何佳慧 陳佳悅 陳心怡 劉小美△

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 (上海, 201203) 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院

原發(fā)性肝癌是全球高發(fā)病率和致死率的惡性腫瘤之一[1],可分為肝細(xì)胞癌(HCC)、肝內(nèi)膽管癌以及其他罕見類型,其中HCC占病例的75%～85%,是最主要的肝癌類型[2]。在過去幾十年中,HCC臨床治療方面雖取得了一些進(jìn)展,但因肝癌發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性以及對(duì)化療藥物的耐藥性等,使得其診斷和治療以及預(yù)后仍然不能令人滿意。中醫(yī)藥在治療HCC方面具有多途徑、多靶點(diǎn)、多效應(yīng)優(yōu)勢(shì),是HCC綜合治療體系的重要組成部分,深入挖掘臨床治療肝癌的有效中藥,全面探索其發(fā)揮作用的分子機(jī)制,尋找新的治療靶點(diǎn),對(duì)提高HCC的臨床療效顯得尤為重要。黃連-大黃-肉桂復(fù)方(RRC)由黃連、大黃和肉桂(9∶3∶1)組成,具有清熱解毒、活血化瘀之功,我們前期的研究已發(fā)現(xiàn)其對(duì)HCC小鼠的腫瘤生長(zhǎng)和肝癌細(xì)胞增殖均具有明顯抑制作用,其中調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞自噬是其作用機(jī)制之一[3-6]。鑒于HCC發(fā)病的復(fù)雜性、以及中藥作用的多途徑特點(diǎn),本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析和體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證探索RRC治療HCC的復(fù)雜作用機(jī)制,報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

1.1.1 RRC活性成分與相應(yīng)靶標(biāo)的獲取 以“黃連”“大黃”“肉桂”為檢索詞在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)TCMSP(http://tcmsp-e.com/tcmsp.php)中檢索黃連-大黃-肉桂復(fù)方所有活性成分。然后篩選出其中口服生物利用度(OB)≥30%和藥物相似性(DL)≥0.18的活性成分,并進(jìn)一步獲取其對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)(其中因肉桂各成分的DL均未高于0.18,因此其DL設(shè)置為≥0.12)。通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)對(duì)上述獲得的作用靶點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理及靶點(diǎn)蛋白-基因名的轉(zhuǎn)換,以備后續(xù)數(shù)據(jù)處理之用。

1.1.2 HCC相關(guān)基因的檢索與篩選 在人類基因數(shù)據(jù)庫Genecards(https://www.genecards.org/)中,以“hepatocellular carcinoma”為關(guān)鍵詞檢索并下載HCC疾病相關(guān)基因,用于后續(xù)分析。

1.1.3 RRC作用靶點(diǎn)與肝癌相關(guān)基因的交集 以Venny 2.1網(wǎng)上在線工具(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)對(duì)以上檢索得到的RRC活性成分潛在靶點(diǎn)與HCC相關(guān)基因進(jìn)行交集,并制作韋恩圖。

1.1.4 復(fù)方中藥-成分-肝癌靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建與分析 將RRC中三味中藥、各自有效成分以及這些成分靶點(diǎn)與HCC疾病交集的基因,導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件,構(gòu)建復(fù)方中藥-成分-HCC靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.1.5 GO及KEGG通路的富集分析 將復(fù)方各成分靶點(diǎn)與HCC疾病交集的基因?qū)隓AVID 6.8在線工具(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp),限定物種條件為“Homo sapiens”,進(jìn)行基因本體(GO)分類富集分析以及京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析。在P<0.01的情況下,以富集基因數(shù)從多到少進(jìn)行排序,選擇排序靠前的GO分類和KEGG通路,利用微生信在線工具(http://www.bioinformatics.com.cn/)制作可視化圖形。

1.2 體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.2.1 實(shí)驗(yàn)材料 (1)細(xì)胞株:人肝癌HepG2和Huh7細(xì)胞購自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所。(2)實(shí)驗(yàn)藥物:黃連、大黃和肉桂飲片購自上海養(yǎng)和堂張江店,粉碎機(jī)粉碎,按復(fù)方比例混合后置一個(gè)圓底燒瓶中,加入8倍量70%乙醇,浸泡30 min,80℃加熱回流1 h后紗布過濾,往濾渣中再加入8倍量70%乙醇,80℃加熱回流1 h后紗布過濾,合并濾液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收乙醇并濃縮藥物至1 g生藥/ml。臨用時(shí)用培養(yǎng)液稀釋至10 mg/ml后抽濾滅菌,再根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要用培養(yǎng)液配制成不同濃度作用于細(xì)胞。(3)主要試劑:RPMI 1640培養(yǎng)液、胰酶、青霉素-鏈霉素均購于美國(guó)Gibco公司;胎牛血清購于美國(guó)Corning公司;CCK-8試劑盒、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司;TRIzol試劑購自美國(guó)Ambion公司;PrimeScript RT Master Mix試劑盒和SYBR Premix Ex TaqⅡ(Tli RNaseH Plus)購自日本Takara公司。(4)主要儀器:1300系列A2生物安全柜、Steri-Cycle i160 CO2培養(yǎng)箱、NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)、QuantStudio 3實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀,均購自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;ELx800酶標(biāo)儀,購自美國(guó)Bio Tek公司;CytoFLEX流式細(xì)胞儀,購自美國(guó)Beckman公司。

1.2.2 方法 (1)細(xì)胞培養(yǎng):人肝癌HepG2、Huh7細(xì)胞復(fù)蘇后接種于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中,置于37℃恒溫且通入5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(2)CCK-8法測(cè)定細(xì)胞增殖:選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2和Huh7細(xì)胞,胰酶消化后以5×103/孔接種于96孔板中,置于培養(yǎng)箱中過夜。第2天往兩種細(xì)胞各孔中加入不同濃度的RRC藥液,使其終濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mg/ml,每個(gè)濃度做5個(gè)復(fù)孔,同步設(shè)立不用藥的對(duì)照組。分別在藥物作用24 h和48 h后加入CCK-8溶液,孵育1.5 h后測(cè)定570 nm的吸光度(OD值),計(jì)算各組細(xì)胞的存活率,公式:存活率(%)=(OD值實(shí)驗(yàn)-OD值空白)/(OD值對(duì)照-OD值空白)×100%;計(jì)算藥物作用48 h時(shí)對(duì)肝癌細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。(3)Annexin V-FITC測(cè)定細(xì)胞凋亡情況:選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,胰酶消化后按5×105/孔接種于6孔板中,置于培養(yǎng)箱中過夜。第2天按處理因素不同,設(shè)置對(duì)照組和復(fù)方組,每組3個(gè)復(fù)孔,對(duì)照組每孔加入2 ml新鮮培養(yǎng)液,復(fù)方組每孔加入新鮮培養(yǎng)液配制的1.5 mg/ml RRC藥液2 ml。48 h后,按Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書,收集細(xì)胞,以CytoFLEX流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況,以FlowJo V10分析凋亡檢測(cè)數(shù)據(jù)。(4)RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的mRNA表達(dá):細(xì)胞鋪板、分組和用藥同(3)。用藥48 h后吸棄培養(yǎng)液,PBS漂洗后加入0.5 ml/孔TRIzol裂解細(xì)胞,提取細(xì)胞總RNA并測(cè)定濃度,將其中的mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA(37℃ 15 min,85℃ 5 s);實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增cDNA,反應(yīng)條件為95℃ 3 min,95℃ 30 s,60℃ 30 s,40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參,采用2-ΔΔCT法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量,并計(jì)算BCL2/BAX比值。Primer3(v.0.4.0)在線軟件設(shè)計(jì)引物,序列見表1。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 RRC的活性成分和治療HCC的潛在靶點(diǎn)篩選 黃連、大黃和肉桂共檢索到化合物244個(gè),其中符合篩選條件的化合物34個(gè),見表2。篩選出的RRC活性成分中有25個(gè)化合物檢索到作用靶點(diǎn),去重后得到234個(gè)靶點(diǎn),排除其中5個(gè)未在Uniprot數(shù)據(jù)庫找到對(duì)應(yīng)記錄的靶點(diǎn)后,與Genecards中檢索到的7 100個(gè)HCC相關(guān)基因取交集,得到190個(gè)RRC治療HCC的潛在靶點(diǎn)。RRC-成分-HCC靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)見圖1。其中,每個(gè)成分均對(duì)應(yīng)多個(gè)靶點(diǎn),每個(gè)靶點(diǎn)又受多個(gè)成分調(diào)控,其中HL1(quercetin,槲皮素)作用的靶點(diǎn)最多。

圖1 RRC-成分-肝癌靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

表2 RRC中符合篩選條件的化合物

2.2 潛在靶點(diǎn)的GO與KEGG通路富集 根據(jù)P<0.01的篩選條件,GO富集分析得到GO條目共281條,其中細(xì)胞組成(CC)21條、生物過程(BP)209條、分子功能(MF)51條。按富集基因數(shù)量降序排列后,分別選取BP、CC和MF富集基因數(shù)前20、6和12的條目繪制柱狀圖,BP中P值最小的是凋亡信號(hào)通路,以及程序性細(xì)胞死亡正調(diào)控和凋亡信號(hào)通路調(diào)控等與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的條目,見圖2。KEGG通路富集分析顯示富集基因數(shù)最多的通路為癌癥通路,包含與細(xì)胞凋亡、周期等密切相關(guān)的基因,見圖3。

圖2 潛在靶點(diǎn)的GO富集分析結(jié)果

GO和KEGG通路富集結(jié)果均顯示,細(xì)胞凋亡通路可能是RRC治療HCC的主要靶標(biāo),進(jìn)一步反向?qū)ふ野邢虻蛲龅膹?fù)方成分及對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn),發(fā)現(xiàn)中藥成分主要是黃連中的槲皮素(quercetin),大黃中的β-谷甾醇(beta-sitosterol)和蘆薈大黃素(aloe-emodin),其靶向的凋亡分子主要是CASP9、CASP8、CASP3、BCL2、BAX等。

2.3 RRC對(duì)人肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用 與對(duì)照組比較,不同濃度的RRC作用24 h和48 h對(duì)HepG2(圖4A)和Huh7細(xì)胞(圖4B)的增殖具有不同程度的抑制作用,且呈現(xiàn)時(shí)效和量效關(guān)系;相同作用時(shí)間下,同濃度的RRC對(duì)Huh7細(xì)胞的增殖抑制優(yōu)于HepG2細(xì)胞,0.5 mg/ml的RRC作用24 h即可顯著抑制Huh7細(xì)胞的增殖,而1.0 mg/ml作用48 h才可顯著抑制HepG2細(xì)胞增殖。RRC抑制HepG2和Huh7細(xì)胞增殖的IC50分別為2.226 mg/ml和1.395 mg/ml。

2.4 RRC對(duì)人肝癌細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組比較,HepG2和Huh7細(xì)胞經(jīng)RRC作用48 h后,其凋亡細(xì)胞明顯增加(均P<0.001),且藥物對(duì)HepG2細(xì)胞(凋亡約26%)的作用強(qiáng)于Huh7細(xì)胞(凋亡約20%)。見圖5。

2.5 RRC對(duì)人肝癌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響 RRC作用48 h后,HepG2(圖6A)和Huh7(圖6B)細(xì)胞的CASP9、CASP8、CASP3 mRNA表達(dá)均不同程度上調(diào),其中CASP9變化幅度較小,CASP8、CASP3 mRNA表達(dá)上調(diào)比較明顯,但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;另外,用藥后,BCL2/BAX在HepG2細(xì)胞中呈下降趨勢(shì),而在Huh7細(xì)胞中卻顯著上升(P<0.01)。

圖6 RRC對(duì)人肝癌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響與對(duì)照組比較,**P<0.01

3 討論

古典中醫(yī)文獻(xiàn)中并無“肝癌”之病名,據(jù)其肝區(qū)疼痛、進(jìn)行性肝腫大、腹脹等臨床癥狀,可將其歸為中醫(yī)痞氣、臌脹、脅痛、肝積、積聚、癥瘕等范疇。中醫(yī)認(rèn)為,HCC的病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí),患者正氣不足,局部痰、濕、瘀、毒互結(jié)積滯而成腫塊。幾千年來,基于辨證論治理論,中醫(yī)藥在HCC的防治中發(fā)揮著重要的作用,據(jù)報(bào)道,我國(guó)約80%的HCC患者在不同階段不同程度地使用了中醫(yī)藥治療[7],HCC不同階段辨證各有不同,早期多以邪實(shí)為主,根據(jù)邪實(shí)性質(zhì)不同又有疏肝解郁、清熱解毒、活血化瘀等治法[8]。RRC本為課題組前期治療熱盛而陰未傷2型糖尿病的經(jīng)驗(yàn)方(曾用名“糖尿?qū)帯?[9],方中黃連為君,大黃為臣,共用可起到清熱解毒和活血化瘀的作用,方中極少量的肉桂起反佐作用:《四科簡(jiǎn)效方》記載肉桂可與黃連組成交泰丸,可交通心腎,起到安神的作用;另外肉桂性溫,可以佐制大黃、黃連等藥的苦寒?dāng)∥钢?。有文獻(xiàn)報(bào)道黃連有效成分小檗堿、大黃有效成分大黃素,以及肉桂有效成分桂皮醛等均具有抑制肝癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡的作用[10-12],但其均為中藥單一有效成分的研究,未能有效體現(xiàn)中醫(yī)整體調(diào)節(jié)、辨證論治的思想。鑒于此,課題組嘗試探索在中醫(yī)理論指導(dǎo)下組方而成的RRC對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響,體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)其具有較好的抗肝癌效果,機(jī)制研究已發(fā)現(xiàn)其作用與調(diào)節(jié)自噬有關(guān)[3-6]。本文進(jìn)一步利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物分析工具等探索了RRC抗HCC潛在的廣泛作用機(jī)制,發(fā)現(xiàn)其三味中藥各自有多種有效成分,共同靶向HCC的190個(gè)靶點(diǎn),相互作用網(wǎng)絡(luò)圖顯示每個(gè)成分均對(duì)應(yīng)多個(gè)靶點(diǎn),每個(gè)靶點(diǎn)又受多個(gè)成分調(diào)控,即可能靶向復(fù)雜的分子生物網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮抗GCC的作用,其中細(xì)胞凋亡途徑可能是其靶向的重要通路之一。

進(jìn)一步溯源成分-靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)關(guān)系,發(fā)現(xiàn)RRC靶向凋亡途徑的成分主要是來自黃連的槲皮素和來自大黃的β-谷甾醇、蘆薈大黃素,而肉桂中的4個(gè)成分均無作用于凋亡的靶點(diǎn),這與肉桂在RRC中用量極少,未用其抗肝癌作用,僅用其反佐作用是相一致的。已有研究證明,槲皮素、β-谷甾醇、蘆薈大黃素均有抑制肝癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的作用[13-15],但三者兩兩配伍或三者配伍在一起對(duì)HCC的防治作用是否具有協(xié)同作用,尚無文獻(xiàn)報(bào)道,有待進(jìn)一步研究。

眾所周知,死亡受體介導(dǎo)的外源性凋亡途徑和線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡途徑是細(xì)胞凋亡的兩個(gè)進(jìn)化保守的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,其中CASP8是前者的執(zhí)行者,CASP9是后者的執(zhí)行者,而CASP3是兩者最終的凋亡執(zhí)行分子之一;抑凋亡成員BCL2和促凋亡成員BAX則可通過改變線粒體膜上原有孔道或通道調(diào)控內(nèi)源性凋亡途徑,兩者構(gòu)成比例常用以評(píng)價(jià)此類凋亡的程度。本研究體外實(shí)驗(yàn)顯示,RRC能顯著促進(jìn)HepG2和Huh7細(xì)胞的凋亡,且對(duì)前者的作用強(qiáng)于后者。RRC對(duì)兩種細(xì)胞中凋亡分子CASP9、CASP8、CASP3的作用具有一致性,但對(duì)兩者BCL2/BAX比值的影響存在差異,該比值在HepG2中下降,而在Huh7細(xì)胞中上升,提示RRC可不同程度的誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)源性和外源性凋亡的發(fā)生,且以外源性凋亡為主;而在Huh7細(xì)胞,主要是誘導(dǎo)外源性凋亡的發(fā)生,同時(shí)可能還對(duì)細(xì)胞的內(nèi)源性凋亡具有抑制作用。這也可以解釋為什么相同濃度RRC作用下Huh7存活細(xì)胞低于HepG2細(xì)胞,而凋亡細(xì)胞比例卻是Huh7低于HepG2,提示RRC導(dǎo)致Huh7細(xì)胞存活較低的原因,不僅與導(dǎo)致部分細(xì)胞凋亡有關(guān),同時(shí)可能還有其他原因?qū)е缕渌劳黾?xì)胞較HepG2細(xì)胞多,具體將有待進(jìn)一步探索。

綜上,RRC成分復(fù)雜,治療HCC具有多靶點(diǎn)和多通路的作用特點(diǎn),其中凋亡通路可能是其作用的主要途徑之一,發(fā)揮抗凋亡作用的成分可能是其中的槲皮素、β-谷甾醇和蘆薈大黃素,外源性的凋亡途徑可能是其作用的主要靶點(diǎn)。值得注意的是,網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析同時(shí)富集到的凋亡途徑之外的一些分子,可能也是RRC抗HCC的作用靶點(diǎn),后續(xù)值得進(jìn)一步探索。