林嘉偉，楊依霏，夏 冰，李 春，盧晨娜，張 亞，劉 婷

中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥研究所，北京 100029

隨著藥品種類的不斷增加，藥源性肝損傷（druginduced liver injury，DILI）發(fā)生率呈逐年增加趨勢，針對DILI 的發(fā)病機制、預(yù)測、預(yù)防和診斷的研究亟待加強。中草藥是亞太地區(qū)（韓國、新加坡）引起DILI最為主要的藥物，已逐漸成為DILI 的主要病因[1]。文獻(xiàn)研究顯示，中藥藥源性肝損傷（herb-induced liver injury，HILI）占臨床全部藥物損傷的2.6%～4.8%，在全部DILI 中的構(gòu)成比約為20%[2]；在韓國，有27.5%的DILI 患者是由于攝取“草藥”導(dǎo)致的[3]。在臨床前和臨床試驗階段，肝毒性問題也已成為藥物研發(fā)失敗及藥物上市后召回的最主要原因之一。而中藥由于成分及代謝產(chǎn)物復(fù)雜多樣，作用機制多元化，藥材、產(chǎn)地、炮制、加工、提取等諸多影響因素導(dǎo)致結(jié)果的不確定性，導(dǎo)致研究風(fēng)險的進一步增加。由于中藥具有成分復(fù)雜、多靶點、多效應(yīng)等特點，在對其進行臨床評價上，有一定的局限性。因此，構(gòu)建敏感可靠的肝毒性評價模型，進行充分的臨床前藥物毒性研究，是減少DILI 發(fā)生的最有效途徑[1]。

以2D 細(xì)胞或動物為標(biāo)準(zhǔn)進行臨床前藥物毒性預(yù)測和評價仍是目前的主流技術(shù)?；谥兴幱行镔|(zhì)濃度低、多靶點、網(wǎng)絡(luò)式整體調(diào)控的特點，使用傳統(tǒng)的體外研究方法（如細(xì)胞2D 培養(yǎng)體系）無法完全滿足現(xiàn)代生命科學(xué)體系下中藥毒性機制研究的需求，而體內(nèi)實驗又存在著種屬的巨大差異和靈敏度較差的問題。故亟需找到一種更為靈敏、準(zhǔn)確、快速、接近體內(nèi)代謝過程，可實時動態(tài)監(jiān)測細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)變化，全面評估藥物作用特點的新模型用于中藥的肝毒性評價。基于微流控芯片技術(shù)研制的器官芯片（organ-on-chip，OOC），可在體外模擬多種活體細(xì)胞、組織器官微環(huán)境，反映人體組織器官的主要結(jié)構(gòu)和功能特征，不僅滿足了中藥長期多次給藥的研究需求，還可實現(xiàn)實時動態(tài)監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)各項藥物毒性相關(guān)指標(biāo)，因此受到廣泛關(guān)注。相較體外2D 細(xì)胞或體內(nèi)動物實驗，3D 體外器官模型的使用，不僅會減少動物的使用，減少倫理問題的發(fā)生，同時還具有穩(wěn)定性和可重復(fù)性的優(yōu)點[4]。美國食品藥品監(jiān)督管理局，首次允許新藥申報資料中以器官芯片模型代替動物模型對藥物進行藥效學(xué)評價，并在此之后批準(zhǔn)該治療“慢性自身免疫性脫髓鞘行神經(jīng)病”的新藥上市[5-6]。

1985 年Smith 等[7]首次使用3D 體外肝臟模型構(gòu)建了藥物毒性實驗，但受到不能及時供應(yīng)大量營養(yǎng)物質(zhì)、肝臟受損后48 h 內(nèi)激活纖維化進程等局限性，該模型僅維持了72 h。隨著科技的發(fā)展，在2008年Vickerman 等[8]把微流控芯片技術(shù)和細(xì)胞相結(jié)合，在體外成功的模擬了血管生成過程中的微環(huán)境。2023 年Vega 等[9]證明將肝切片和微流控芯片技術(shù)相結(jié)合，使精密肝切片可以在體外存活31 d。大大提高了3D 體外肝臟模型存活的時間。本研究構(gòu)建的肝器官芯片是通過震蕩切片機從肝臟中分離出來的組織薄片，精密肝切片保留了肝臟的實質(zhì)細(xì)胞、非實質(zhì)細(xì)胞（星狀細(xì)胞、枯否細(xì)胞等）、小膽管、肝小葉中央靜脈、肝竇周狄氏腔（Disse 腔）等，所有細(xì)胞類型及完整結(jié)構(gòu)，使得其失去代謝能力的速度比一般原代細(xì)胞體外培養(yǎng)要慢，更有利于體外培養(yǎng)和藥物毒性檢測。

雷公藤是衛(wèi)矛科植物雷公藤Tripterygium wilfordiiHook. f.的干燥根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有祛風(fēng)除濕、活血通絡(luò)、消腫止痛、殺蟲解毒的功效。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤具有抗腫瘤、抗炎、免疫抑制等作用，同時也可引起多器官的損害，其中肝毒性是雷公藤報道較多的毒性反應(yīng)之一[10-13]。雷公藤多苷片是從雷公藤有效部位中提取的中藥制劑，是我國首先研究利用的抗炎免疫調(diào)節(jié)天然藥物制劑，有“中草藥激素”之稱，被列為國家基礎(chǔ)藥物中的免疫抑制劑，被世界衛(wèi)生組織認(rèn)定為治療關(guān)節(jié)炎的“中國首創(chuàng)植物新藥”，良好的療效使其在臨床中應(yīng)用廣泛[14-16]。雷公藤及其制劑均可引起DILI，2012 年國家食品藥品監(jiān)督管理總局在第46期藥品不良反應(yīng)信息通報中，特別提出要關(guān)注雷公藤及其制劑的用藥安全[17]。雷公藤及其制劑引發(fā)的肝損傷在臨床上表現(xiàn)相似，患者表現(xiàn)出食欲不振、乏力、惡心、嘔吐、尿黃、皮膚和鞏膜黃染等癥狀，并存在肝臟腫大、有壓痛及血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、總膽紅素（total bilirubin，TBil）升高等臨床表征[18]。

本研究通過使用可明確造成肝損傷的雷公藤醇提物（Tripterygiumwilfordiiextract，TWE）和其制劑雷公藤多苷片提取物（Tripterygium Glycosides Tablet extract，TGE）為工具藥，基于微流控器官芯片系統(tǒng)，通過肝毒性敏感生物標(biāo)志物檢測和病理組織學(xué)觀察，比較了2 種培養(yǎng)載體（精密肝切片、HepaRG 細(xì)胞）在3 種培養(yǎng)體系中（微流控-HepaRG細(xì)胞、靜態(tài)-精密肝切片、微流控-精密肝切片）的差異性，以期為中藥肝毒性評價提供更為靈敏和可靠的新型技術(shù)模型。

1 材料

1.1 動物與細(xì)胞

SPF 級雌性SD 大鼠，體質(zhì)量120 g～180 g，6周齡，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號SCXK（京）2021-0011。動物飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所中藥安全評價中心屏障環(huán)境動物實驗室，實驗設(shè)施許可證號SYXK（京）2020-0042，溫度20～26 ℃，相對濕度40%～70%，人工光照12 h 明暗周期，動物自由飲水進食。本實驗中，對動物實驗的必要性、動物數(shù)量、實驗過程中動物預(yù)期受到的傷害、動物福利等內(nèi)容經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所實驗動物福利倫理委員會審查批準(zhǔn)，批件編號為2022A012、2022A015。

人肝原代細(xì)胞系的終末分化肝細(xì)胞（HepaRG細(xì)胞）、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs），均購自商城北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 藥品與試劑

雷公藤（批號2105001）購自安國市昌達(dá)中藥飲片有限公司，經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所李春研究員鑒定為衛(wèi)矛科植物雷公藤T.wilfordiiHook. f.的干燥根；雷公藤多苷片（批號20230202）購自湖南千金協(xié)力藥業(yè)有限公司；DMEM 培養(yǎng)基（批號8122548）、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，批號16140089）、胰蛋白酶（含EDTA，批號25200072）、磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS，pH 7.4，批號8122302）購自美國Gibco 公司；青霉素-鏈霉素雙抗（批號15070063）購自索萊寶生物科技有限公司；瓊脂糖（批號192235）購自上海百濟神州生物科技有限公司；纖連蛋白（批號MQC2521071）購自美國R&D Systems 公司；ALT試劑盒、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒、谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（gamma glutamyl transferase，GGT）試劑盒、總膽汁酸（total biliary acid，TBA）試劑盒、TBil 試劑盒均購自北京安圖生物工程股份有限公司，批號分別為10713D11、01023C11、10202E11、110810C11、10128A11；CCK-8 試劑盒（批號VE575）購自東仁化學(xué)科技（上海）有限公司；對照品雷公藤內(nèi)酯甲、雷公藤甲素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%，批號分別為 RDD-L06002009017、RDDL00402111018）均購自成都瑞芬思德丹生物科技有限公司。

1.3 儀器

Vibratome1000 Plus 型震蕩切片機（美國Vibratome 公司）；BCM-1000A 型單人超凈臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；HERA Cell CO2培養(yǎng)箱（德國BINDER 公司）；TBA-120FR 型全自動生化檢測儀（日本佳能公司）；SYNERQY Ⅲ型多功能酶標(biāo)儀（美國伯騰儀器有限公司）；Histo-Tek VP1型全封閉組織脫水機（河南中寶醫(yī)療器械銷售有限公司）；Tissue-Tek TEC5 型石蠟包埋機（日本櫻花公司）；HistoCore BIOCUT 型輪轉(zhuǎn)式切片機（德國Leica 公司）；Shandon Varistain Gemini 型全自動染色機（賽默飛世爾科技有限公司）；Olympus BX51型顯微鏡及圖像分析系統(tǒng)（日本奧林巴斯公司）；Mimicup 灌流系統(tǒng)（上海新微科技有限公司）；Waters e2695 型高效液相色譜儀（包括在線脫氣機、四元梯度洗脫泵、自動進樣器、柱溫箱、2695 型溶劑管理系統(tǒng)、2998 型二極管陣列檢測器和Empower 色譜工作站（美國 Waters 公司）；XS105DU 型十萬分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

2 方法

2.1 TWE 的制備

精密稱取雷公藤飲片粉末100.00 g，放置到燒杯，加入1000 mL 95%乙醇，蓋上保鮮膜，放置過夜（約16 h），超聲處理45 min，放冷至室溫，濾過，濾渣用500 mL 95%乙醇潤洗2 遍，合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓回收至無醇味，放置在冰箱中冷藏，用冷凍干燥機凍干成粉。得TWE 粉末5.01 g，藥物得率為5.01%。經(jīng)高效液相色譜檢測分析，TWE（5.01 g）中雷公藤內(nèi)酯甲的質(zhì)量為268.79 mg，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.365%。

2.2 TGE 的制備

20 片雷公藤多苷片稱定質(zhì)量，為1.415 2 g，研細(xì)，置于具塞三角瓶中，加入30 mL 無水乙醇，超聲提取（功率400 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，濾過，濾液回收至干，稱定質(zhì)量，得TGE 121.90 mg，提取率為8.60%。經(jīng)高效液相色譜檢測分析，TGE（121.90 mg）中雷公藤內(nèi)酯甲的質(zhì)量為0.487 8 mg，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.400%；雷公藤甲素的質(zhì)量為0.119 4 mg，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.097 9%。

2.3 CCK-8 細(xì)胞毒性檢測

HepaRG 細(xì)胞以含10% FBS、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞，胰酶消化后進行細(xì)胞計數(shù)，以1×105個/mL 接種于96 孔板，在37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后給藥。TWE 和TGE 用二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）助溶，DMSO 終體積分?jǐn)?shù)為0.5%，以含有0.5% DMSO 的DMEM 培養(yǎng)液為對照組，TWE 組的藥物質(zhì)量濃度梯度設(shè)為0.20、0.39、0.78、1.56、3.12、6.25、12.50 mg/mL（以生藥量計），TGE 組的藥物質(zhì)量濃度梯度設(shè)置為7.81、15.62、31.25、62.50、125.00、250.00、500.00 μg/mL。藥物孵育24 h 后，吸棄上清液，每孔加入CCK-8 溶液110 μL，37 ℃培養(yǎng)箱孵育30 min 后，450 nm 處測定吸光度（A）值，計算藥物對細(xì)胞的抑制率和半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50），并選擇對HepaRG 細(xì)胞無明顯抑制濃度、IC30～40、＞IC50的劑量進行后續(xù)實驗。

2.4 精密肝切片的制備

將SD 大鼠脫頸椎處死，在無菌條件下取出肝臟，用預(yù)冷的DMEM 培養(yǎng)基漂洗3 次后，置于預(yù)先以氧飽和并不斷通入氧氣（95% O2、5% CO2）的DMEM 培養(yǎng)基中。按照文獻(xiàn)方法[19]制備厚度300 μm、直徑6 mm 的精密肝切片。

2.5 靜態(tài)培養(yǎng)體系的構(gòu)建

將上述制備的精密肝切片置于96 孔板中，設(shè)0.5% DMSO 對照組，TWE（0.30、0.60、1.20 mg/mL，以生藥量計）組和TGE（31.25、62.50、125.00 μg/mL）組，分別與精密肝切片共培養(yǎng)，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，用于檢測。

2.6 微流控培養(yǎng)體系的構(gòu)建

芯片為5 層4 通道結(jié)構(gòu)。第1 層為聚碳酸酯（polycarbonate，PC）材質(zhì)的芯片培養(yǎng)小室，第2 層為細(xì)胞培養(yǎng)室底部聚對苯二甲酸乙二醇酯膜（polyethylene terephthalate，PET）的上面，上述2層構(gòu)成整個芯片的上層，用于HepaRG 細(xì)胞/大鼠精密肝切片的培養(yǎng)；第3 層為細(xì)胞培養(yǎng)室PET 膜的底面，用于HUVECs 的培養(yǎng)，第4 層為PC 材質(zhì)的芯片流道板，該流道板上層為芯片培養(yǎng)小室的基座，下層包含豆莢狀流道，為培養(yǎng)液的流動層，上述3、4 層構(gòu)成整個芯片的中層；第5 層為聚甲基丙烯酸甲酯（polymethylmethacrylate，PMMA）材質(zhì)薄膜，構(gòu)成了整個芯片的下層。將芯片流道板與PMMA 薄膜進行緊密封接，上、中層之間不進行封接直接進行各個部件的組裝后，通過灌流管路系統(tǒng)連接微量蠕動泵及控制器，從而構(gòu)成1 個芯片結(jié)構(gòu)（圖1-A）。在無菌條件下將PET 膜底面用100 μL 的10 μg/mL 纖連蛋白預(yù)處理3 h，PBS 沖洗底面，以5×105個/mL 的密度接種HUVECs，接種體積100 μL/孔。12 h 后，翻轉(zhuǎn)扣入已預(yù)先封裝有PMMA 底膜的芯片流道板凹槽中，PET 膜上面以5×105個/mL 的密度，100 μL/孔的接種體積，接種HepaRG 細(xì)胞作為微流控-HepaRG 細(xì)胞培養(yǎng)體系的培養(yǎng)物（圖1-B）或按“2.4”項下方法制備的精密肝切片（圖1-C），連接灌流管路系統(tǒng)，打開微流體控制器調(diào)整微量蠕動泵體積流量為251 μL/min[20]。置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h 后，TWE 組和TGE 組分別以含0.30、0.60、1.20 mg/mL（以生藥量計）和31.25、62.50、125.00 μg/mL 受試物的DMEM 培養(yǎng)液（含0.5% DMSO）為循環(huán)液進行灌流，同時芯片培養(yǎng)小室內(nèi)加入上述含藥培養(yǎng)液150L；對照組的循環(huán)液和皿內(nèi)液均為含0.5% DMSO的DMEM 培養(yǎng)液。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，用于后續(xù)檢測。

2.7 肝損傷標(biāo)志物的檢測

取培養(yǎng)上清，使用全自動生化分析儀對肝細(xì)胞損傷相關(guān)的生物標(biāo)志物ALT、LDH，膽管損傷的生物標(biāo)志物GGT，肝膽排泄功能相關(guān)的生物標(biāo)志物TBil、TBA 進行檢測。

2.8 精密肝切片組織病理學(xué)檢查

將培養(yǎng)后的精密肝切片置于4%中性多聚甲醛中固定7 d，常規(guī)蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色后，利用光學(xué)顯微鏡進行組織病理學(xué)檢查。

2.9 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

取鋪有HUVECs 或HepaRG 細(xì)胞的PET 膜，將有細(xì)胞附著的一側(cè)朝上，浸入4%中性多聚甲醛中固定30 min，隨后吸去固定液，行常規(guī)HE 染色，利用光學(xué)顯微鏡進行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

2.10 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 CCK-8 細(xì)胞毒性檢測的結(jié)果

如圖2 所示，隨著TWE 和TGE 的濃度升高，對HepaRG 細(xì)胞增殖的抑制作用加強，呈劑量相關(guān)性。TWE 0.39 mg/mL 及以下質(zhì)量濃度對HepaRG 細(xì)胞生長無明顯抑制作用，0.78 mg/mL 及以上質(zhì)量濃度則明顯抑制HepaRG 細(xì)胞的生長（P＜0.01），IC50為0.99 mg/mL；TGE 31.25 μg/mL 及以下質(zhì)量濃度對HepaRG 細(xì)胞生長無明顯抑制作用，62.50 μg/mL及以上質(zhì)量濃度則明顯抑制HepaRG 細(xì)胞的生長（P＜0.001），IC50為109.57 μg/mL。根據(jù)以上實驗結(jié)果，后續(xù)實驗中TWE 的質(zhì)量濃度設(shè)定為0.30、0.60、1.20 mg/mL，TGE 的質(zhì)量濃度設(shè)定為31.25、62.50、125.00 μg/mL，均為對細(xì)胞無影響的抑制濃度、IC30～40、＞IC50的濃度。

圖2 HepaRG 細(xì)胞毒性檢測結(jié)果Fig. 2 Results of HepaRG cell cytotoxicity

3.2 TWE 和TGE 對3 種培養(yǎng)體系中培養(yǎng)載體肝損傷標(biāo)志物的影響

3.2.1 2 種培養(yǎng)載體在正常培養(yǎng)條件下的比較 確定在正常培養(yǎng)情況下（不含藥），2 種培養(yǎng)載體之間肝損傷標(biāo)志物的表達(dá)差異性。將2 種精密肝切片培養(yǎng)體系的對照組與微流控-HepaRG 細(xì)胞培養(yǎng)體系的對照組進行比較（表1、2），結(jié)果表明2 種精密肝切片培養(yǎng)體系的ALT、LDH 和TBA 的表達(dá)均明顯高于微流控-HepaRG 細(xì)胞培養(yǎng)體系（P＜0.05、0.01、0.001）；微流控-精密肝切片培養(yǎng)體系GGT 的表達(dá)有高于微流控-HepaRG 細(xì)胞的情況（P＜0.05），靜態(tài)-精密肝切片培養(yǎng)體系GGT 的表達(dá)有低于微流控-HepaRG 細(xì)胞培養(yǎng)體系的情況（P＜0.05）；2 種培養(yǎng)載體TBil 的表達(dá)均未見顯著性差異。

表1 TWE 對不同培養(yǎng)體系肝損傷生物標(biāo)志物的影響Table 1 Effect of TWE on biomarkers of liver injury in different culture systems

表2 TGE 對不同培養(yǎng)體系肝損傷生物標(biāo)志物的影響Table 2 Effect of TGE on biomarkers of liver injury in different culture systems

3.2.2 TWE 和TGE 對3 種培養(yǎng)體系肝損傷標(biāo)志物的影響 根據(jù)雷公藤在臨床造成肝損傷特點，從肝損傷生物標(biāo)志物角度，比較微流控-精密肝切片培養(yǎng)體系、靜態(tài)-精密肝切片培養(yǎng)體系、微流控-HepaRG細(xì)胞培養(yǎng)體系的差異性。

在ALT 的分泌方面，與各自體系中對照組比較，微流控-精密肝切片培養(yǎng)體系中TWE、TGE 的培養(yǎng)上清中ALT 活性呈劑量相關(guān)性升高。其中，TWE 和TGE 高劑量組的升高具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。在靜態(tài)-精密肝切片培養(yǎng)體系中，中劑量的TGE 雖可導(dǎo)致ALT 的顯著升高（P＜0.05），但未見劑量相關(guān)性。微流控-HepaRG 細(xì)胞培養(yǎng)體系與對照組比較未見統(tǒng)計學(xué)意義。

在LDH 的分泌方面，微流控-精密肝切片培養(yǎng)體系中，TWE 的中、高劑量組、TGE 的高劑量組培養(yǎng)上清中LDH 的升高與各自的對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），且呈現(xiàn)出一定的劑量相關(guān)性；微流控-HepaRG 細(xì)胞培養(yǎng)體系中TGE 高劑量組和靜態(tài)-精密肝切片中TGE 中劑量組培養(yǎng)上清的LDH有顯著升高（P＜0.05），但僅在微流控-精密肝切片培養(yǎng)體系中，TWE 和TGE 導(dǎo)致的LDH 的升高表現(xiàn)出一致性且具有一定的量-毒關(guān)系，顯示出微流控-精密肝切片培養(yǎng)體系具有良好的敏感性和準(zhǔn)確性。

在GGT 的分泌方面，微流控-精密肝切片培養(yǎng)體系和微流控-HepaRG 細(xì)胞培養(yǎng)體系表現(xiàn)一致，均呈現(xiàn)劑量相關(guān)性。其中，微流控-精密肝切片培養(yǎng)體系中TWE 和TGE 的高劑量組，微流控-HepaRG 細(xì)胞培養(yǎng)體系中TWE 的高劑量組和TGE 中、高劑量組的GGT 活性與對照組比較均有顯著升高（P＜0.05、0.01、0.001）。而靜態(tài)-精密肝切片培養(yǎng)體系各組與對照組比較未見統(tǒng)計學(xué)差異。

在TBil 和TBA 的分泌方面，與對照組比較，微流控-精密肝切片培養(yǎng)體系中，TWE 和TGE 3 個劑量組TBil 和TBA 均有一定程度的升高。其中TWE 高劑量組的TBil 表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），TWE 和TGE 的低、中、高劑量組與各自對照組比TBA 的分泌雖有升高，但沒有顯著差異。靜態(tài)-精密肝切片培養(yǎng)體系和微流控-HepaRG 細(xì)胞培養(yǎng)體系中TBA 和TBil 未見升高趨勢。

3.3 TWE 和TGE 對3 種培養(yǎng)體系中培養(yǎng)載體形態(tài)學(xué)的影響

3.3.1 TWE 和TGE 對HepaRG 細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響如圖3 所示，在微流控-HepaRG 細(xì)胞培養(yǎng)體系中，對照組及TWE 低、中劑量組和TGE 低、中劑量組的HepaRG 細(xì)胞形態(tài)均未見顯著異常，TWE 高劑量組及TGE 高劑量組HepaRG 細(xì)胞排列稀疏，數(shù)量減少，部分細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，可見染色質(zhì)邊移或細(xì)胞核碎裂現(xiàn)象。

3.3.2 TWE 和TGE 對大鼠精密肝切片組織形態(tài)學(xué)的影響 如圖4 所示，微流控-精密肝切片培養(yǎng)體系中，對照組肝組織結(jié)構(gòu)未見顯著異常，TWE 低劑量組肝組織局灶性肝細(xì)胞輕微腫脹，中、高劑量組可見局灶性至片狀肝細(xì)胞腫脹，核質(zhì)分界不清晰，部分細(xì)胞核消失。在靜態(tài)-精密肝切片培養(yǎng)體系中，對照組肝組織結(jié)構(gòu)未見顯著異常，TWE 低、中、高劑量組均出現(xiàn)局灶性肝細(xì)胞腫脹，局灶性細(xì)胞核溶解、消失。

如圖5 所示，微流控-精密肝切片培養(yǎng)體系中，對照組肝組織結(jié)構(gòu)未見顯著異常，TGE 低劑量組肝竇輕微擴張，中劑量組肝竇輕微擴張，個別肝細(xì)胞核固縮，高劑量組可見局灶性肝細(xì)胞腫脹、肝竇擴張，局灶性肝細(xì)胞核溶解。在靜態(tài)-精密肝切片培養(yǎng)體系中，對照組肝細(xì)胞局灶性腫脹、變性，低劑量組出現(xiàn)片狀肝細(xì)胞壞死、肝細(xì)胞索紊亂、部分肝細(xì)胞腫大，TGE 中、高劑量組均出現(xiàn)片狀肝細(xì)胞核溶解消失、肝細(xì)胞壞死、肝索紊亂、肝竇輕度至中度擴張。綜上，微流控-精密肝切片培養(yǎng)體系中，肝損傷程度與劑量呈現(xiàn)一定的相關(guān)性，而在靜態(tài)-精密肝切片培養(yǎng)體系中未見明顯的量-毒關(guān)系。靜態(tài)-精密肝切片培養(yǎng)體系中TWE 和TGE 對照組的肝組織形態(tài)較微流控-精密肝切片培養(yǎng)體系TWE 和TGE 的對照組有輕微損傷。

圖5 TGE 對大鼠精密肝切片的影響 (HE, ×400)Fig. 5 Effect of TGE on precision-cut liver slice of rats (HE, × 400)

3.4 TWE 和TGE 對微流控培養(yǎng)體系中HUVECs的形態(tài)學(xué)觀察

如圖6 所示，TWE 和TGE 對微流控培養(yǎng)體系中HUVECs 形態(tài)未見明顯影響，細(xì)胞生長呈梭形，排列緊密，細(xì)胞邊緣整齊，分界清楚，核質(zhì)比正常，說明整個仿生培養(yǎng)體系狀態(tài)良好。

4 討論

中藥藥物毒性檢測目前基本仍以傳統(tǒng)2D 體外細(xì)胞模型和動物整體模型為主，新技術(shù)、新方法在中藥毒性評價上的應(yīng)用有很大的提升空間。傳統(tǒng)體外細(xì)胞模型生理結(jié)構(gòu)和細(xì)胞行為與原代細(xì)胞差異較大，且單一細(xì)胞不能完全模仿肝細(xì)胞在體內(nèi)的天然功能[21]。動物整體模型可以很好地模擬藥物在體內(nèi)的代謝過程，研究表明，在使用動物進行藥物肝毒性評價時，其準(zhǔn)確率可達(dá)71%[22]。雖然精確度已經(jīng)很高，但其存在實驗周期長、個體差異性大以及靈敏度不夠等問題，可能耗時耗力的一項研究結(jié)果最終仍會與臨床實際結(jié)果產(chǎn)生偏差。所以在臨床使用時，仍會出現(xiàn)DILI 的情況，而且中藥成分的復(fù)雜性可能會使這種不確定性進一步增加。因此，中藥毒性評價迫切需要更為靈敏、準(zhǔn)確、高效、快速的檢測模型用于中藥毒性評價。

雷公藤及其制劑引發(fā)肝毒性在臨床上多有報道，且在動物實驗中亦經(jīng)多位學(xué)者證實，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)連續(xù)給予大鼠189.00、472.50 mg/kg 的雷公藤多苷3 周，可引起不同程度的肝損傷，其中雷公藤多苷472.50 mg/kg 組肝損傷更為嚴(yán)重，給藥3 周較給藥1 周時肝毒性更顯著，具有一定的劑量-時間-效應(yīng)關(guān)系[23-24]。雷公藤在臨床上引發(fā)的肝損傷，患者多以發(fā)熱乏力、口干口苦、食欲減退、黃疸等癥狀為主，并伴有ALT、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、GGT、TBil、TBA 等肝功能損傷生物標(biāo)志物表達(dá)量的增高[25-26]。在羅瓊等[27]對635 例由雷公藤引起的肝損傷患者進行調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，67.05%的肝損傷患者被診斷為是膽汁淤積型肝損傷。基于雷公藤在臨床引發(fā)的肝損傷特點，在本研究中，選擇對肝細(xì)胞損傷相關(guān)的生物標(biāo)志物ALT、LDH，膽管損傷的生物標(biāo)志物GGT，肝膽排泄功能相關(guān)的生物標(biāo)志物TBil、TBA 進行檢測，以比較TWE 和TGE 誘導(dǎo)的肝損傷在3 種不同培養(yǎng)體系下的表現(xiàn)。

ALT 主要存在于肝細(xì)胞中，ALT 由于具有高敏感度的特點，相較AST 更適合作為DILI 的參考指標(biāo)；LDH 則廣泛存在于多種組織和器官中，是靈敏的非特異性肝損傷指標(biāo)[28-29]。在肝細(xì)胞受到損傷后，2 種酶都會被排出到細(xì)胞外，使得在血液/組織液中的含量增加。3 種培養(yǎng)體系中，TWE 和TGE 與精密肝切片共孵育后，微流控-精密肝切片培養(yǎng)體系的肝損傷標(biāo)記物ALT 和LDH，明顯高于微流控-HepaRG 細(xì)胞培養(yǎng)體系中的表達(dá)量，且在微流控-精密肝切片培養(yǎng)體系中可觀察到呈劑量相關(guān)性升高，在其他2 種培養(yǎng)體系中均未見，說明其更靈敏和準(zhǔn)確。GGT 主要存在于膽管上皮細(xì)胞（也稱為膽細(xì)胞）中，當(dāng)膽管上皮細(xì)胞受損時，血液/組織液中的GGT含量會升高，而HepaRG 細(xì)胞自身對GGT 亦具有高表達(dá)、高分泌的特性[30]。研究顯示，GGT 的增加與ALT 的增加呈正相關(guān)[26]。本實驗證實，基于微流控的2 種培養(yǎng)載體，HepaRG 細(xì)胞和精密肝切片在細(xì)胞受損后，GGT 的表達(dá)量均能表現(xiàn)出劑量相關(guān)性升高，但只在精密肝切片培養(yǎng)體系中表現(xiàn)出與ALT指標(biāo)的一致性；靜態(tài)-精密肝切片培養(yǎng)體系相較微流控體系，GGT 表達(dá)量較低且未見量-毒關(guān)系。說明GGT 是檢測受試物造成的膽管損傷中較為靈敏的指標(biāo)，在實驗中也對膽管損傷的另一生物標(biāo)志物ALP 進行了檢測，但該生物酶在3 種培養(yǎng)體系中的含量均較低，有學(xué)者研究認(rèn)為，在大鼠的膽汁淤積相關(guān)的膽管損傷的判定中，GGT 是比ALP 更具有特異性的指標(biāo)[31-32]。

肝臟是TBil 的主要代謝場所，檢測TBil 水平有助于對肝臟整體功能的評估[33]。TBil 是直接膽紅素和間接膽紅素的總和，衰老的紅細(xì)胞在吞噬細(xì)胞的作用下，分解血紅蛋白產(chǎn)生間接膽紅素，并在肝臟通過葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)生直接膽紅素。除了精密肝切片中肝血竇內(nèi)保留了一定數(shù)量的血細(xì)胞之外，由培養(yǎng)基模擬的血流無法為培養(yǎng)物提供TBil 合成原料，這可能是3 種培養(yǎng)體系中TBil 的含量均較低的原因，這也是體外實驗的局限所在，但3 種體外培養(yǎng)體系中，僅在微流控-精密肝切片培養(yǎng)體系中發(fā)現(xiàn)TBil 隨著TWE 和TGE 濃度的升高而顯示出一定的增加趨勢，而其余2 種培養(yǎng)體系中未見。

膽汁酸是一類膽固醇的代謝物，肝臟是合成膽汁酸的主要場所。任何能引起肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞損害的因素均可導(dǎo)致膽汁酸的積累。HepaRG 細(xì)胞不具有膽汁酸合成能力，在培養(yǎng)體系中含量極低，幾乎不能檢出。2 種精密肝切片培養(yǎng)體系中，TBA 的含量明顯較微流控-HepaRG 細(xì)胞培養(yǎng)體系的含量高出數(shù)倍之多。與微流控-HepaRG 細(xì)胞培養(yǎng)體系對照組的TBA 相比，微流控-精密肝切片培養(yǎng)體系對照組和靜態(tài)-精密肝切片培養(yǎng)體系對照組的TBA 均有顯著性差異。說明膽汁酸合成能力能在2 種精密肝切片培養(yǎng)體系中均有良好體現(xiàn)，其中在微流控-精密肝切片培養(yǎng)體系的TWE 和TGE 高劑量組相較微流控-精密肝切片TWE 和TGE 的對照組，分別升高104.30%和46.00%，但可能較大的數(shù)據(jù)離散度導(dǎo)致統(tǒng)計學(xué)差異的不顯著性。

肝竇內(nèi)皮細(xì)胞在調(diào)節(jié)肝竇血流與周圍肝組織物質(zhì)交換中具有重要作用[34]。在本研究中用到的微流控-精密肝切片、靜態(tài)精密肝切片、微流控-HepaRG細(xì)胞體系中，HUVECs 被鋪于培養(yǎng)小室的一側(cè)仿生肝竇內(nèi)皮屏障。在本研究體系中，仿生肝竇內(nèi)皮屏障的完整性是后續(xù)科學(xué)、準(zhǔn)確地利用微流控肝器官芯片培養(yǎng)體系進行藥物毒性評價的保障。本實驗中經(jīng)TWE 和TGE 的低、中、高劑量灌流培養(yǎng)24 h后，通過HUVECs 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察可知，附著在PET 膜上的HUVECs 細(xì)胞層均保持了較好的細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞輪廓清晰，胞質(zhì)豐滿，質(zhì)、核分界清晰，證明仿生培養(yǎng)體系中肝竇內(nèi)皮屏障完好，可用于微流控肝器官芯片培養(yǎng)體系對TWE和TGE 的肝毒性評價。在此仿生培養(yǎng)條件下，微流控-精密肝切片培養(yǎng)體系的對照組肝組織結(jié)構(gòu)未見顯著異常，中央靜脈、肝竇、肝索結(jié)構(gòu)清晰，未見明顯變性、壞死及炎癥細(xì)胞浸潤，隨著受試物濃度的增加，呈現(xiàn)出損傷程度的逐漸加重，表現(xiàn)出良好的量-毒關(guān)系，而該劑量相關(guān)性關(guān)系在靜態(tài)-精密肝切片培養(yǎng)體系中未見，且靜態(tài)-精密肝切片培養(yǎng)體系的對照組肝組織部分局灶性腫脹、變性。

自1980 年克魯姆迪克首次利用震蕩切片機制備組織薄片以來，精密器官切片由于其保留與體內(nèi)相近的細(xì)胞種類、細(xì)胞3D 組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞與細(xì)胞之間相互作用機制而被認(rèn)為具有替代傳統(tǒng)肝細(xì)胞2D 培養(yǎng)模型的潛力的新模型之一，日漸廣泛的應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究當(dāng)中[35]。上述相關(guān)生物標(biāo)志物檢測結(jié)果證實，3 種培養(yǎng)載體相比較，單一肝細(xì)胞存在表達(dá)量較低，肝臟的部分功能無法復(fù)制等問題，精密肝切片由于保留了肝臟所有類型的細(xì)胞，且具有完整的組織結(jié)構(gòu)，可能更適合從肝臟的生理功能到組織結(jié)構(gòu)損傷的全方位評估。但精密肝切片培養(yǎng)技術(shù)的主要缺點之一是新鮮的肝切片存活時間相對較短，一般在6 h 左右，本研究發(fā)現(xiàn)靜態(tài)培養(yǎng)的肝切片隨著時間的延長，肝細(xì)胞質(zhì)內(nèi)糖原含量減少，細(xì)胞處于明顯的缺氧狀態(tài)，作用緩慢的中藥較難以在該培養(yǎng)體系中表現(xiàn)出毒性；并且相對于2D 細(xì)胞培養(yǎng)，組織切片存在一定厚度，營養(yǎng)液不易均勻到達(dá)細(xì)胞內(nèi)，非藥物成分的物質(zhì)如黏液質(zhì)、植物蛋白等的堆積也很難真實的反映出藥物成分本身的毒性。這種伴隨著廢物不斷堆積、代謝產(chǎn)物不斷產(chǎn)生和營養(yǎng)物質(zhì)不斷消耗的培養(yǎng)體系，勢必影響肝切片的生物學(xué)功能和存活狀態(tài)。微流體控制技術(shù)利用微型泵操控微流體，以多孔膜結(jié)構(gòu)仿生具有高滲透性的血管內(nèi)皮間隙，同時從物理空間上將肝組織、外部血竇樣區(qū)域分離并保留物質(zhì)交換的能力，為培養(yǎng)物提供與體內(nèi)相近的微環(huán)境，包括不斷更新的新鮮培養(yǎng)液，帶走積累的代謝產(chǎn)物，通過調(diào)節(jié)流速提供類似于體內(nèi)血流微環(huán)境的剪切力等，很好地解決了上述組織切片培養(yǎng)中的問題，維持了精密肝切片在體外的活性和靈敏度。

綜合3 種培養(yǎng)體系中TWE 和TGE 的相關(guān)肝損傷生物標(biāo)志物的檢測和組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果認(rèn)為，雷公藤及其制劑所造成的膽汁淤積型肝損傷在微流控-精密肝切片培養(yǎng)體系中有較好的呈現(xiàn)，表現(xiàn)為肝細(xì)胞損傷標(biāo)志物ALT 和LDH、膽管損傷生物標(biāo)志物GGT 的劑量相關(guān)性升高，與膽汁酸合成、排泄相關(guān)的生物標(biāo)志物TBA 的高表達(dá)，組織形態(tài)學(xué)觀察到的具有明確量-毒關(guān)系的肝損傷，以及TWE 和TGE 所造成的肝損傷特點的一致性，相較微流控-HepaRG 細(xì)胞培養(yǎng)體系和靜態(tài)-精密肝切片培養(yǎng)體系具有更高的敏感度和可信度。

本研究所用的肝器官芯片，以HUVECs 和具有黏附蛋白的PET 膜共同形成肝血竇模型，仿生血管與細(xì)胞間隙，利用微流體生物芯片灌注技術(shù)，對大鼠精密肝切片進行動態(tài)培養(yǎng)，能準(zhǔn)確還原藥物對肝臟的損傷特點，從而建立更加接近人體形態(tài)學(xué)的肝模型并能夠在較長時間內(nèi)保持肝臟的特異性功能。但由于倫理等約束，無法直接以正常人的肝臟作為研究材料，但相信在不久的將來，通過微流控精密切片技術(shù)與特定器官人源化的動物相結(jié)合（如人源化小鼠），將克服種屬差異，制備與人體器官相近的檢測體系，相信將成為適合藥物研究的快速、靈敏、準(zhǔn)確的新工具、新方法[36-37]。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突