，張育眉，徐暉*

（1.平潭綜合實(shí)驗(yàn)區(qū)質(zhì)量計(jì)量檢測(cè)中心，福建 福州 350400；2.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002）

我國(guó)是貝類生產(chǎn)大國(guó)和養(yǎng)殖大國(guó)，貝類產(chǎn)品養(yǎng)殖已經(jīng)成為沿海海水養(yǎng)殖業(yè)的支柱之一。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)對(duì)貝類食用的安全性愈加關(guān)注，消費(fèi)習(xí)慣的改變和生食觀念的增加導(dǎo)致有關(guān)食品安全問(wèn)題的輿論發(fā)酵[1]，食品安全問(wèn)題為大家所關(guān)注，消費(fèi)者對(duì)于貝類產(chǎn)品的食用安全性提出了更高的要求。

為了預(yù)防和治療動(dòng)物疾病，以及提高動(dòng)物的生產(chǎn)產(chǎn)量和性能，畜牧養(yǎng)殖業(yè)中的養(yǎng)殖戶通常會(huì)在飼料中添加四環(huán)素類或其他類型的抗生素[2]。四環(huán)素類抗生素（TCs）屬于廣譜抗生素，常見的有金霉素（chlortetracycline）、土霉素（oxytetracycline）和多西環(huán)素（doxycycline）等，在治療布魯氏菌病、皮膚痤瘡、急性呼吸道感染等疾病中有廣泛臨床應(yīng)用[3,4]。TCs由于其較穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，在環(huán)境中往往難以降解。畜禽的糞便中含有大量TCs[5]，經(jīng)過(guò)各種途徑污染環(huán)境、植物以及水體，使水體中長(zhǎng)期殘留TCs。水中一些藻類會(huì)受到TCs殘留的污染，并在體內(nèi)積蓄，貝類動(dòng)物以這些藻類為食，進(jìn)而導(dǎo)致在貝類體內(nèi)富集。許多TCs對(duì)身體某些器官的細(xì)胞有毒性，并使人體內(nèi)的多種新陳代謝作用放緩。食品中殘留的TCs可能在一些過(guò)敏個(gè)體中引起過(guò)敏反應(yīng)或毒性反應(yīng)[6]，還有可能引致血液疾病或中樞神經(jīng)系統(tǒng)的不良反應(yīng)[7]。

目前，TCs藥物殘留的儀器檢測(cè)方法有多種，包括高效液相色譜法（HPLC）、高效液相色譜儀-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS）、薄層色譜法（TLC）和毛細(xì)管電泳法（CE）。這些方法在準(zhǔn)確性和精密度方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。

Desmarchelier等人[8]開發(fā)了一種液-液萃取方法，該方法結(jié)合LC-MS/MS來(lái)檢測(cè)食品中的多種抗生素及其異構(gòu)體。使用EDTA和乙腈進(jìn)行液-液萃取。由于低溫相分離情況較好，隨后進(jìn)行冷凍步驟，最終使用正己烷脫脂的樣品萃取物進(jìn)行LC-MS/MS法檢測(cè)。

Shalaby等人[9]開發(fā)了一種利用高效液相色譜二極管陣列檢測(cè)方法（HPLC-DAD），該方法使用C18-E柱進(jìn)行凈化，結(jié)果表明肉和肝的回收率分別為71.88%～92.44%和68.88%～84.84%，可以用于檢測(cè)雞肉和肝臟中四環(huán)素殘留量。

微生物檢測(cè)技術(shù)可以用于檢測(cè)四環(huán)素類抗生素（TCs）的殘留。該方法基于微生物菌落生長(zhǎng)狀態(tài)受TCs藥物影響這一原理，通過(guò)測(cè)定TCs濃度與抑制圈大小之間的正比關(guān)系來(lái)檢測(cè)TCs殘留。這種方法操作簡(jiǎn)便、費(fèi)用低廉且可實(shí)現(xiàn)對(duì)大量樣品進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，缺點(diǎn)是可能受到其他抗生素的干擾，且培養(yǎng)微生物耗時(shí)較長(zhǎng)，專一性和準(zhǔn)確性有提升的空間。

針對(duì)TCs殘留問(wèn)題，陳樹橋等人[10]建立了一種以藤黃微球菌為檢測(cè)菌的微生物檢測(cè)方法，該方法可用于青蝦肌肉組織中的土霉素殘留檢測(cè)。該方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為0.325～12 μg/mL，最低檢測(cè)限為2.0 μg/g，其檢測(cè)結(jié)果能夠與高效液相色譜法得出的結(jié)果呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)性。但面臨樣品制備復(fù)雜、成本高、操作繁瑣等問(wèn)題，不適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)等應(yīng)用需求。

Wambeke等人[11]利用HPLC方法對(duì)雞蛋和肉雞中殘留的土霉素進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)限分別為2.2～13.0 ng/mL和10.5～20.9 ng/mL。

四環(huán)素殘留在環(huán)境中很難被完全降解，貝類的特殊濾食性進(jìn)食方式容易將環(huán)境中的污染物積蓄到體內(nèi)，這最終會(huì)通過(guò)食物鏈威脅到人類的健康，因此需對(duì)四環(huán)素在貝類中的殘留進(jìn)行監(jiān)測(cè)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)提取、凈化等前處理?xiàng)l件及檢測(cè)波長(zhǎng)等進(jìn)行優(yōu)化獲取最佳檢測(cè)條件，通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線、計(jì)算定量限等進(jìn)行方法驗(yàn)證，建立了一種同時(shí)測(cè)定貝類產(chǎn)品中金霉素、多西環(huán)素殘留的SPE結(jié)合HPLC 方法，并應(yīng)用于實(shí)際貝類樣品的檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 主要試驗(yàn)材料

金霉素、多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品（均來(lái)自BePure）；實(shí)驗(yàn)室用水為Milli-Q超純水；甲醇（色譜純，來(lái)自GRACE公司）；乙腈（色譜純，來(lái)自默克公司）。

1.2 主要儀器與設(shè)備

Waters e2695高效液相色譜儀+紫外檢測(cè)器（美國(guó)Waters公司）；氮吹儀（型號(hào)：MG-2200，上海虔鈞科學(xué)儀器有限公司）；均質(zhì)機(jī)（型號(hào)：T25 digital ULTRA-TURRAX，德國(guó)IKA公司）；高速冷凍離心機(jī)（型號(hào)：GL-21M，長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的制備：用甲醇溶液與金霉素、多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品制備濃度為50 μg/mL的金霉素、多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-20 ℃保存。

標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的配制：用甲醇溶液配制成金霉素、多西環(huán)素含量濃度為0.20、0.50、1.0、2.0、5.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 色譜條件

色譜柱（Inertsil ODS-3 C18，4.6 mm×250 mm，5 μm）。流動(dòng)相：甲醇∶乙腈∶草酸溶液（0.02 mol/L）=10∶20∶70（體積比）。流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，柱溫25 ℃。檢測(cè)波長(zhǎng)355 nm。檢測(cè)時(shí)間16 min。

1.3.3 樣品前處理

⑴ 樣品的制備：鮑魚、牡蠣在未完全解凍狀態(tài)下進(jìn)行處理，收集除殼以外的全部軟組織和體液，在常溫下?lián)v碎或剪碎，均質(zhì)后備用。

⑵ 樣品的提?。悍Q取樣品(2.0±0.02)g放入50 mL聚乙烯離心管中，加入70%甲醇溶液16 mL，再加入Na2EDTA-McClvine緩沖溶液4 mL，渦旋混合2 min，在冰水浴中超聲處理10 min后，在4 ℃下以8000 r/min離心10 min。收集上清液，向剩余殘留物中加入70%甲醇溶液8 mL，再加入 Na2EDTAMcClvine緩沖溶液2 mL。重復(fù)上述操作，收集上清液并匯合在一起。

⑶ 樣品的凈化：依次在HLB柱中加入5 mL甲醇、5 mL超純水、70%甲醇溶液3 mL?；罨疕LB柱后將上述的樣品提取溶液上樣，加入5%甲醇水溶液10 mL和10 mL水進(jìn)行淋洗。抽干水后，用6.0 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，并在40 ℃氮吹下濃縮至干，用1.0 mL甲醇溶液再次溶解。使用渦旋機(jī)將溶液在渦流中混合，通過(guò)0.22 μm過(guò)濾膜后測(cè)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品提取液的優(yōu)化

由于四環(huán)素易與金屬離子絡(luò)合形成螯合物且在酸性條件下較為穩(wěn)定[12]，本試驗(yàn)在提取樣品時(shí)加入了pH值為4的Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液，以降低螯合作用提高回收率。在此基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)對(duì)比了70%乙腈（ACN）溶液、70%丙酮（AC）溶液、70%甲醇（MeOH）溶液、0.1%甲酸-乙腈（FA-ACN）溶液4種不同提取溶劑在牡蠣、鮑魚基質(zhì)中對(duì)金霉素、多西環(huán)素回收率的影響，結(jié)果如圖1、圖2所示。試驗(yàn)結(jié)果顯示，在牡蠣基質(zhì)中，與其他3種溶劑相比，70%甲醇（MeOH）溶液回收率最高，在鮑魚基質(zhì)中亦是如此。因此，本試驗(yàn)最終選擇Na 2E DTAMcllvaine+70%甲醇（MeOH）溶液作為樣品中金霉素、多西環(huán)素的萃取溶劑。

圖1 牡蠣基質(zhì)中不同提取溶劑對(duì)CTC、DTC回收率的影響

圖2 鮑魚基質(zhì)中不同提取溶劑對(duì)CTC、DTC回收率的影響

2.2 固相萃取柱的優(yōu)化

海水貝類樣品基質(zhì)復(fù)雜，自身攜帶鹽及較高的Cu2+會(huì)影響檢測(cè)效果，因此需要對(duì)樣品進(jìn)行凈化處理[13]。本試驗(yàn)對(duì)比了C18柱和HLB柱作為固相萃取凈化柱對(duì)鮑魚、牡蠣基質(zhì)中金霉素、多西環(huán)素回收率的影響。從圖3和圖4可知，使用C18柱時(shí)，在牡蠣基質(zhì)中CTC、DTC的回收率分別為73.97%、73.01%，鮑魚基質(zhì)中CTC、DTC的回收率分別為79.55%、80.87%；使用HLB柱時(shí)，在牡蠣基質(zhì)和鮑魚基質(zhì)中CTC、DTC的回收率分別為107.35%、95.74%及108.66%、103.82%。結(jié)果表明，使用HLB柱的回收率明顯優(yōu)于C18柱的回收率，因此，本試驗(yàn)選擇HLB萃取柱對(duì)貝類樣品進(jìn)行凈化。

圖3 牡蠣基質(zhì)中不同萃取柱對(duì)CTC、DTC回收率的影響

圖4 鮑魚基質(zhì)中不同萃取柱對(duì)CTC、DTC回收率的影響

2.3 檢測(cè)條件的選擇

本試驗(yàn)選擇ODS-3 C18柱對(duì)金霉素（CTC）、多西環(huán)素（OTC）進(jìn)行分離，以乙腈、甲醇（比例為2∶1）作為有機(jī)相，0.02 mol/L草酸水溶液作為水相流動(dòng)相，避免金屬離子對(duì)四環(huán)素的螯合作用，從而獲得更好的峰型，用高效液相色譜儀配合紫外檢測(cè)器（分別使用350 nm、355 nm波長(zhǎng)）對(duì)進(jìn)行金霉素、多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)比了不同波長(zhǎng)下CTC、DTC的檢測(cè)效果。結(jié)果顯示，在355 nm處，雜峰較少峰形良好且靈敏度更高，CTC、DTC的洗脫效果、分離效果較好（見圖5）。因此，本試驗(yàn)選擇了甲醇∶乙腈∶0.02 mol/L草酸溶液（10∶20∶70，體積比）為流動(dòng)相，355 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)作為檢測(cè)條件。

圖5 高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)金霉素和多西環(huán)素的色譜圖

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性關(guān)系

采用高效液相色譜法測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，將峰面積（y）與金霉素、多西環(huán)素的質(zhì)量濃度（x）進(jìn)行線性擬合，得到回歸方程及相關(guān)系數(shù)。從圖6和圖7可以看出，金霉素和多西環(huán)素在200～5000 ng/mL的范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，且相關(guān)性良好，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.99，可用于貝類產(chǎn)品中四環(huán)素類抗生素的定量分析。

圖6 金霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖7 多西環(huán)素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 檢出限

按信噪比S/N=3計(jì)算檢出限，如表1所示，檢測(cè)方法對(duì)金霉素、多西環(huán)素的檢出限分別為54.55、14.29 μg/kg，可滿足水產(chǎn)貝類中CTC、DTC殘留的檢測(cè)要求。

表1 所測(cè)樣品中金霉素和多西環(huán)素的殘留量

2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定與分析

采用以上建立的方法對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定和分析，結(jié)果見表2。BG1、BG2、BG3是鮑魚實(shí)際樣品，ML1、ML2、MA是牡蠣實(shí)際樣品。根據(jù)GB 31650—2019，我國(guó)對(duì)四環(huán)素類抗生素的最大殘留量規(guī)定肌肉中最大殘留限量為100 μg/kg，在肝臟、腎臟等組織中稍高，為300 μg/kg和600μg/kg。檢測(cè)結(jié)果表明，在牡蠣樣品中2種四環(huán)素均未檢出，在鮑魚樣品中CTC、DTC均有檢出但未超過(guò)國(guó)家規(guī)定的最大殘留限量。

表2 樣品中金霉素和多西環(huán)素的殘留量

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)優(yōu)化樣品液提取條件、凈化條件、色譜檢測(cè)條件，建立了一種固相萃取結(jié)合高效液相色譜檢測(cè)方法，可同時(shí)檢測(cè)貝類產(chǎn)品中的金霉素和多西環(huán)素的殘留量。采用Na2EDTA-Mcllvaine +70%甲醇（MeOH）溶液提取樣品液，HLB柱作為固相萃取小柱對(duì)樣品液進(jìn)行凈化，并以甲醇∶乙腈∶0.02 mol/L草酸溶液（10∶20∶70，體積比）為流動(dòng)相，355 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)加標(biāo)回收等進(jìn)行方法驗(yàn)證，結(jié)果表明CTC、DTC在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)大于0.99，檢測(cè)方法檢出限分別為54.55 μg/kg、14.29 μg/kg，可滿足水產(chǎn)貝類中CTC、DTC殘留的檢測(cè)要求。