孟志勇 范玉純 吳 桐 黎韻琪 彭小花 蔣利和, 陳 闖,△

1.廣西中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院 (廣西 南寧, 530000) 2.廣西大學醫(yī)學院 3.右江民族醫(yī)學院 4.廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院

肝細胞癌(HCC)是最常見的惡性腫瘤,是全球癌癥相關死亡的主要原因之一[1]。據(jù)統(tǒng)計,中國每年約有38.3萬人死于肝癌,占全球肝癌死亡人數(shù)的51%[2]。HCC的主要危險因素包括乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒感染、飲酒和非酒精性脂肪性肝病[3]。早期HCC患者首選治愈性治療,包括手術切除(部分肝切除術)或移植,但由于術后復發(fā)率和轉移率較高,HCC患者的預后仍不理想[4,5]。因此,尋找高效的生物標志物及藥物靶點可更好預測治療效果及提高療效。

外切體復合物基因3(EXOSC3)是一種具有3′-5′外核糖核酸酶活性的復合物,該基因編碼人類外泌體的非催化組分,在許多RNA加工和降解活動中發(fā)揮作用[6]。研究表明,EXOSC3的突變在腦橋小腦發(fā)育不全等神經系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用[7]。然而,EXOSC3在HCC中的作用卻鮮有研究。本研究通過生物信息學方法分析EXOSC3在HCC中的表達、預后關系,并探討其調控HCC的潛在機制及與免疫細胞的相關性,以期為HCC的臨床診斷和預后提供新思路。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集 在癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫(TCGA)(https://portal.gdc.cancer.gov/)[8]和國際癌癥基因組聯(lián)盟(ICGC)數(shù)據(jù)庫(https://dcc.icgc.org)中下載HCC患者的基因表達譜及相應的臨床病理數(shù)據(jù)。最終在TCGA數(shù)據(jù)庫中納入374例HCC患者作為訓練隊列,在ICGC數(shù)據(jù)庫中納入了243例HCC患者作為驗證隊列。

TCGA和ICGC向公眾開放,所有數(shù)據(jù)都已同意用于分析,并獲得了道德認可。本研究基于開源數(shù)據(jù),嚴格遵守數(shù)據(jù)庫的發(fā)布指南和訪問策略,不受其他道德規(guī)范的約束。

1.2 EXOSC3在HCC中的差異分析 運用TIMER 2.0(http://timer.cistrome.org/)數(shù)據(jù)庫[9]分析EXOSC3在泛癌中的差異表達。來自TCGA數(shù)據(jù)庫和ICGC數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)分別用作訓練隊列和驗證隊列,R軟件“l(fā)imma”包用于計算差異表達基因(DEG),并通過“ggplot2”包繪制箱式圖進行可視化處理。

1.3 EXOSC3的表達與HCC患者的預后分析 以TCGA數(shù)據(jù)庫作為訓練隊列,ICGC數(shù)據(jù)庫作為驗證隊列,通過Kaplan-Meier 曲線評估EXOSC3對HCC患者總生存期的影響。以EXOSC3表達值的中位值為標準,將HCC患者分為高表達組與低表達組。通過“survival”包對高低表達組的生存差異進行比較,P<0.001為差異有統(tǒng)計學意義。

1.4 EXOSC3的表達與肝癌患者的臨床相關性分析 通過R軟件利用Logistic回歸分析EXOSC3的表達與HCC患者臨床分期的相關性,包括年齡、性別、分級、分期及TNM分期,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

1.5 共表達基因及功能富集分析 運用TCGA數(shù)據(jù)庫,以相關性系數(shù)>0.6,P<0.001為標準,通過R軟件分析EXOSC3在HCC患者中的共表達基因。我們通過“clusterProfiler”包對篩選到的共表達基因進行基因功能本體注釋(GO)、生物進程(BP)和京都基因百科全書(KEGG)通路富集分析,P<0.05,FDR<0.1為差異有統(tǒng)計學意義。

1.6 EXOSC3的表達與腫瘤免疫細胞浸潤的相關性分析 通過TIMER (https://cistrome.shinyapps.io/timer/)數(shù)據(jù)庫分析EXOSC3的表達與6種腫瘤浸潤免疫細胞的相關性。此外,我們通過R軟件使用CIBERSORT[10]進一步分析了在肝癌中EXOSC3的表達與免疫細胞的免疫應答的關系,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

1.7 EXOSC3的表達與免疫檢查點及免疫治療療效的相關性分析 運用TCGA數(shù)據(jù)庫,通過R軟件分析EXOSC3的表達與HCC中免疫檢查點的相關性,P<0.001為差異有統(tǒng)計學意義。利用TCGA數(shù)據(jù)庫中HCC患者免疫治療的相關信息,比較EXOSC3高低表達組患者與免疫表型評分(ips)的相關性,評估EXOSC3的高低表達對免疫檢查點抑制治療的反應,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

1.8 細胞培養(yǎng) 3種HCC細胞株(HepG2,MHCC97H,Huh-7)購自中國科學院上海細胞研究所,人正常肝組織細胞L02受贈于廣西大學吳黎川老師。所有細胞使用伴有10%胎牛血清和1%青鏈霉素混合液的高糖DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng),并放置于含5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中37℃恒溫培養(yǎng)。

1.9 RNA提取和定量實時PCR 根據(jù)試劑說明書進行總RNA提取,并通過Thermo Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit逆轉錄cDNA。所有的定量實時PCR反應通過Roche FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)完成。最終通過2-ΔΔCt方法定量分析相對表達量。引物由生工生物(中國,上海)合成,包括GAPDH(F:5′-GGACCTG-ACCTGCCGTCTAG-3′;R:5′-GTAGCCC-AGGATGCCCTTGA-3′)和EXOSC3(F:5′-CGTTGAGCCTGAAT-GCTAGAG-3′;R:5′-GCT-GAGAGTCCACCCAGTAAA-3′)。

1.10 統(tǒng)計學方法 采用R4.0.4軟件和SPSS 25.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析與繪圖。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 EXOSC3在泛癌中的表達 EXOSC3在大部分腫瘤組織中高表達,尤其在HCC中,EXOSC3的表達顯著升高(圖1)。

圖1 EXOSC3在泛癌中的差異表達

2.2 EXOSC3在HCC組織中的表達 在TCGA隊列和ICGC隊列中,EXOSC3在HCC中的表達量都顯著高于正常組織(圖2A,B)。

此外,通過實時定量PCR驗證EXOSC3在3種肝癌細胞(HepG2,MHCC97H,Huh-7)及人正常肝組織細胞L02中的表達情況。結果顯示,與正常肝細胞L02相比,EXOSC3的表達水平在3種肝癌細胞中均明顯升高(P<0.001,圖2C)。

2.3 EXOSC3的表達與肝癌患者的預后相關性 Kaplan-Meier生存分析顯示,在TCGA訓練隊列中,EXOSC3高表達HCC患者的總生存期(OS)明顯低于低表達患者(P<0.001,圖3A)。在ICGC驗證隊列中,EXOSC3高表達的HCC患者OS明顯低于低表達患者(P=0.03,圖3B)。

圖3 EXOSC3在HCC中的預后價值

2.4 EXOSC3的表達與肝癌患者的臨床相關性 Logistic回歸分析結果表明,EXOSC3的表達與HCC患者的年齡、分級、分期及T分期顯著相關(P<0.05),與患者的性別、N分期及M分期無關(圖4)。

2.5 共表達基因及相關通路分析 運用TCGA數(shù)據(jù)庫通過R軟件分析EXOSC3的共表達基因,最終篩選出差異顯著(r>0.6,P<0.001)的共表達基因166個。為了探究EXOSC3相關的生物進程和通路,我們對篩選的共表達基因進行GO分析和KEGG分析。結果顯示,這些共表達基因主要富集在細胞周期、細胞分裂、mRNA代謝等生物進程(圖5A)。KEGG分析主要富集在細胞周期、RNA轉運、DNA復制、信號通路等(圖5B)。

圖5 基于共表達基因的GO和KEGG富集分析

2.6 EXOSC3與腫瘤細胞免疫浸潤的關系 運用TIMER數(shù)據(jù)庫分析EXOSC3在HCC中與腫瘤純度調節(jié)的免疫細胞浸潤的關系。結果顯示,EXOSC3的表達與B細胞(r=0.379,P=3.54×1013)、CD8+T細胞(r=0.368,P=2.09×10-12)、CD4+T細胞(r=0.279,P=1.45×10-7)、 巨噬細胞(r=0.404,P=8.71×10-15)、 中性粒細胞(r=0.386,P=1.13×10-13)、樹突狀細胞(r=0.449,P=2.71×10-18)具有顯著相關性(圖6A)。此外,我們通過CIBERSORT進一步分析了EXOSC3與免疫細胞的免疫應答的關系。結果顯示,EXOSC3的表達與T細胞CD4記憶激活(r=0.3,P=0.029)、濾泡輔助T細胞(r= 0.28,P=0.048)呈現(xiàn)正相關,而與T細胞CD4記憶休止(r=-0.28,P=0.047)呈負相關(圖6)。結果表明EXOSC3可能通過影響免疫細胞浸潤及免疫應答過程調控HCC的發(fā)生與發(fā)展過程。

圖6 在HCC中EXOSC3與腫瘤細胞免疫浸潤的相關性

2.7 EXOSC3的表達與免疫檢查點及免疫治療療效的相關性 運用TCGA數(shù)據(jù)庫,我們計算了EXOSC3與HCC相關免疫檢查點的相關性得分,以評估EXOSC3與相關免疫檢查點的關系。結果顯示,EXOSC3與CD276的相關性最高(r=0.37,P=1.43×10-13;圖7)。此外,我們通過ips評估了EXOSC3的高低表達與免疫檢查點抑制治療的療效差異。結果顯示,在不接受抗程序性細胞死亡受體(PD-1)與抗CTLA4治療時,EXOSC3低表達組療效優(yōu)于高表達組(P=0.031,圖8A)。然而,無論是單獨抗PD-1或者抗CTLA4治療,亦或者是二者聯(lián)合治療,EXOSC3高低表達組之間療效差異無統(tǒng)計學意義(圖8B-D)。

圖7 在HCC中EXOSC3與免疫檢查點的相關性

圖8 在HCC中EXOSC3的表達與免疫抑制治療的療效差異

3 討論

作為一種預后不良的惡性腫瘤,HCC的發(fā)病機制和預后因素研究具有重要意義[11]。據(jù)報道,EXOSC3的表達與多種癌癥相關,包括胃癌、結腸癌、乳腺癌等[12-14]。然而,EXOSC3與HCC之間的相關性尚不清楚。本研究通過TCGA數(shù)據(jù)庫與ICGC數(shù)據(jù)庫分析并驗證了EXOSC3在HCC中的差異表達與預后價值。結果顯示,EXOSC3高表達與HCC患者的生存預后緊密相關。

共表達基因被廣泛應用于研究基因功能、蛋白質關系和信號通路等[15]。在本研究中,我們通過R軟件篩選出166個與EXOSC3顯著相關的共表達基因進行GO和KEGG富集分析。結果顯示,EXOSC3可能主要通過調節(jié)細胞周期、p53等信號通路調控HCC的發(fā)生發(fā)展進程。

肝臟是新陳代謝、內分泌調節(jié)及免疫監(jiān)視的關鍵樞紐,被認為是免疫耐受的主要部位[16]。近年來,越來越多的證據(jù)揭示了免疫療法對HCC的重要性[17,18]。靶向抑制途徑的單克隆抗體如PD-1/PD-L1和CTLA-4對適應性免疫系統(tǒng)細胞的治療應用,最近已被證明對肝癌可產生有意義的臨床結果[19]。我們的結果表明,EXOSC3可能會通過影響免疫細胞浸潤及免疫應答過程進而調控HCC的發(fā)生發(fā)展過程。

綜上所述,我們明確了EXOSC3在HCC中的高表達及其對HCC患者的預后價值。EXOSC3作為一種全新的預后標志物,其可能通過影響細胞周期、p53等信號通路及免疫細胞免疫應答過程控制TCC的發(fā)展進程。盡管我們的研究提供了多層次的證據(jù)來證實EXOSC3是HCC潛在的預后生物標志物,這項研究仍然有一些局限性,需要進一步的分子生物學實驗及臨床樣本進行驗證。