董 晶 張 遠(yuǎn) 徐振華 時(shí) 楨 國(guó) 濱△ 李金芳 陳自力

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)金沙洲醫(yī)院 (廣東 廣州, 510080) 2.壽光市人民醫(yī)院腫瘤放療科 3.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院

肝癌起病隱匿,發(fā)現(xiàn)時(shí)多為中晚期,治療難度大,患者大多預(yù)后不良。放射治療曾是肝癌非手術(shù)治療的首選,隨著立體定向放射治療的臨床應(yīng)用,肝癌的療效有了進(jìn)一步提高。散結(jié)片是中藥復(fù)方片劑,經(jīng)過(guò)數(shù)年的藥理學(xué)研究及體外、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察,證實(shí)本品對(duì)肝癌細(xì)胞有顯著的殺傷力及抑制作用,并在臨床應(yīng)用中取得了顯著的療效。巨噬細(xì)胞有M1型(殺傷腫瘤)與M2型(促進(jìn)腫瘤)兩種極化類(lèi)型,腫瘤為逃避巨噬細(xì)胞的殺傷作用,可迫使其極化狀態(tài)發(fā)生改變,以促進(jìn)腫瘤發(fā)展。此外,許多類(lèi)型的癌細(xì)胞以糖酵解的方式來(lái)增加葡萄糖攝取,丙酮磷酸激酶(PK)是糖酵解途徑中的限速酶之一,PKM2為腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移提供了優(yōu)勢(shì)[1],并可通過(guò)磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[2]。近年來(lái),中藥聯(lián)合放療對(duì)腫瘤治療的研究逐漸增加,本研究運(yùn)用散結(jié)片聯(lián)合立體定向放射治療肝癌大鼠,觀察聯(lián)合治療對(duì)肝癌大鼠腫瘤組織中PKM2/STAT3信號(hào)通路及巨噬細(xì)胞極化的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 大鼠肝癌RH-35細(xì)胞購(gòu)自上海一研生物公司。健康SD雄性大鼠50只, 6～8周齡,體質(zhì)量220～320 g,購(gòu)自南京協(xié)同生物公司[動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(蘇)2018-0125] ,常規(guī)飼養(yǎng),自由飲食飲水。實(shí)驗(yàn)大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為健康組(健康大鼠正常喂養(yǎng))、肝癌組(肝癌模型大鼠)、散結(jié)片組(模型大鼠+散結(jié)片)、放療組(模型大鼠+定向放療)、聯(lián)合組(模型大鼠+散結(jié)片+定向放療),每組10只。

1.2 藥物與試劑 散結(jié)片(珠海米迪泰克生物公司,國(guó)藥準(zhǔn)字:Z20040106)。TUNEL工作液(蘇州玉衡生物公司),細(xì)胞周期性蛋白(CyclinD1)、細(xì)胞周期性蛋白依賴(lài)激酶(CDK4)引物(武漢淼靈生物公司),PKM2、STAT3、p-STAT3一抗(北京百奧萊博科技公司),M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志蛋白(CD11c)、M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志蛋白(CD206)一抗(深圳海思安生物公司),辣根過(guò)氧化物酶二抗(河北鵬宇生物有限公司),戊巴比妥鈉(臺(tái)州浩博生物公司)。

1.3 模型建立及治療方法 健康組大鼠常規(guī)飼養(yǎng),剩余大鼠接受0.5 ml(2×106個(gè)/ml)RH-35細(xì)胞肝小葉內(nèi)注射,制成肝癌模型大鼠[3]。模型建立成功后,模型組大鼠進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng);放療組大鼠腫瘤直徑>1 cm時(shí)腹腔麻醉后行CT定位,經(jīng)治療計(jì)劃系統(tǒng)進(jìn)行靶區(qū)規(guī)劃及靶點(diǎn)設(shè)計(jì),給予40 Gy劑量1次性照射。散結(jié)片組大鼠給予12.5 g/kg散結(jié)片灌胃,給藥10 d;聯(lián)合組大鼠在定位放療的基礎(chǔ)上給予12.5 g/kg散結(jié)片灌胃,給藥10 d。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1 HE染色觀察肝癌大鼠病理組織形態(tài) 各組大鼠戊巴比妥鈉麻醉后處死,取出肝臟組織,放于組織固定液中固定72 h,其余部分于-80℃保存。10%甲醛固定后乙醇脫水、透明石蠟包埋、常規(guī)切片,然后將石蠟切片進(jìn)行透明水化,并進(jìn)行HE染色,最后以中性樹(shù)膠封片,封片后在偏光顯微鏡下觀察大鼠肝臟組織中的病理改變。

1.4.2 TUNEL檢測(cè)肝癌細(xì)胞凋亡 各組大鼠肝癌組織切片脫蠟,蛋白酶K室溫孵育15～30 min,PBS清洗后加入TUNEL檢測(cè)液(TdT熒光標(biāo)記),室溫避光孵育1 h,PBS沖洗3次。滴加50 μl convertr-POD,室溫避光孵育0.5 h。PBS清洗,DAB液顯色,沖洗,蘇木精復(fù)染,脫水透明,封片。熒光顯微鏡下觀察,計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞。

1.4.3 RT-PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)大鼠肝組織癌細(xì)胞增殖相關(guān)基因CyclinD1、CDK4 mRNA表達(dá)水平 取肝癌組織,剪碎、研磨后加入1 ml Trizol試劑,勻漿機(jī)勻漿8 min左右,加入0.2 ml三氯甲烷搖勻,常溫放置15 min后4℃、12 000 r/min離心15 min,取上清;加入0.5 ml異丙醇混勻,靜置5～10 min,4℃、10 000 r/min離心10 min,棄上清;加入75%乙醇重懸沉淀,4℃、10 000 r/min離心10 min,干燥室干燥5 min,溶解于無(wú)RNA酶的水中。將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行PCR反應(yīng),反應(yīng)條件為:94℃ 5 min,94℃ 30 s、55℃(CDK4退火溫度為56℃)30 s、72℃ 1 min,30個(gè)循環(huán),72℃延伸5 min。引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,紫外透射儀觀察、拍照,并分析目的基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 PCR引物序列

1.4.4 免疫組化檢測(cè)實(shí)驗(yàn)大鼠肝組織CD11c、CD206水平 各組大鼠肝臟組織用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋、切片,經(jīng)脫蠟、水化、封閉、抗原修復(fù)、封閉后,37℃放置30 min,滴加稀釋的CD11c、CD206一抗(1∶200),4℃孵育過(guò)夜。次日依操作順序加入二抗及SABC,室溫DAB顯色,封片后顯微鏡觀察。

1.4.5 免疫印跡檢測(cè)實(shí)驗(yàn)大鼠肝組織PKM2、STAT3、p-STAT3水平 各組大鼠肝癌組織剪碎、過(guò)濾,離心后重懸沉淀,制備細(xì)胞懸液,使用RIPA溶液從細(xì)胞中提取總蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜,5%脫脂牛奶封閉1 h 后,分別加入PKM2、STAT3、p-STAT3一抗(1∶500) 4℃孵育過(guò)夜。TBST洗滌5 min,洗滌3次后加入辣根過(guò)氧化物酶二抗(1∶1 500)室溫孵育1 h。洗膜后加入ECL工作液,獲取圖像并進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量分析。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)大鼠肝組織病理改變情況 健康組大鼠肝細(xì)胞排列有序,形態(tài)正常;肝癌組大鼠肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛,細(xì)胞核大小不一,總體上細(xì)胞生長(zhǎng)分布均勻且緊密,腫瘤組織間隙有大量毛細(xì)血管分布。散結(jié)片組、放療組、聯(lián)合組大鼠腫瘤細(xì)胞有不同程度的空泡,腫瘤組織的排列更為疏松,癌細(xì)胞有所減少。見(jiàn)圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)大鼠肝組織病理改變情況 (HE染色,200×)

2.2 實(shí)驗(yàn)大鼠肝癌細(xì)胞凋亡情況 肝癌組大鼠肝癌細(xì)胞凋亡率顯著低于散結(jié)片組[(35.42±4.22)%,t=23.410,P<0.001],散結(jié)片組大鼠肝癌細(xì)胞凋亡率與放療組較為接近[(36.83±3.71)%,t=0.794,P=0.438],放療組大鼠肝癌細(xì)胞凋亡率低于聯(lián)合組[(48.76±5.93)%,t=5.393,P<0.001]。見(jiàn)圖2。

圖2 實(shí)驗(yàn)大鼠肝癌細(xì)胞凋亡情況 (TUNEL,TdT熒光標(biāo)記, 200×)

2.3 實(shí)驗(yàn)大鼠肝組織CyclinD1、CDK4 mRNA表達(dá)水平 見(jiàn)表2。

表2 實(shí)驗(yàn)大鼠肝組織CyclinD1、CDK4 mRNA表達(dá)水平

2.4 實(shí)驗(yàn)大鼠肝組織CD11c、CD206表達(dá)情況 見(jiàn)圖3、表3。

圖3 實(shí)驗(yàn)大鼠肝組織CD11c、CD206表達(dá)情況 (免疫組化染色,400×)

表3 實(shí)驗(yàn)大鼠肝組織CD11c、CD206表達(dá)情況

2.5 實(shí)驗(yàn)大鼠肝組織PKM2 、STAT3、p-STAT3表達(dá)情況 見(jiàn)表4,圖4。

圖4 實(shí)驗(yàn)大鼠肝組織PKM2 、STAT3、p-STAT3表達(dá)情況

表4 實(shí)驗(yàn)大鼠肝組織PKM2、STAT3、p-STAT3表達(dá)情況

3 討論

近幾年我國(guó)肝癌患者新發(fā)病例中死亡人數(shù)占新發(fā)病例的近4/5[4]。肝癌的病死率較高,威脅患者生命,常見(jiàn)的治療方法為放療,放療會(huì)產(chǎn)生一定的抵抗性,長(zhǎng)時(shí)間使用效果會(huì)減弱,中藥安全性較高,無(wú)毒副作用。因此本文研究散結(jié)片聯(lián)合立體定向放射治療對(duì)肝癌大鼠腫瘤組織中PKM2/STAT3信號(hào)通路及巨噬細(xì)胞極化的影響。

體內(nèi)腫瘤發(fā)生于細(xì)胞增殖和凋亡調(diào)控機(jī)制失調(diào)時(shí),因而細(xì)胞凋亡是機(jī)體維持平衡的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié),因此促進(jìn)肝癌凋亡可以達(dá)到治療效果。廣泛應(yīng)用于臨床的放療及化療均主要通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)揮療效。肝臟對(duì)放療的耐受較低,但癌細(xì)胞需高照射劑量才可殺死,因此,常規(guī)的放療對(duì)肝癌的治療受限。立體定向放療可精準(zhǔn)定位,大劑量集束照射病變區(qū),殺死腫瘤細(xì)胞,并減少其對(duì)周?chē)M織的損傷。但放療存在一定的副作用,影響患者預(yù)后。中西醫(yī)結(jié)合在避免局部復(fù)發(fā)、提高患者生存質(zhì)量方面具有一定的優(yōu)勢(shì)。散結(jié)片可直接作用于肝癌細(xì)胞膜系結(jié)構(gòu),在短時(shí)間內(nèi)造成肝癌細(xì)胞崩潰碎裂,對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷作用較為顯著。散結(jié)片主要包含白附子、白鮮皮、牛黃,具有清熱解毒、活血化瘀、軟堅(jiān)散結(jié)的作用,肝癌主要病機(jī)是氣滯血瘀、濕熱瘀毒、肝腎陰虛。本文通過(guò)TUNEL實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在放療的基礎(chǔ)上聯(lián)合散結(jié)片促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡的效果明顯好于單一治療的效果。此外,聯(lián)合組腫瘤組織的排列更為疏松,癌細(xì)胞有所減少,空泡增加。有研究發(fā)現(xiàn)PKM2可通過(guò)促進(jìn)STAT3磷酸化誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移[5]。STAT3 是 STAT家族成員之一,在各種癌癥中被激活。STAT3被磷酸化后,具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用。在本文中,肝癌大鼠體內(nèi)PKM2、STAT3水平明顯高于正常組,在經(jīng)過(guò)治療后降低,以聯(lián)合組效果最為顯著。鄧秋媛等[6]研究發(fā)現(xiàn),通過(guò)抑制PKM2/STAT3信號(hào)通路水平可抑制肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移并促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。劉晶等[7]提出,抑制STAT3表達(dá)可提高肝癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性,并促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡。另有研究表明,散結(jié)片中的牛黃可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡并抑制增殖[8]。本研究與上述研究結(jié)果相似,聯(lián)合組可能是通過(guò)抑制PKM2/STAT3通路水平,促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。

Cyclins是細(xì)胞周期機(jī)制的核心之一,對(duì)細(xì)胞周期有正調(diào)控作用。CyclinD1與CDK4結(jié)合形成CyclinD1/CDK4復(fù)合物,正向調(diào)控癌細(xì)胞,促使細(xì)胞分裂。當(dāng)處于靜止期G0的細(xì)胞受刺激后首先出現(xiàn)cyclinDl,并同時(shí)誘導(dǎo)CDK4等的表達(dá),結(jié)合成相應(yīng)的CyclinDl/CDK4復(fù)合體,作用于下游蛋白,促使細(xì)胞分裂。Rb是一種抑癌基因,可以通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期G1期的控制點(diǎn)來(lái)抑制細(xì)胞增殖。CyclinDl/CDK4復(fù)合物可以使Rb磷酸化,磷酸化的Rb促進(jìn)DNA轉(zhuǎn)錄,并調(diào)節(jié)DNA的復(fù)制和DNA損傷修復(fù),使細(xì)胞通過(guò)限制點(diǎn)進(jìn)入S期,誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生。在本文中,經(jīng)過(guò)放療及散結(jié)片的治療,Cyclins、CDK4水平降低,且以聯(lián)合組效果更佳。劉波等[9]研究發(fā)現(xiàn),Smad通路通過(guò)抑制CyclinDl、CDK4水平,促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的凋亡并抑制了增殖。Okabe等[10]研究發(fā)現(xiàn),STAT3、CyclinD1呈正相關(guān)關(guān)系,在胸腺上皮質(zhì)瘤中均高表達(dá),降低STAT3后通過(guò)抑制CyclinD1水平,減少癌細(xì)胞增殖。本研究與上述研究結(jié)果相似,放療聯(lián)合散結(jié)片可能是通過(guò)抑制STAT3通路,從而降低CyclinD1水平,調(diào)控細(xì)胞周期,抑制肝癌細(xì)胞增殖。

巨噬細(xì)胞是體內(nèi)重要的免疫細(xì)胞,當(dāng)體內(nèi)產(chǎn)生炎癥反應(yīng)時(shí),其依據(jù)體內(nèi)環(huán)境的變化可分化成不同的細(xì)胞表型,進(jìn)而表達(dá)相應(yīng)的細(xì)胞功能,此過(guò)程稱(chēng)為巨噬細(xì)胞的極化。不同巨噬細(xì)胞表型可通過(guò)特異標(biāo)志物鑒定,目前多將CD11c作為M1型巨噬細(xì)胞極化的標(biāo)志,將CD206作為M2型巨噬細(xì)胞極化的標(biāo)志。M1型巨噬細(xì)胞具有抑制腫瘤增殖和侵襲的作用;M2型巨噬細(xì)胞具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲的作用。本研究結(jié)果顯示,與健康大鼠相比,肝癌大鼠中CD11c水平降低、CD206水平升高,在經(jīng)過(guò)定向放療及散結(jié)片的干預(yù)后,CD11c水平升高、CD206水平降低,且以聯(lián)合組效果更好,提示散結(jié)片聯(lián)合定向放療可有效抑制M2型巨噬細(xì)胞極化,促進(jìn)M1型局勢(shì)細(xì)胞極化。 STAT3是聯(lián)系炎癥與腫瘤的重要因子,STAT3參與腫瘤血管生成、侵襲轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為。在與炎癥相關(guān)的腫瘤中,如結(jié)腸癌及神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤中,M2型巨噬細(xì)胞能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞中STAT3的活化,從而引發(fā)一系列致癌信號(hào)的激活[11,12]。M2型巨噬細(xì)胞分泌大量的細(xì)胞因子,這些因子同時(shí)也是STAT3信號(hào)活化的重要參與者。M2型巨噬細(xì)胞可正向調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞中STAT3水平,肝癌細(xì)胞株中STAT3蛋白磷酸化水平在與M2型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后明顯增高。畢建強(qiáng)等[13]報(bào)道,放療通過(guò)降低STAT3及NF-κB水平,抑制鼻咽癌大鼠瘤體增加,并促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。白鮮皮是散結(jié)片中的一味中藥,吳麗美[14]研究發(fā)現(xiàn),白鮮皮可通過(guò)降低STAT3水平,改善肝纖維化。因此本文推測(cè),散結(jié)片聯(lián)合定向放療抑制了PKM2/STAT3信號(hào)通路,降低了CD206表達(dá),從而抑制細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化,又通過(guò)促進(jìn)CD11c表達(dá),促使巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化,從而起到促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡并抑制增殖的作用。

綜上所述,散結(jié)片聯(lián)合定向放療可能通過(guò)抑制PKM2/STAT3通路,促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1型極化并抑制其M2型極化,促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡并抑制其增殖。